Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-163696)
910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une irradiation, des injections, des prélèvements de sang hebdomadaires, des prélèvements de moelle osseuse et, pour certaines, une plaie provoquée par brûlure, afin de tester des cibles contre une leucémie agressive, dont des sécrétions de la grenouille utilisée dans le rituel du kambo. Le porteur prévoit la mise à mort quand les cellules leucémiques atteignent 80 % du sang ou dès l’apparition de signes de souffrance. Il affirme que le développement de la leucémie exige un « micro-environnement médullaire » impossible à reproduire in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le projet vise à identifier des nouvelles thérapies pour le traitement de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), un cancer agressif des cellules du sang. Ce projet se base sur deux hypothèses. Selon la première hypothèse, la protéine ACLY, impliquée dans le cycle de synthèse des acides gras, jouerait en rôle clef dans le développement de la leucémie. Elle constituerait donc une importante cible thérapeutique. Cette hypothèse sera adressée en vérifiant si la leucémie disparaît après avoir invalidé la protéine ACLY. Selon la deuxième hypothèse, les protéines contenues dans les sécrétions de la grenouille tropicale Phyllomedusa bicolor (utilisées dans le rituel du kambo) pourraient être utilisées comme approche thérapeutique dans les LAM. Cette hypothèse se base sur observations cliniques, car un patient atteint de LAM a été guéri après avoir fait le rituel du kambo. Ces hypothèses seront abordées grâce à trois lignées différentes de souris: – Des souris qui développent une leucémie similaire à celle développée par les patients atteints de LAM – Des souris qui permettent d’invalider la protéine ACLY dans les leucémies – Des souris qui permettent la survie et l’expansion des cellules leucémiques de patients, cellules qui sont trop fragiles pour être maintenues in vitro, pour y mener des tests thérapeutiques
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
1. Bénéfices à court terme: ce projet fera progresser le connaissance scientifique car il permet d’identifier de nouveaux mécanismes qui expliquent pourquoi et comment la leucémie aiguë myéloïde survient et se développe. La connaissance de ces mécanismes sera utile non seulement pour comprendre les mécanismes de leucémogenèse mais aussi potentiellement pour d’autres cancers du sang et/ou des cancers solides. 2. Bénéfices à long terme: grâce à ce projet nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer le pronostic de leucémie aiguë myéloïdes, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger donc la vie des patients atteints de LAM.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
P1 – analyse de la leucémie après invalidation de la protéine ACLY: exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 168) Injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5, prélèvements sanguins hebdomadaires (ponction veineuse submandibulaire sur souris vigile avec une lancette), effectués pour 24 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline. P2 – analyse de la progression de la leucémie après invalidation d’ACLY dans des cohortes des souris receveuses: une injection intra-péritonéale d’anesthétique une irradiation sub-létale (durée d’une minute) tout de suite après l’anesthésie 6 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse des cellules leucémiques murines Prélèvements sanguins hebdomadaires, effectués pour 36 semaines à partir de 7 jours après l’injection des cellules leucémiques. P3 – analyse de l’invalidation d’ACLY sur la survie des cellules saines de la moelle osseuse: injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5. P4 -effet de l’application des sécrétions de grenouille sur le dévelopement de la leucémie. exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 198) prélèvements sanguin hebdomadaires, effectués pour 28 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline une injection intra-péritonéale de l’anesthétique quand la leucémie apparaît dans le sang (à patrir de la semaine 8) Injection intra-péritonéale de l’analgésique, tout de suite après l’anesthésie 30 minutes après analgésie, induction d’une plaie par brûlure par application pendant 1 seconde d’une tige de laiton de 2mm de diamètre chauffée à 100°C sur la peau du dos de la souris. une application cutanée des peptides bioactifs sur plaies cutanées, faite tout de suite après l’induction de la plaie par brûlure. 8h et 16h après la brulure, injection intra-péritonéale de l’analgésique. P5 – greffe des cellules leucémiques des patients, injection intra-péritonéale de busulfan 24 h après, injection intraveineuse des cellules leucémique humaines, prélèvements sanguin hebdomadaires sur souris vigiles, effectués pour 52 semaines à partir de 15 jours après les injections des cellules leucémiques, prélèvement de la moelle osseuse sur souris anesthésiée (4 prélèvements totaux qui se font en alternant les pattes avec une fréquence de 3 semaines entre les prélèvements
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
1. Effets indésirables directement liées aux actes expérimentaux: 1. Nuisances modérées liées aux injections intra-péritonéales et intraveineuse. Ces nuisances sont attendues durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer les injections. 2. Nuissances sévères à la réalisation d’une plaie par brulure. L’administration de l’analgésique avant la réalisation de la paie diminuera fortement la douleur. On attend donc seulement une nuisance modérée liée à cette intervention. 3. Nuissances modérées aux prélèvements de la moelle osseuse en intra-tibiale. L’administration de l’anesthésie avant la réalisation des prélèvements limitera au maximum ces nuances. Elles vont également être limitées par leur nombre (4 maximum) et l’alternance des deux pattes. 4. Modérées nuisances liées aux prélèvements sanguins hebdomadaires. Ces nuisances sont attendues pour durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer le prélèvement, car le saignement s’arrête par compression dès que le prélèvement est terminé. Nuissances modérées liées à l’irradiation sub-létale (2.5 Gy). Ces nuisances sont attendues pour durer 1 minute, ce qui correspond au temps nécessaire pour effectuer l’irradiation. 2. Effets indésirables issues des produits injectés: effets indésirables modérées liés à l’injection des cellules leucémiques (réduction de l’activité, position anormale du nez et des oreilles, poil hérissé, yeux plissés ou bridés). Ils vont être prévenus au maximum grâce à une analyse du taux d’infiltration leucémique à travers le prélèvement sanguin, qui doit conduire à la mise à mort anticipée de la souris en cas d’infiltration forte
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mises à mort avec dislocation cervicale car la moelle osseuse et la rate doivent être prélevées et analysées pour déterminer le taux d’infiltration leucémique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les objectives du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement de la leucémie nécessite la présence d’un micro-environnement médullaire qui joue un rôle clef dans le développement de la leucémie et le maintien des cellules souches leucémiques. L’évaluation de l’activité thérapeutique du Kambo nécessite également d’être faite in vivo car l’activité pharmaco-dynamique et la pharmaco-cinétique des peptides contenus dans les sécrétions de la grenouille jouent certainement un rôle clefs dans leur effet thérapeutique et elles ne peuvent pas être reproduites in vitro.
2. Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: – mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l’utilisation itérative de souris – effectuer une étude statistique qui permettra de determiner le nombre des souris à utiliser pour obtenir l’information scientifique en évitant la répétition de l’expérience. Cela permettra de réduire au minimum l’utilisation des animaux optimiser le matériel issu des greffes pour production multiple (congélation des cellules, conservation du materiel génétique etc..) pour analyses rétrospectives et éviter la répétition de l’expérience). quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection pour limiter les échecs de greffe
3. Raffinement
Pour réduire au maximum la douleur associée à la leucémie, la mise à mort sera pratiquée lorsque les cellules leucémique dans le sang représenteront 80% des cellules circulantes, c’est à dire quand la leucémie peut commencer à générer une légère souffrance aux animaux. Si des signes cliniques de souffrance se déclarent avant ce point limite, l’animal sera mis à mort. La manifestation de signe évoquant une douleur chez l’animal sera surveillée grâce à un suivi de 5 jours par semaine (de lundi au vendredi). Nous veillerons à optimiser, enrichir l’hébergement (nous mettrons de la nourriture dans la cage si nous constatons une difficulté de déplacement et accès à la nourriture et/ou à l’eau). Pour réduire la souffrance liée à la réalisation d’une plaie par brulure, l’analgésie sera administrée 3 fois (30 minutes avant de la réalisation de la plaie, 8 heures et 16 heures après). La plaie sera suivie 5 jours par semaine afin de surveiller tout risque d’infection (jusqu’à cicatrisation de la plaie). Si mise en évidence d’une infection cutanée, la plaie sera désinfectée 2 fois par jour avec une solution de Vétadine à 10% jusqu’à disparition des signes d’infection. Pour réduire au maximum les nuissance liées aux injections et au prélèvement de sang, nous ferons une surveillance 5 jours par semaine. Si des signes cliniques de souffrance animal apparaissent la souris sera mise à mort. Pour réduire les nuisances liées au prélèvement intra-tibial de la moelle osseuse les souris seront anesthésiées avant le prélèvement. D’autre part, nous limiterons ces prélèvements à un total de 4 (c’est à dire 4 prélèvements totaux qui se font en alternant le site de prélèvement entre le tibia gauche et le tibia droit avec une fréquence de 3 semaines entre prélèvements). Nous allons aussi réaliser un suivi du comportement des souris 5 jours par semaine après réalisation de ces prélèvements afin de vérifier que ces prélèvements n’auront pas d’impact sur le déplacement des souris. Si nous constatons des souris incapables de se déplacer, elles seront immédiatement mises à mort par dislocation cervicale
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’objective de ce projet est d’identifier de nouveaux traitement pour la LAM, une maladie qui rechute très fréquemment. Au cours des dernières années, la communauté scientifique a générée des lignées génétiquement modifiées en utilisant l’espèce Mus musculus. Ces lignées miment la maladie humaine et permettent donc d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de tester leur efficacité thérapeutique afin d’aboutir à des nouveaux traitements pour les patients atteints de cette maladie. Les souris génétiquement modifiées que nous allons utiliser proviendront de notre élevage. Elles seront utilisées entre 8 semaines et 36 semaines (âge auquel les souris auront toutes développées la leucémie). Les souris que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques murines seront fournies par un fournisseur agrée à l’âge de 7 semaines. Elles seront utilisées à 8 semaines, âge auquel ces souris tolèrent bien la greffe). Elles seront utilisées jusqu’au l’âge de 17-25 semaines, car 8-16 semaines seront nécessaires afin que les souris développent la leucémie après avoir été greffées. Les souris immunodéficientes que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques humaines proviendront de notre élevage. Ces souris seront utilisées entre 8 et 15 semaines car cette fenêtre d’âge permet d’avoir un taux idéal de greffe, en permettant de réaliser la procédure d’injection dans de bonnes conditions. Ces souris seront utilisées jusqu’à 52 semaines après la greffe car, comme décrit dans la littérature scientifique, certaines cellules humaines peuvent greffer après un longue période de temps, qui peux atteindre 52 semaines.