Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-427989)
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l’inflammation de l’hypothalamus provoquée par un régime riche en graisses. Une partie subit une ou deux chirurgies du crâne pour implanter une pompe et une canule assurant des perfusions dans le cerveau pendant quinze jours, une autre reçoit un régime gras puis des injections et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur qualifie lui-même ces chirurgies stéréotaxiques de lourdes et douloureuses, et décrit des pertes de poids, de la prostration et des douleurs au crâne. Il affirme qu’il est impossible de reproduire in vitro les échanges entre organes et conclut que l’utilisation de modèles animaux est « nécessaire ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Dans le contexte de l’obésité nutritionnelle, il est actuellement reconnu que la consommation d’un régime riche en lipides (HFD) entraine une inflammation très rapide de l’hypothalamus, une région du cerveau qui joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Les médiateurs et les mécanismes impliqués dans la mise en place de cette réponse inflammatoire aigue de l’hypothalamus et des perturbations métaboliques associées restent cependant à élucider. Récemment, nous avons mis en évidence que l’inflammation hypothalamique induite par 3 jours de régime HFD s’accompagne d’une forte augmentation de la production hypothalamique d’une hormone (X) connue pour ses propriétés pro-inflammatoires et favorisant le développement de l’insulino-résistnace, principal facteur de risque du diabète de type 2. Dans ce contexte, ce projet vise à démontrer in vivo l’implication de cette hormone hypothalamique dans la mise en place de l’inflammation précoce de l’hypothalamus et de déchiffrer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant ses effets. Il n’existe à ce jour aucune méthode de substitution aux animaux de laboratoire pour étudier l’impact physiologique d’un dérèglement nutritionnel. Le modèle animal envisagé dans cette étude est un modèle souris (souche C57BL6) particulièrement bien documenté dans la littérature pour ce type d’étude. Le nombre d’animaux est minimalisé en vue d’appliquer les réglementations européennes en terme de réduction. L’objectif de Raffinement et d’enrichissement est pris en compte afin de s’assurer du bien-être des animaux (surveillance quotidienne). Le recours à l’anesthésie et analgésie sont prévus pour éviter toute souffrance des animaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude va permettre de caractériser plus précisément les mécanismes et les médiateurs jouant un rôle crucial dans l’apparition de la neuroinflammation hypothalamique et à l’origine de désordre métabolique. Identifier ces facteurs pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques permettant de prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du Diabète de type II.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
400 souris au total subiront une chirurgie stéréotaxique, et 160 souris au total subiront 2 chirurgies stéréotaxiques : une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d’injecter la tat cre, et une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) une semaine plus tard pour poser le système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (perfusion de 15j). 420 souris au total seront nourries avec pour moitié un régime normal et pour moitié un régime riche en graisse pendant 3 à 8 jours et toutes les souris seront soumises à des mesures de glycémie à différents temps ( 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min au plus) suite à une injection rapide en intraperitonéale (2-3 secondes) de glucose, d’insuline ou de pyruvate. Ceci implique plusieurs prélèvements à la queue d’une goutte de sang (6×5μl de sang au plus = 30μl). Une seule incision au niveau de la queue a lieu au début de l’expérience, elle est faite en une seconde.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures font intervenir des injections et perfusions et des chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne. Toutes les précautions seront prises pour éviter au maximum ces effets.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
400 souris au total serviront à toutes les analyses immunohistochimiques et hybridation in situ pour étudier les ARN et protéines sur tissus et 420 souris serviront aux études de HITS CLIP pour l’identification des cibles, de PCR quantitative pour évaluer les niveaux d’expression des ARN et de western blot pour l’expression protéique. Tous les détails sont précisés dans chacune des procédures en réponse à des objectifs précis.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est nécessaire pour ce projet. Cependant, veuillez noter que pour réduire le nombre d’animaux au maximum une partie des expériences sera réalisée in vitro, sur des lignées de cellules microgliales et neuronales hypothalamiques afin de déchiffrer les voies de signalisations sous tendant les effets proinflammatoires de l’ hormone X. Cependant, les expériences prévues sur les tanycytes seront réalisées sur des cultures primaires à partir d’hypothalamus de souris car il n’existe pas à ce jour de lignée de tanycytes commerciales. Ceci nécessite par conséquent l’utilisation de beaucoup d’animaux, et ne permet donc pas le remplacement.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, tout ce qui est possible de faire in vitro a été planifié. De plus, des tests de puissance ont été réalisés au laboratoire pour chaque test planifié et notre expertise depuis plusieurs années sur ce type d’expérience nous permet vraiment d’évaluer à juste titre nos besoins expériementaux.
3. Raffinement
Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d’avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n’obtenons pas de résultats homogènes au sein d’un groupe expérimental, nous remonterons l’historique de l’animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s’il a plus ou moins mangé/pris de poids qu’un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d’expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d’une injection de Lidocaïne au niveau de site de l’incision avant en tant qu’anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose. De plus, en période post-opératoire, dès la fin des sutures, un analgésique est injecté en sous-cutané, idem le jour suivant l’opération. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de scores et d’actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l’animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l’animal de la procédure et l’euthanasie si absence d’amélioration des scores.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.