Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 27/07/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-453808)
797 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée, puis elles reçoivent des injections répétées d’un mimétique de l’héparane sulfate ou un anti-fibrosant par gavage, avant une exploration respiratoire. Le porteur décrit la fibrose comme indolore mais reconnaît qu’elle peut provoquer une insuffisance respiratoire sévère et tuer 20 à 30 % des animaux avant l’euthanasie prévue pour prélever les organes. Il affirme qu’aucune méthode ne remplace l’induction d’une fibrose in vivo et juge la souris plus adaptée à l’approche mécanistique.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë, les exacerbations aiguës de maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l’utilisation de mimétiques des héparanes sulfates (HSM) afin d’améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aiguë. Les effets bénéfiques des HSM seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant la matrice détruite, en protégeant les peptides cellulaires communicants (facteurs de croissance, cytokines, chimiokines), et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité d’un agent mimétique de l’héparane sulfate à réduire l’inflammation, les altérations des mécanismes de l’angiogenèse et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d’améliorer les séquelles de lésions pulmonaires aiguës caractéristiques des dommages alvéolaires diffus. En cas de succès, ce projet proposerait une nouvelle approche pour la prévention et le traitement de la fibrose pulmonaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’hypothèse de recherche de ce projet est que l’agent mimétique de l’héparane sulfate présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aiguës en fournissant une thérapie régénérative du tissu lésé. Ainsi cet agent (1) remplacera la matrice extracellulaire remodelée consécutive à l’induction des lésions en ciblant les héparanes sulfates (2) améliorera l’angiogenèse et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire, et par conséquent la fibrose pulmonaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La réalisation de ce projet nécessite l’induction d’une fibrose pulmonaire (durée 21jours). Dans un premier temps nous déterminerons la dose optimale d’agent mimétique de l’héparane sulfate. Pour cela les animaux recevront 6 injections intraveineuses (durée quelques secondes) de cet agent mimétique ou de serum physiologique. Le groupe contrôle recevra une molécule anti-fibrosante quotidiennement par gavage. Après une exploration fonctionnelle respiratoire (durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes. A partir de la dose optimale identifiée, nous déterminerons les mécanismes d’action de cet agent mimétique de l’héparane sulfate dans les stades précoce (jour 8) et tardif (jour 11) de l’inflammation. Pour cela les animaux recevront respectivement 2 (jour 5 et 7) et 3 (jour 5, 8 et 10) injections intraveineuses d’agent mimétique de l’héparane sulfate ou de serum physiologique. Le groupe contrôle positif recevra une molécule anti-fibrosante par gavage (durée quelques secondes) pendant 4 ou 7 jours respectivement. Suite à cela les animaux seront euthanasiés aux jours 8 ou 11 pour prélèvement des organes (durée 10 minutes). Enfin une étude de la pharmacocinétique et de la pharmacodistribution sera réalisée. Pour cela les organes seront prélevés à 5 min, 30 min, 3h, 6h, 12h 24h après injection intra veineuse d’agent mimétique de l’héparane sulfate.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale de bléomycine est validé et couramment utilisé dans la littérature internationale. Ce modèle est caractérisé par un pic inflammatoire (D8) précédent l’apparition de la fibrose pulmonaire (D14-D21). L’instillation intra-trachéale de BLM n’entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l’animal. Le développement d’une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l’absence d’innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30%. La technique de plethysmographie corps entier est une technique largement utilisée pour l’étude de la respiration. Elle permet de mesurer les variables ventilatoires sur un animal non anesthésié et non contraint. Afin de diminuer le stress de l’animal, une séance d’acclimatation sera systématiquement réalisée. Concernant les prélèvements, tous les animaux seront anesthésiés au préalable.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d’organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l’induction d’une fibrose pulmonaire in vivo. De fait, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale in vivo à ce jour. D’autre part, l’étude des mécanismes d’action d’un mimétique de l’héparane sulfate dans le cadre d’une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l’existence d’outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
2. Réduction
Le nombre total d’animaux impliqué est de 797. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d’arrêt d’expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du traitement à la bléomycine (BLM) et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.
3. Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité́ relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L’enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d’abri en cellulose. Concernant l’insitllation intra-trachéale de bléomycine, celle-ci sera réalisée sous anesthésie. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l’instillation n’entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l’animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale de bléomycine et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l’anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d’anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l’examen visuel des signes suivant: immobilité́, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité́ (faiblesse musculaire, ataxie, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé́, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d’évaluation avec score est utilisée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce projet nécessite d’induire une fibrose pulmonaire, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n’existe donc pas d’alternative à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Notre choix c’est porté sur la souris car c’est un modèle qui s’héberge et se reproduit facilement. D’autre part, le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instilation intra-trachéale de bélomycine est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et Il a permis la description de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. Cependant, les souris jeunes semblent moins sensibles à la bléomycine comparées aux souris âgées. Cependant, Il est bien décrit dans la littérature que les souris C57Bl6/J plus âgées, développent une fibrose pulmonaire plus sévère, ce qui risquerait d’induire une surmortalité. Le compromis qui a été choisis est un âge de 8 semaines.