THYROCRISP: Création et caractérisation de lignées génétiquement modifiées pour étudier les effets d’une hypothyroïdie ou d’une hyperthyroïdie médiées par invalidation de gènes clés de l’axe thyroïdien lors du développement embryonnaire

Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent de nombreux processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de la signalisation de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie des êtres vivants et constituent des problèmes majeurs de santé publique et santé environnementale. Ainsi, l’étude des gènes contrôlés par les HTs est essentiel pour comprendre les mécanismes liés à cette signalisation. La complexité du système hormonal lié à la thyroïde ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de contrôles de la régulation de cet axe et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux. A l’heure actuelle, aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Le xénope dont la métamorphose est dépendante d’un pic en hormones thyroïdiennes identique à celles des autres vertébrés dont l’Homme, est un amphibien couramment utilisé comme modèle pour étudier l’axe thyroïdien et les perturbations de cet axe. Pour étudier le rôle de ces HTs, nous avons donc choisi le xénope comme modèle et des stades d’études (embryo/larvaire) qui permettent de satisfaire au mieux la règle des 3R. Notre projet a pour objectif la création de 5 lignées génétiquement modifiées chez le xénope, où l’inactivation d’un gène clé de la signalisation HTs dans chaque lignée, entraine soit une hyperthyroïdie soit une hypothyroïdie chez les animaux portant la mutation. La caractérisation de ces 5 lignées nous permettra de mieux comprendre les conséquences d’une déficience ou d’un excès en HTs sur le développement des animaux, en s’interressant plus particulièrement au développement du cerveau.

Le but du projet est de pouvoir développer des modèles hypothyroïdiens et hyperthyroïdiens avec l’invalidation de 5 gènes sélectionnés pour leur rôle essentiel dans la signalisation thyroïdienne. Les hormones thyroidiennes (HTs) sont conservées parmi tous les vertébrés. Les HTs jouent un rôle clé dans les transitions des cycles de vie de ces vertébrés et notamment la métamorphose des amphibiens. Les retombées de ce projet seront, au niveau scientifique, de mieux comprendre les mécanismes d’action des HTs en étudiant les fonctions des protéines invalidées (stratégie de perte de fonction). Ce projet permettra en outre, d’établir des points de comparaison entre les modifications de l’expression des gènes observées suite à l’invalidation des 5 gènes clés de l’axe thyroïdien avec celles qui ont pu être observées suite à une exposition à des produits chimiques susceptibles de perturber la signalisation par les HTs. D’un point de vue applicatif, nous pourrons tester des stratégies profilaxiques afin de traiter les patients atteints de telles mutations, mais aussi analyser les comportements associés à la perte de fonction de ces gènes et faire des comparaisons avec ce qui est observé en écotoxicologie sur certaines espèces.

Afin d’obtenir des œufs, les femelles adultes sont induites à pondre par injections en sous-cutané dans les sacs lymphatiques dorsaux avec de l’hormone chorionogonadotropine humaine. Elles sont capturées avec une épuisette (propre et désinfectée) dans laquelle ils sont maintenus manuellement sans pression, pour éviter qu’elles ne s’échappent pendant l’injection. Une pression légère sur le point d’injection est faite pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Dans le but d’identifier les animaux portant la mutation du gène ciblé pour chaque lignée, un prélèvement de mucus sur les têtards anesthésiés est fait de façon non invasive, à l’aide d’un écouvillon frotté délicatement sur la peau de chaque animal. La durée du prélèvement est d’environ 15 secondes par animal et ne sera effectué qu’une seule fois sur les animaux à génotyper. Un test de mobilité consistant à suivre le mouvement de chaque têtard pendant 10 minutes avec une alternance de périodes lumière/obscurité sera fait pour les animaux de chacune des 5 lignées afin de contrôler si la mutation affecte ou non cette mobilité.

Pour les 5 gènes choisis, l’invalidation des différents gènes ciblés devrait conduire soit à une baisse des HTs circulantes entrainant une hypothyroïdie générale de l’animal, soit au contraire à une augmentation des HTs circulantes entrainant une hyperthroïdie de l’animal. Pour les invalidations de gènes qui sont succeptibles d’induire des hypothyroïdies, nous anticipons la possibilité pour les têtards de développer une hypertrophie de la glande thyroïde (goitre).

Procédure 1 : Induction de la ponte des femelles xénope (18 femelles de type sauvage dites Wild Type) et récolte des œufs. Toutes les femelles sont gardées et pourront être impliquées dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 2 : Création et élevage des animaux de chaque lignée où chacun des 5 gènes ciblés a été inactivé. Dans un 1er temps les 325 animaux impliqués dans cette procédure (soit 50 par lignée donc 250, et 75 animaux contrôles) seront élevés jusqu’au stade têtard pour être génotypés afin d’identifier et de conserver les animaux où le gène ciblé est bien inactivé, lesanimaux partiellement ou non invalidés ne seront pas conservés. Ensuite seuls les animaux pleinement invalidés sont élevés jusqu’au stade adulte où 2 couples d’animaux par lignée (soit 2×5 femelles et 2×5 mâles) seront conservés pour établir les 5 lignées qui serviront à produire les animaux portant chacune des mutations voulues. Tous les adultes des 5 lignées sont gardés et pourront être impliqués dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 3 : Analyse moléculaire et comportementale des 5 lignées. La mobilité des animaux mutants pour chacune des 5 lignées sera étudiée. Cela comprendra l’analyse de 540 têtards pour le comportement de nage (90 animaux x 5 lignées + 1 lignée contrôle) au stade NF48 (15 jours post fécondation). Puis sur les 540 têtards, seuls 90 têtards (15 têtards par groupe) seront conservés afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation et ils seront élevés jusqu’au stade NF55 (33 jours post fécondation) pour prélever différents tissus destinés à être analysés.

Le xénope (Xenopus laevis) est un modèle reconnu pour l’étude du système hormonal lié à la thyroïde. En effet la métamorphose est entièrement dépendante d’un pic en Hormone thyroïdienne. Ce pic a lieu à la naissance chez les humains (et la plupart des vertébrés) et permet la maturation du système nerveux. Cette espèce, comme tous les vertébrés, possède les mêmes hormones que les Hommes. Elle offre l’avantage 1) de ne pas être un mammifère et d’avoir un développement externe qui permet un traitement avec des différentes molécules par balnéation et non par gavage ou par injection, 2) d’être un vertébré tétrapode (à la différence des poissons) et d’être évolutivement relativement proche de l’Homme. De plus, son développement rapide, le grand nombre d’embryons synchronisés obtenus par fécondation in vitro, la transparence des embryons, les possibilités de transgénèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les femelles adultes de type sauvage permettront d’assurer la production des œufs qui serviront à créer les 5 lignées génétiquement modifiées présentant chacune l’inactivation d’un gène clé de la signalisation thyroïdienne. Pour établir les 5 lignées, les têtards seront élevés jusqu’au stade adulte pour sélectionner 20 adultes, soit 10 mâles et 10 femelles matures sexuellement correspondant à 2 couples par lignée créée. Pour caractériser les 5 lignées, les couples permettront d’assurer les reproductions, puis les tests de mobilité (comportement de nage) seront pratiqués sur les têtards issus de ces reproductions au stade NF48 (15 jours post fécondation) et les tissus seront prélevés pour analyse au stade NF55 (33 jours post fécondation).