Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2025-08-28 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-215345)
Une mesure au pied à coulisse deux fois par semaine, sur animal vigile, suit la croissance des tumeurs : 471 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées, dont 258 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de cellules d’ostéosarcome au contact du tibia sous anesthésie gazeuse, et le porteur indique que la tumeur se développe alors chez 100 % des animaux, en envahissant l’os. Il décrit une douleur croissante avec le développement tumoral, traduite par une perte de poids, des mouvements limités et de la prostration. Trois seuils déclenchent la mise à mort immédiate par dislocation cervicale : un score de souffrance de 6, une perte de poids supérieure à 15 %, ou un centimètre d’écart entre la patte injectée et l’autre.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
L’ostéosarcome est un cancer osseux agressif touchant surtout les enfants et adolescents. Le taux de survie à cinq ans n’est que de 60%, il diminue à 20% en cas de métastases et les traitements ne sont donc pas satisfaisants. Dans l’os, les cellules tumorales établissent un environnement favorable au développement tumoral de 2 façons. Elles augmentent la formation d’ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de l’os qui libèrent des molécules favorisant la tumeur. De plus, elles inhibent la réponse immunitaire anti-tumorale. Il a été récemment démontré qu’il existe plusieurs populations d’ostéoclastes, d’origine différente, qui ne sont pas impliqués seulement dans la dégration osseuse mais aussi dans les réponses immunitaires. En particulier, certains ostéoclastes peuvent inhiber ces réponses. Mais la fonction immunitaire des ostéoclastes dans la réponse anti-tumorale reste inconnue. Notre objectif est de caractériser la contribution des ostéoclastes au blocage de la réponse anti-tumorale et de définir l’origine des ostéoclastes associés à l’ostéosarcome afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblées sur les ostéoclastes néfastes pour la réponse anti-tumorale. Nous utiliserons un modèle d’ostéosarcome induit chez la souris normale par injection de cellules d’ostéosarcome en site péri-osseux (tibia). Dans ce modèle, la tumeur se développe chez 100% des animaux injectés et envahie l’os en augmentant la formation d’ostéoclastes. Ces ostéoclastes seront étudiés pour comprendre leur fonction immunitaire. Pour identifier leur origine, nous utiliserons 1 lignée de souris génétiquement modifiées chez lesquelles les cellules à l’origine des ostéoclastes sont identifiables grâce à l’expression de marqueurs fluorescents et dans lesquelles nous induiront un ostéosarcome comme décrit ci-dessus. Nos résultats permettront de comprendre le rôle des ostéoclastes dans la réponse anti-tumorale et d’identifier les facteurs impliqués qui pourront être ciblés spécifiquement pour bloquer les ostéoclastes protumoraux ou les cellules dont ils sont isses afin de prévenir ou limiter le développement tumoral. Ils auront des retombées pour d’autres types de tumeurs et de métastases se développant dans l’os dans lesquelles les ostéoclastes jouent également un rôle important.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Le dialogue établi entre les cellules cancéreuses et les ostéoclastes est considéré comme un point majeur dans la progression tumorale, mais le rôle immunitaire des ostéoclastes n’a jamais été étudié dans ce contexte. Ce projet permettra de caractériser et de comprendre comment les différents types d’ostéoclastes évoluent et contribuent à la réponse immunitaire dans l’ostéosarcome. Ces aspects sont très peu étudiés dans la littérature. Le projet est donc original et apportera de nouvelles connaissances sur la biologie des ostéoclastes et l’environnement immunitaire des ostéosarcomes. Les mécanismes et processus identifiés pourront à terme permettre d’améliorer les traitements en ciblant les ostéoclastes néfastes sans affecter ceux nécessaires au remodelage osseux physiologique. Ils pourront avoir des conséquences plus larges pour d’autres contextes pathologiques qui présentent des caractéristiques similaires de formation augmentée d’ostéoclastes, par exemple les métastases osseuses de tumeurs répandues (cancer du sein, de la prostate, du poumon…) ou le myélome multiple.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Tous les animaux recevront: – 1 injection de cellules cancéreuses ou de PBS (pendant quelques secondes), 1 seule fois pour induire la tumeur. Cela concerne tous les animaux. – 1 injection d’antalgique au moment de l’induction tumorale (quelques secondes). Cela concerne tous les animaux. – 1 prélèvement sanguin à la veine mandibulaire (2 minutes) au moment de la mise à mort. Cela concerne 416 animaux. – 1 anesthésie par inhalation d’isoflurane. Cela concerne tous les animaux. – Les volumes tumoraux seront suivis manuellement à l’aide d’un pied à coulisse deux fois par semaine sur animal vigile (durée de la manipulation : 2 minutes/animal). Cela concerne tous les animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Toutes les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotype dommageable (viabilité, poids, comportement et reproduction normaux). Elles sont entretenues à l’état homozygote donc sans nécessité de génotypage. L’injection de cellules en intra-musculaire peut générer une douleur très transitoire. Le développement tumoral peut entrainer avec le temps de la douleur qui se traduit par une perte de poids, des mouvements limités, une prostration
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux dans chacune des procédures seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes pour l’analyse du phénotype et de la fonction des ostéoclastes et de leurs progéniteurs, ainsi que pour la mise en culture de cellules primaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
L’existence de plusieurs populations d’ostéoclastes n’a été mise en évidence que très récemment et les rares lignées de cellules disponibles pour étudier les ostéoclastes ne reproduisent pas leur diversité et ne permettent pas d’analyser leur interaction avec leur environnement. Elles ne reproduisent pas non plus le phénotype des ostéoclastes pathologiques. De plus, étant donné la complexité des mécanismes impliqués et du microenvironnement tumoral, aborder ce problème seulement par des analyses in vitro n’est pas suffisant et le recours à des modèles animaux est lui aussi indispensable. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Cependant, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer ces modèles in vitro en les modifiant génétiquement grâce aux marqueurs et autres caractéristiques que nous identifierons pour qu’ils reproduisent les différentes populations d’ostéoclastes en cancer. Si cela est possible, cela permettrait à terme de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de ces cellules en condition normale et pathologique.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du nombre de cellules nécessaire aux différentes analyses et d’une évaluation statistique, en tenant compte de pertes éventuelles afin de ne pas avoir à répéter inutilement les procédures et avec le nombre de souris minimum par groupe. Pour l’évaluation statistique, nous avons utilisé le test G*power qui permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires en fonction des différences attendues sur la base de nos expériences antérieures et des résultats de la littérature. La procédure 1 nous permettra de définir les conditions expérimentales optimales (nombre de cellules injectées et cinétique) pour nos analyses. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux dans les procédures suivantes en ne conservant que les groupes les plus appropriés. Chaque animal inclus dans l’analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l’analyse simultanée d’un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d’animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d’animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Une attention particulière sera portée au suivi des signes de souffrance des animaux. L’injection intramusculaire de cellules tumorale sera faite sous anesthésie gazeuse courte (quelques minutes). Pour réduire la souffrance des animaux pendant le développement tumoral, une grille de score (en annexe) a été établie pour le suivi des animaux avec des critères bien définis pour détecter tout signe de souffrance et des points limites bien définis. Un antalgique sera administré si les animaux présentent des signes de souffrance. Si ces signes ne disparaissent pas, comme indiqué dans la grille de score, ils seront mis à mort par dislocation cervicale. Si le score atteint la limite de 6 (point limite) les animaux seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale. Les animaux seront pesés toutes les semaines après l’injection des cellules tumorales. Si une diminution du poids est observée (>15%) ils seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite). Le volume des tumeurs induites sera contrôlé à l’aide d’un pied à coulisse sur animaux vigiles. Le diamètre le plus grand de la patte injectée sera comparé à celui de la même région de la patte non injectée. Dès que la différence entre les 2 pattes atteint 1cm (correspondant à un volume tumoral d’1cm3), les souris seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Les données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons et nos résultats précédents ont été obtenus chez la souris. Nous allons travailler par analogie avec ces résultats dans la continuité de nos travaux antérieurs sur les ostéoclastes. De plus, les cellules tumorales que nous utilisons sont des cellules de souris. Enfin, les modèles déjà existants pour tracer l’origine des ostéoclastes sont tous uniquement des modèles murins. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des souris au stade jeunes adultes (6-8 semaines) afin de mimer au mieux les tumeurs chez les patients (adolescent et jeune adulte).