Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/02/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-194402)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte la rétine, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, la macula, qui est riche en cônes. Le gène impliqué dans cette maladie héréditaire est le gène ABCA4, un transporteur étroitement impliqué dans le recyclage du pigment visuel. Plus de 1200 mutations ont été identifiées dans ce gène mais less mécanisme par lesquels elles impactent la gravité de la maladie ne sont pas connus. Les mécanismes pathogènes ont été étudiés dans une souche de souris dont le gène Abca4 a été invalidé (KO). Néanmoins, ces souris KO ne présentent pas les déficits observés chez les patients atteints de la maladie de Stargardt. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne utilisé dans ce projet, présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’Homme. Nous avons développé un premier modèle de la maladie de Stargardt chez ce modèle en réalisant des injections spécifiques de virus invalidant dans l’oeil , le gène Abca4, ce qui aboutit à l’apparition rapide des symptômes de la maladie dans les yeux infectés. L’invalidation complète du gène est cependant un cas extrême qui est très rare parmi les patients : des mutations ponctuelles sont plus fréquentes, et responsables de toute une gradation dans les symptômes. Afin d’affiner notre modèle, ce projet présente 2 versants : 1, utiliser la même approche que précédemment (infection virale) pour investiguer les conséquences de mutations plus fines, ayant un effet moins drastique sur l’expression du gène. 2, développer un modèle transmissible de mutation du gène Abca4 qui permettrait de contourner la variabilité (qualité, site et étendue de l’injection) inhérente à l’injection oculaire..
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet permettra d’affiner la compréhension du lien structure/fonction dans la protéine ABCA4 et de faire le lien entre mutation et sévérité de l’impact sur la vision, des aspects difficilement accessibles chez l’humain. La production de modèles de la maladie avec mutation germinale, sera à terme un clair gain par sa reproductibilité et la simplicité de son maintien en tant que nouvelle lignée stable, ainsi que sa potentielle utilisation pour évaluer des traitements contre la maladie de Stargardt.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour la sélection des mutations du gène cible pertinentes: deux lots d’animaux recevront avant sevrage une injection dans chaque oeil (durée 10 minute chacune) qui sera réalisée sous anesthésie générale. Ces animaux, placés sous anesthésie générale et analgésie, seront ensuite soumis à 2 fond d’oeil (durée 2minutes) et 4 examens de l’activité électrique de la rétine (ERG) d’une durée d1 heure chacun, entre l’âge de 2 et 16 semaines avec un délai minimum de 4 semaines entre chaque ERG. Pour la mise en place d’un modèle de la maladie par transmission germinale: les femelles vigiles pourront recevoir deux injections d’hormones (durée de 30 secondes chacune) avec un délai de 3jours entre les deux pour réaliser l’étape de superovulation. Certaines femelles seront ensuite accouplées et les femelles fécondées seront soumises à une chirurgie sous anesthésie et analgésie adaptée permettant d’invalider le gene cible dans l’embryon (durée 1h). Après mise bas, les petits issus de ces femelles seront soumis, sous anesthésie gazeuse, à l’injection d’une puce d’identification et à un prélèvement tissulaire pour les caractériser génétiquement (durée 2minutes en tout). Les petits d’intérêt génétique poru le projet seront soumis sous anesthésie générale et analgésie à 3 ERG d’une durée de 1h à partir de l’âge de 4 semaines et avec un délai de 4 semaines entre chaque examen.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’injection oculaire chez les jeunes Psammomys obesus n’engendre en général aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Les virus utilisés dans le projet sont couramment utilisés dans les essais de thérapie génique en raison de la faible réponse immunitaire de l’hôte. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté, ou d’une douleur transitoire. L’ERG est une méthode non invasive utilisée également en clinique humaine, ne provoquant pas de souffrance particulière. Une inflammation voire une opacification de l’œil n’est pas à exclure à cause du contact des électrodes d’ERG avec la cornée, mais le risque est minimisé avec l’utilisation de gel ophtalmique. Les anesthésies répétées pendant les suivis longitudinaux peuvent engendrer du stress La chirurgie peut induire une perte de masse moyenne de 10% maximum dans les 24h après la chirurgie et une douleur modérée, une inflammation ou des agrafes arrachées. On ne peut totalement exclure un risque infectieux. Les injections pour la superovulation : saignement si piqure dans un organe, risque d’inflammation. Electroporation : réduction possible du nombre de petits par résorption foetale ou par mort in utéro des embryons . Identification par injection d’une puce et biopsie d’oreille: douleur légère transitoire. Suite à la chirurgie les femelles seront isolées en cage individuelle pour la durée de la gestation ce qui pourrait induire un stress leger transitoire.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
En fin de procédures, les animaux dont le gène cible a été invalidé dans la rétine seront mis à mort pour analyse histologique et moléculaire de la rétine. Les animaux ne portant pas la mutation attendue dans la rétine seront mis à mort car la technologie de transgénèse utilisée est susceptible de créer des mutations non désirées que nous ne pourront vérifier. Les animaux ne pourront donc plus être considéré comme des animaux naïfs réutilisables dans les projet de l’EU utilisant cette espèce. Les femelles superovulées non fécondées seront mis à mort car elles ne peuvent plus être considérée comem des animaux naifs qui pourraient être réintroduits dans des projets scientifiques de l’EU utilisant cette espèce.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles. Le remplacement est d’autant plus difficile qu’il s’agit ici de mimer une pathologie complexe du système visuel, avec de nombreux degrés de sévérité et d’établir une lignée de rongeur génétiquement modifiée
2. Réduction
Dans la PE1 chaque animal est son propre contrôle : un œil est injecté avec la construction contrôle et l’autre avec la construction induisant la mutation du gène Abca4. Le suivi longitudinal permet de limiter la multiplication des groupes et de renforcer l’analyse des effets des mutations. Ce projet a également pour objectif la mise au point et la validation d’une nouvelle approche de transgénèse sur une nouvelle espèce : le Psammomys obesus. En intégrant la PE2 , étape de mise au point in vitro des conditions de survie et développement des embryons après superovulation, sur la base de l’expertise acquise au Chronobiotron sur le modèle hamster doré, nous estimons notre besoin à 10 expériences intégrant 15 femelles surperovulées accouplées = 150 femelles. Il est à noter que la superovulation permet d’augmenter le nombre d’ovocytes/femelles et donc le nombre d’embryons potentiels après fécondation ce qui conduit à réduire le nombre de femelles utilisées pour obtenir le même nombre d’embryons sans la superovulation. Pour la PE3, I-Gonad : Les paramètres d’électroporation sur cette espèce sont inconnus. Nous aurons à les mettre au point à partir des données publiées sur les rongeurs (rat, souris, hamster…). Nous estimons à 15 femelles/semaine et répétition 10x du protocole sur la durée du projet soit 150 femelles. Puis une fois les conditions établies, en routine : 15 femelles / 4 semaines (durée de gestation = 24-25j) sur 17 semaines/an sur 5 ans = 1275 femelles. Soit au total : 1275 +150 = 1425femellles. Dès validation des paramètres optimaux pourl’électroporation et dès que nous aurons le nombre d’animaux des deux sexes (10 de chaque sexe) suffisant pour lancer une colonie, les expériences seront interrompues. Les N estimés sur la base de l’expertise de l’EU pour les PE2 et PE3 sont des N maximaux. Dès que le résultat scientifique sera atteint la procédure concernée sera interrompue (point limite scientifique). Aucune analyse statistique ne sera réalisée au cours de cette partie du projet. PE4: les petits présentant la mutation attendue seront comparés (fonction visuelle: ERG) à leurs frères et soeurs de génotype sauvage afin de valider l’approche. Les mêmes animaux seront utilisés pour mettre en route des croisements sur animaux sauvages puis génération d’une F2 pour vérifier la transmission germinale de la mutation. Nous estimons à N=20 mâles et 20 femelles pour cette partie.
3. Raffinement
Les animaux jusqu’à l’âge de P15-20 sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales ; et dans un environnement enrichi (matériel de nidification : frisure, bâton à ronger). Après le sevrage les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et l’enrichissement des cages sera maintenu à l’identique. Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P15-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’oeil. Après l’intervention, le dessèchement de l’oeil est limité par l’application d’un gel ophtalmique. Lors de l’ERG les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une anesthésie locale pour l’ERG. De plus, le dessèchement de l’œil est limité par l’application de gel ophtalmique. Les injections pour induire la superovulation seront réalisées en alternant côté droit et gauche de l’abdomen. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale complétée d’une anesthésie locale et d’un traitement pre, per et post-opératoire analgésique adpaté. Après toute procédure invasive un suivi quotidien sera assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d’éventuels signes précoces de mal être. La fréquence de suivi sera adpatée aux gestes réalisés deux fois par jour le jour de l’intervention, puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement . Suite aux Injections pour superovulation et à la chirurgie : suivi 1x/J pendant 7j avec pesée des animaux tous les deux dès le lendemain de la chirurgie. Selon l’évaluation de l’état de santé des animaux lors de ces suivis, des mesures correctives adaptées seront mises en place pour soulager l’animal (soutien prise hydrique, alimentaire, analgésie)et des critères d’arrêt ont été définis
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne. Par comparaison avec la souris, ce rongeur dirune est de plus grande taille et est enrichie en cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’étude des cônes et de leur implication dans la maladie de Stargardt. De plus, la taille de l’œil de cette espèce augmente pour la probabilité de réaliser une injection intra-oculaire de qualité et reproductible en réduisant le risque de nuisances à l’animal. Selon les étapes du projet, nous utiliserons: soit des animaux à des stades postnataux entre P15 et P20 (15-20 jours après la mise-bas, intervalle validé par nos expériences préliminaires : les cônes se différencient plus tardivement que les bâtonnets, la protéine ABCA4 endogène n’est que peu exprimée à cette période et le virus utilisé pour éditer le gène Abca4 a eu la même efficacité). Il est également important de noter que ce stade précoce correspond à l’âge où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans). Pour les procédures intégrant une manipulation des embryons dans l’oviducte, nous utiliserons des femelles adultes sexuellement mâtures soit à partir de 10 semaines.