Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-291604)
63 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu’à sévère. Dès le deuxième jour de vie, les souriceaux reçoivent une injection de streptozotocine puis un régime gras destiné à faire évoluer une stéatohépatite vers la cirrhose et le cancer du foie, avec suivi par scanner et IRM sous anesthésie. Le porteur indique une mortalité prévisible d’environ 40 % en fin de protocole liée au régime et à la maladie, et classe la procédure sévère sur ce motif, tout en envisageant un reclassement en modéré selon les données. Il affirme qu’aucune approche in vitro n’existe pour ce type de pathologie et juge le recours à un organisme vivant « indispensable ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est classe comme le sixième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lié à la présence de la maladie du foie gras non alcoolique appelée « steato-hepatite non alcoolique » ou NASH en anglais. Cette maladie est caractérisée par une inflammation chronique du foie conduisant à une mauvaise cicatrisation appelée fibrose dont le stade ultime est la cirrhose. Or, la réponse inflammatoire des cellules immunitaires est amplifiée par triggering receptor expressed on myeloid cells1 (TREM-1). L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH diminue l’inflammation du foie et restaure les capacités de «recyclage » cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ces modèles animaux de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC. Afin d’évaluer à terme l’inhibition de TREM-1 dans le CHC, il nous faut d’abord développer un modèle de NASH évoluant jusqu’au stade CHC. Le modèle de souris C57BL/6 traitées par streptozotocine et soumises a un régime riche en graisse a l’avantage d’induire une véritable NASH avec toutes les composantes évolutives : excès de graisse semaine 6 (S6) ; NASH avec fibrose sévère a S8-10 et CHC entre S16-S20. Ces CHC sont constants et sont très proches des CHC humains sur le plan moléculaire. Dans ce projet, l’objectif est de mettre au point ce modèle, d’en caractériser les évolutions par imagerie IRM et Scanner et d’en adapter la résolution de façon à disposer des outils de suivi dans les futurs projets
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le développement du carcinome hépatocellulaire est étroitement lie à la présence d’une maladie chronique du foie conduisant à une cirrhose. Une des causes la plus fréquente est la steato-hepatite non alcoolique liée au syndrome métabolique. TREM-1 pourrait être un déterminant essentiel du développement, de la progression et du mauvais pronostic du CHC comme suggéré dans un modèle murin de steatohepatite non alcoolique mais cela reste à confirmer. L’inhibition de TREM-1 dans un modèle murin de NASH précoce diminue les lésions histologiques hépatiques (steatose, inflammation, ballonnisation, fibrose) via une diminution de l’inflammation et la restauration des capacités d’autophagie cellulaire. Ces résultats sont confirmés chez les souris génétiquement invalidées pour le gène TREM-1. Néanmoins, les limites de ce modèle animal de NASH sont l’absence d’évolution vers la cirrhose et le CHC.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Induction de la stéato-hépatite par une injection de streptozotocine de 10 secondes à J+2 de vie sur 58 souris avec un régime riche en graisse. – Imagerie par paliers du cancer du foie sous anesthésie générale à l’isoflurane : 1) Réalisation d’une imagerie par scanner avec et sans injection : réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux) avec une durée totale de 15 minutes par animal sous anesthésie par isoflurane. L’injection d’un produit de contraste aura une durée de 2 minutes par souris. Les séquences seront obtenues à 0,5 min, 4,5 minutes et 8 minutes de l’injection de produit de contraste iodé. 2) Réalisation d’une IRM (imagerie par résonnance magnétique) : la durée totale de l’acte sera de 30 minutes par animal réalisé par des personnes compétentes et avec le matériel adapté à la souris (plaque chauffante, monitoring des paramètres vitaux). – Injection de bromodeoxyuridine 2 heures avant la mise à mort des souris concernées (marquage cellulaire non toxique) d’une durée de 3 secondes par animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans la littérature, il existe une mortalité induite par le régime et par la maladie du foie à partir de la semaine 11 d’environ 5% par semaine soit 40% de mortalité en fin de protocole. Cliniquement, certaines souris vont perdre du poids en raison du manque d’appétit et de la fatigue. Néanmoins, ce régime n’induit pas de douleurs pour l’animal. Nous ne savons pas encore si notre procédure de raffinement permettra d’endiguer suffisamment la perte de poids et permettre une survie prolongée des souris. Par conséquent, la procédure a été jugée sévère en raison du taux de mortalité prévisible mais pourrait être effectivement reclassifiée en modérée en fonction des données du protocole. Le protocole ne sera pas réalisé d’une traite sur les 58 souris mais plutôt par étape ce qui permettra d’adapter la suite du protocole et de reclassifier la procédure si besoin. Des nuisances (stress) provoquées par les anesthésies nécessaires pour l’imagerie, ainsi que des douleurs légères lors des injections de bromodeoxyuridine, un marquage cellulaire, sont également à mentionner.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures. Les mises à mort sont réalisées pour récupérer les organes afin d’analyser les tissus et en particulier hépatiques (présence de cancer, degré de fibrose, d’inflammation et de graisse).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’évolution d’une pathologie inflammatoire multifactorielle comme la stéato-hépatite non alcoolique vers la fibrose sévère et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez un organisme vivant est indispensable.
2. Réduction
Le nombre total d’animaux est de 63, il a été calculé à l’aide d’analyses statistiques intégrant, la mortalité potentielle (basée sur notre expérience des modèles de fibrose), la variabilité entre chaque souris et leur sexe. Nous suivrons dans le temps le développement de la pathologie à l’aide de l’imagerie, nous obtiendrons donc un volume important de données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. L’utilisation de l’imagerie offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux.
3. Raffinement
Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, …) à leur bien-être. Le cancer du foie se développera de manière insidieuse et indolore. Il sera induit par une injection sous-cutanée unique d’un antibiotique associé à un régime riche en graisse. Les stades de la maladie seront évalués de manière non invasive par imagerie : scanner avec injection de produits de contrastes et IRM. Les examens d’imageries prévus dans ce protocole (IRM et Scanner) ne produisent aucune forme de douleur, ils sont non-invasifs et réalisés sous anesthésie générale. Cette dernière peut tout de même être source de stress pour l’animal. Les animaux sont surveillés durant l’examen : si l’animal présente une détresse respiratoire (dont le stade le plus sévère est la capacité à compter à l’œil nu le rythme respiratoire de l’animal), il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil. Une injection sera effectuée à la fin du protocole 2h avant la mise à mort. Celle-ci ne génère pas de souffrance chez l’animal car ce n’est ni un produit toxique ni corrosif, ni nauséeux. La piqure, qui peut être légèrement douloureuse, est effectuée par un zootechnicien entrainé, ce qui limite grandement le risque d’erreur et la douleur qui pourrait être infligée aux animaux. D’autre part cette injection protocolaire est prévue juste à l’issue des examens d’imagerie chez un animal encore endormi et qui sera mis à mort quelques heures plus tard limitant encore le risque de souffrance inutile. Les animaux seront surveillés plusieurs fois dans la journée jusqu’au moment de la mise à mort, et si un animal montrait des signes de ralentissement net de sa motricité, de sa respiration, ou tout autre signe évoquant un stress, il serait mis à mort immédiatement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les principaux modèles de stéato-hépatites non alcoolique ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle transgénique (KO TREM-1) permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) du récepteur TREM-1 dans la pathogenèse de la NASH et du CHC sur projets futurs en cas de mise au point réussie de ce modèle. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issues de souris gestantes. Comme mentionné dans la description du projet, le pancréas des jeunes souriceaux possède des capacités régénératives de ses îlots pancréatiques. Cette propriété nous permet d’utiliser la streptozotocine et son action toxique sur les îlots sans induire un vrai diabète mais plutôt un état d’insulinorésistance qui caractérise la NASH.