Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/12/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-382092)
1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime obésogène pendant vingt-quatre semaines, des prélèvements sanguins répétés à la queue, des injections et un gavage. L’objet est d’étudier le rôle de la protéine d’horloge Rev-erba dans l’intestin au cours de l’obésité et du diabète. Le porteur s’appuie sur des travaux in vitro mais affirme devoir valider les mécanismes sur l’animal entier.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité et le diabète de type 2 peuvent s’expliquer par une consommation excessive de lipides mais aussi par des anomalies de leur métabolisme dans l’intestin. Ils exposent à un risque accru de maladies cardiovasculaires et hépatiques. L’intestin grêle représente à la fois la porte d’entrée des nutriments et une barrière sélective active séparant la lumière intestinale du milieu intérieur. C’est aussi un carrefour métabolique en communication permanente avec d’autres organes tels que le foie, le système nerveux, le tissu adipeux, par des communications humorales et nerveuses. En outre, les activités de l’intestin varient au cours de la journée et la protéine d’horloge Rev-erba pourrait moduler nombre de ces fonctions comme nous avons commencé à le démontrer récemment en utilisant des souris totalement déficientes en Rev-erba. Les questions de la contribution physiologique spécifique de Rev-erba intestinal à différents moments du cycle jour/nuit et des mécanismes de régulation du métabolisme lipidique intestinal par Rev-erba sont donc posées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du Rev-erba intestinal dans la réponse intestinale à un repas riche en graisse dans un contexte métabolique d’obésité ou de diabète. 2) Investiguer le fonctionnement du Rev-erba au niveau du métabolisme lipidique intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires placées sous son contrôle. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement altérées, n’exprimant pas Rev-erba spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le Rev-erba au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant Rev-erb pour évaluer leur action inhibitrice (ou non) sur l’absorption des lipides alimentaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La mise en place de ce projet de recherche va permettre de mieux comprendre le rôle du Rev-erba exprimé dans l’épithélium intestinal dans le maintien de propriétés métaboliques majeures de cet organe, l’absorption des lipides alimentaires en premier lieu, dans les fonctions endocrines et de barrière active sélective. Il permettra aussi d’évaluer dans quelle mesure les propriétés de Rev-erba s’exercent en lien ou non avec le rythme horaire des repas au cours de la journée. Ce projet prévoit d’évaluer l’efficacité d’approches pharmacologiques ciblant Rev-erba. Si les hypothèses sont validées, alors la compréhension du rôle et du mécanisme d’action de Rev-erba permise par l’utilisation combinée de modèles murins, de lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux, permettra de valider Rev-erba comme une potentielle cible thérapeutique dans le cadre de l’obésité et du diabète de type 2.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
256 souris recevront un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) sous forme de bouchon pendant 24 semaines et seront soumises à un suivi de masse corporelle hebdomadaire. Des prélèvements sanguins (1 goutte) à la queue seront réalisés chaque 2 à 3 semaines après 4h de jeun, et après une légère anesthésie induite par des vapeurs d’isoflurane (durée : quelques secondes). Au bout de 18 à 22 semaines de régime, ces animaux seront évalués au regard de la dégradation de l’homéostasie glucidique. Cela implique, sur animaux vigiles, un prélèvement de sang à la queue (1 goutte), une injection dans l’abdomen (piqure) ou une administration orale (canule de gavage – contention durant environ 30 secondes et injection ou gavage durant quelques secondes) et au maximum 8 prélèvements de sang à la queue (une goutte à chaque fois) en 2 heures. Lors de ces prélèvements, chaque souris sera posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang sera effectué en quelques secondes. 448 souris seront employées pour des tests pharmacologiques. Les composés seront injectés (piqure dans l’abdomen ou sous la peau), à raison d’une injection par jour pendant 15 jours (contention durant environ 30sec – injection ou gavage quelques secondes). Afin d’étudier la réponse métabolique, 608 souris seront soumises à un test de tolérance à l’huile. Cela implique deux administrations (canule de gavage) d’huile d’olive par voie orale (contention durant environ 30sec – gavage quelques secondes) en 8 heures, une injection dans l’abdomen (piqure – contention durant environ 30 secondes et injection durant quelques secondes) et un prélèvement de sang à la queue 6 fois en 9 heures, réalisés sur animaux vigiles. Lors de la phase terminale, un dernier prélèvement de sang sera réalisé (voie rétro-orbitale) au cours d’une anesthésie profonde induite par des vapeurs d’isoflurane. Les animaux seront euthanasiés (dislocation cervicale) avant leur réveil puis les organes seront prélevés.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les modèles murins utilisés dans ce projet comprennent la délétion de Rev-erba, codant pour une protéine de l’horloge de la classe des récepteurs nucléaires exprimée dans de nombreux organes, soit constitutive « corps entier », soit restreinte aux cellules de la muqueuse intestinale. Une lignée exprimant une forme mutante de Reverba qui ne possède pas le domaine de liaison à l’ADN nous permettra de disséquer les mécanismes mis en jeu en discriminant les effets génomiques et non génomiques. Ces invalidations/surexpression/mutation de Rev-erba n’engendrent, par elles-mêmes, aucune souffrance. Ces souris sont viables, fertiles et ne présentent pas de phénotype ou de comportement dommageables. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en oeuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. L’utilisation du régime gras (high fat) pour induire l’obésité et le diabète n’entraîne aucune douleur ni stress. Le gavage gastrique peut entraîner un certain stress, des irritations ou une gêne de courte durée. Les prélèvements sanguins à la queue nécessitent une contention légère des souris et ne dure pas plus de 30 secondes. Pour les injections en intra péritonéale (i.p.), il peut y avoir une douleur au point d’injection. Les produits injectés sont indolores (insuline, glucose, inhibiteur de lipoprotéine lipase) et de faibles volumes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La totalité des animaux sera euthanasiée à la fin des procédures. Le sang des animaux sera collecté et certains organes (côlon, intestin grêle, foie, tissus adipeux, cœur, muscle) seront également prélevés pour mesurer leur poids et leur taille, étudier leur histologie ou préparer des cultures d’organoïdes intestinaux. Il est alors impossible d’obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La demande d’utilisation des modèles murins pour étudier le rôle Rev-erba dans l’intestin lors du développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète se base sur de nombreuses expériences in vitro réalisées sur la lignée cellulaire Caco-2/TC7 et sur des cultures d’organoïdes intestinaux. Cependant à ce stade de l’étude, il est nécessaire d’utiliser des modèles complexes (animal vivant et non cancéreux) afin de valider dans un premier temps les résultats obtenus in vitro et dans un second temps de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de Rev-erba dans le développement de la pathologie. De plus, le diabète et l’obésité sont des pathologies complexes faisant intervenir les interactions entre différents organes (intestin, foie, tissus adipeux, cerveau) mais également entre les différents types cellulaires composant l’intestin lui-même. Ainsi le recours à des modèles in vivo reproduisant l’ensemble de ces interactions est indispensable pour mieux caractériser le rôle de Rev-erba dans le développement et la progression du diabète et de l’obésité.
2. Réduction
Le projet a été conçu avec un nombre minimal d’animaux nécessaires pour assurer la validité scientifique des expériences qui seront menées. Dans cette étude, animaux mâles et femelles seront utilisés afin de déterminer dans quelle mesure Rev-erba dans l’intestin est protecteur (ou non) dans les deux sexes, vis-à-vis du développement des maladies métaboliques. En se basant sur des précédentes expériences réalisées au laboratoire, il sera utilisé des groupes de 6 à 8 souris. En effet, les tests métaboliques (tolérance au glucose, tolérance à l’huile), les analyses de biochimie, protéiques et géniques nécessitent un minimum de 6 souris alors que les analyses histologiques nécessitent 8 souris par groupe de régime.
3. Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement dépourvu de stress, et dans un statut sanitaire SPF ou SOPF. Les souris cohabiteront par groupe de 4 par cage, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Le change de la litière s’effectue une fois par semaine. Lors de la mise sous régime des souris, la fréquence de change de la litière et de la cage est de deux fois par semaine. Le bien-être de l’animal depuis sa naissance jusqu’à sa mort sera pris en compte grâce à un environnement enrichi (présence d’abris et de jeux dans les cages), une surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux, et la prise en compte de tout signe physique de stress ainsi que de la hiérarchie sociale. L’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress des animaux durant l’expérimentation. La définition précise des points limites précoces associés à chaque procédure, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permettront de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de l’animal. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et seront mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Cette espèce est choisie car la souris peut être génétiquement modifiée par transgénèse. De plus, il existe beaucoup d’outils pour étudier l’intestin dans cette espèce. Il existe aussi des données sur les gènes régulés par Rev-erba au sein de certains types cellulaires de l’épithélium intestinal. Ainsi, nous pourrons diminuer le nombre d’animaux employés en croisant nos données avec celles de la littérature. De plus, cette espèce permet de réaliser des gains- ou pertes-de fonction de Rev-erba spécifique à l’intestin afin de mieux disséquer son action. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (âge>10 semaines)