Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-194007)
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu’à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d’urine, pour étudier l’élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d’environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d’étudier un « organisme entier ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet fait partie d’une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à : – Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d’environ 3 minutes par animal par injection/gavage – Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d’une minute par pesée – Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d’environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection – Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d’une minute par anaimal – Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d’environ 7 minute par animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. – Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. – Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. – Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. – Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. – Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
3. Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d’exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L’ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l’ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.