Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/05/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-346530)
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules de lymphome ou de cancer du côlon, laissées croître jusqu’à un volume de deux mille millimètres cubes, avec des prélèvements sanguins par la queue, pour identifier le mécanisme d’un vaccin antitumoral déjà commercialisé en médecine vétérinaire. Le porteur écrit qu’un anti-inflammatoire « introduirait des biais » en défaveur de l’étude et ne sera donc pas administré, et annonce une efficacité qui « devrait » reproduire celle observée chez le chien. Sur le remplacement, il indique avoir mené des travaux in vitro et ex vivo mais juge la vérification in vivo « primordiale ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le lymphome B diffus à grandes cellules est le lymphome le plus fréquent. La prise en charge thérapeutique est basée sur une immunochimiothérapie couplant le rituximab à la polychimiothérapie. Pour le patient âgé, cette thérapie n’est pas toujours applicable en particulier en raison de comorbidités notamment cardiaque. Pour pallier ce problème et envisager des traitements pouvant stimuler le système immunitaire, nous avons développé une thérapeutique basée sur l’utilisation de protéines autologues actives sur le système immunitaire. La procédure de préparation de ce vaccin est basée sur la purification de protéines tumorales sur des particules de phosphate de calcium d’hydroxyapatite. Ces particules devront être réinjectés au patient pour une réactivation spécifique de son système immunitaire contre les cellules tumorales. Cette préparation vaccinale est utilisée depuis 2013 en médecine vétérinaire dans le modèle canin. Une étude récente a mis en évidence un doublement de la survie des chiens après traitement par le vaccin. Etant donné Les résultats spectaculaires ont, la mise en place d’un essai clinique est envisagée chez l’homme. Cependant les équipes cliniques requièrent une analyse mécanistique de l’efficacité vaccinale dans un modèle pré-clinique murin. Il est envisagé d’inclure dans le protocole clinique d’autres types de cancers qui font également face à des obstacles thérapeutiques, tel que le cancer colorectal dans le projet. Enfin nos données préliminaires sur la composition du vaccin indiquent la présence de différentes protéines de choc thermique. Il est donc pertinent d’étudier leurs effets dans l’efficacité du vaccin. Nos objectifs sont donc dans ce projet, (1) de mettre au point la préparation vaccinale à partir de tumeur de lymphome B murin et de côlon, (2) de mettre au point la condition de traitement la plus efficace dans le modèle murin, (3) d’identifier les cellules immunitaires anti-tumorale et les protéines de choc thermique impliquées. L’utilisation de ce modèle dans des souris possédant un système immunitaire fonctionnel (Balb/c) a montré, dans plusieurs études, une pertinence pour identifier les cellules contrôlant le développement du lymphome et du cancer du côlon.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La vaccination des animaux devrait permettre une réduction tumorale significative comme celle observée chez le chien. L’identification des mécanismes antitumoraux de la vaccination nous permettra de valider les prérequis nécessaires à la mise en place d’un essai clinique de Phase I/II dans le lymphome B et le cancer du côlon.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Il s’agira de prélever une goutte de sang pour déterminer la composition sanguine de l’animal en réponses aux vaccins. Pour dilater la veine de la queue, les souris sont placées sous une lampe d’animalerie chauffante pendant 10 minutes. Elles sont ensuite glissées dans un tube de contention adapté aux souris et acheté chez un fournisseur spécialisé. Le placement des souris ne durera qu’une dizaine de secondes par souris. Le prélèvement de sang est ensuite effectué avec une aiguille (26 Gauge) ou une lame tranchante stérile. Cette opération durera en moyenne 10 secondes par souris. Cette méthode est recommandée pour des prélèvements répétés de moins de 0,1 mL de sang. Les animaux sont maintenus dans le tube de contention pendant toute la durée du prélèvement. Le volume prélevé est au maximum de 100 microlitres (2 à 3 gouttes). Après la prise de sang un point de compression sera réalisé afin d’éviter tout saignement à l’endroit de l’incision. Une prise de sang (100uL) à J-1 avant l’injection des cellules tumorales et le jour de la mise à mort à la fin de la procédure expérimentale seront réalisés. Total de 2 prises de sang par souris. Le nombre de souris concerné par ces prises de sang sera de 532. Les 36 autres souris qui seront employées à la génération des tumeurs nécessaires à la fabrication des vaccins ne seront pas concernées par ces prises de sang. Les injections de cellules tumorales A20 (2×106 cellules) et CT26 (5×105 cellules) seront réalisées en sous-cutanée à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 26 Gauge et concerneront les 568 souris du projet expérimentale. Un maximum de 100 µL de suspension cellulaire seront injectés. Chaque injection de cellules tumorales durera en moyenne une dizaine de seconde. Les injections de préparation vaccinale concerneront ¬532 souris à hauteur de 4 injections vaccinales par souris et seront réalisées à J5, J7, J9 et J14 en post-injection des cellules tumorales. Chaque vaccination durera en moyenne une dizaine de seconde. Au total, pour une souris, deux prises de sang auront lieu, (à J-1 avant injection des cellules tumorales et avant la mise à mort), 5 injections (1 de cellules tumorales A20 ou CT26 et 4 injections de solution vaccinale).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’utilisation du vaccin chez le chien depuis 2013 n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection des inhibiteurs d’HSP chez la souris n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection du vaccin peut engendrer de la souffrance et du stress au souris, c’est pour cela que l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. Également, l’injection des cellules cancéreuses A20 et CT26 par voie sous-cutanée se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 2000 mm2.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’analyse de la réponse des souris à la vaccination nécessite une étude approfondie des tumeurs et des cellules du système immunitaires. Le prélèvement de la tumeur ainsi que des organes lymphoïdes (rate et ganglions) contenant les cellules immunitaires nécessite la mise à mort des animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les résultats préliminaires obtenus à partir des nombreuses expériences in-vitro et ex-vivo ont été très encourageants et ont permis de réduire le nombre de souris au regard des différents axes restant à être investigués. Des marqueurs phénotypiques ont été découvert via ces expériences ex-vivo. Toutefois, ce modèle ne nous permet pas de tester notre hypothèse d’une stimulation de certaine populations anti-tumorales du système immunitaire. C’est la raison pour laquelle il est primordial de pouvoir vérifier ces résultats dans un modèle in-vivo. Ces expériences constituent des tests pré-cliniques et ont pour but d’observer l’immunogénicité de notre traitement dans un organisme vivant immuno-compétent. Ces expériences in-vivo sont donc nécessaires afin de mettre en valeur les aspects physiologique résultants de notre thérapie. Mais également de retrouver les marqueurs phénotypiques vérifiés par les expériences ex-vivo.
2. Réduction
Pour chacune des combinaisons thérapeutiques (vaccination préventive ou curative, effets des inhibiteurs de HSP, ou déplétion des HSP) réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 7 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques et valable avec le test non paramétrique adapté aux petits échantillons (< à 10) de Mann-Whitney. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.
3. Raffinement
Dans le but de préserver le bien-être animal et pour anticiper l’arrivée des signes de souffrance liés à la maladie, nous suivrons l’évolution de la croissance tumorale en mesurant tous les 2 jours par un pied à coulisse le volume des tumeurs, puis tous les jours lorsque la tumeur atteindra un volume égal ou supérieur à 1500 mm3. Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse pour l’ensemble de nos animaux (vaccinés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Les injections des cellules cancéreuses A20 et CT26 pourraient engendrer de la souffrance et du stress au souris, ainsi l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. La croissance tumorale sera monitorée et ne dépassera jamais les 2000 mm2. L’injection du vaccin par voie sous-cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales en sous-cutané (s.c.), et des vaccins (s.c.), pour nous assurer que les souris retournent à une activité normale (confort, vivacité, état sanitaire). L’utilisation d’un anti-inflammatoire introduirait des biais en notre défaveur, car cela irait à l’encontre de l’intérêt de l’étude (l’immunisation via l’utilisation d’un biomédicament). Pour pallier à cela, les animaux seront quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée. De plus, des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…). Les animaux seront mis à mort par les personnes formées. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane. Après la mise à mort, la mort des animaux est constatée par l’absence des signes vitaux : respiration, battements cardiaque, absence des mouvements volontaires et des réflexes.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris BALB/c seront utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions de développement tumorale en présence d’un système immunitaire compétent. Cette condition est nécessaire pour tester les effets d’une vaccination anti-tumorale sur le système immunitaire. La souris a pour intérêt d’avoir un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Le modèle de lymphome B murin A20 et le modèle CT26 de cancer du côlon ont été montré comme pertinent comme modèles pré-cliniques or ces modèles se développent dans des souris BALB/c. Nous utiliserons des souris femelles et mâles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.