Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-10-31 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-457079)
60 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 48 étant classés en souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie, suivi d’injections d’apeline, de jusqu’à sept prélèvements sanguins, d’imageries répétées et de tests comportementaux dont le détail n’est pas précisé. Le porteur indique que l’infarctus peut entraîner une perte de mobilité, des troubles de la déglutition avec risque d’asphyxie et de mort, et une perte de poids. Il conclut qu’aucun modèle in vitro ne prend en compte l’ensemble de ces paramètres et décrit le rat comme donnant les déficits « les plus comparables » à ceux de l’humain.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause d’handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Elle est causée par l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot de sang (=ischémie). Cette occlusion réduit de manière conséquente l’apport en oxygène et en nutriments des cellules cérébrales et engendre ainsi une crise énergétique. Cette dernière est à l’origine d’une destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements permettant la désobstruction de ces vaisseaux sanguins cérébraux, 50% des patients traités gardent des séquelles aussi bien motrices que cognitives. Bien qu’une zone cérébrale soit définitivement détruite suite à l’ischémie, la zone se trouvant à sa périphérie peut encore être secourue. Cette zone demeure sensible aux changements tels que la création de nouveaux vaisseaux ou la réorganisation des neurones ce sont les mécanismes de plasticité vasculaire et neuronale qui sont le pivot de la récupération pos-AVC. Suite à une ischémie, ces différents mécanismes compensatoires sont activés, cependant ils s’avèrent fréquemment insuffisants pour assurer une reperfusion efficace. C’est pourquoi, plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC. Parmi ces pistes, le couple Apeline (un peptide)/APJ (son récepteur) font l’objet d’un intérêt croissant. Ce couple joue un rôle important dans le système cardiovasculaire, le métabolisme énergétique, et l’angiogenèse (création de nouveau vaisseaux sanguins) aussi bien physiologique que tumorale. La littérature récente, suggère que ce couple de molécule aurait un effet neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant, ces études se limitent à une administration unique d’Apeline le jour de l’ischémie et les bénéfices comportementaux ne sont évalués qu’à très court terme.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d’injections répétées d’Apeline dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez un modèle murin. À ce jour, ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature. Nous suivrons églement la récupération fonctionnelle ainsi que cognitive des animaux. En effet, les troubles cognitifs induits par l’AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit en per- opératoire. Néanmoins, dans ce modèle, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Ce projet à donc pour objectif de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée plus longue et ainsi d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des altérations moléculaires, motrices et cognitives après la survenue d’un AVC.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie (isoflurane ou sévoflurane). Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d’environ 30 minutes) visant à induire l’ischémie cérébrale. Les animaux seront soumis à des injections dans le but de leur administrer le traitement (de 1 à 3 injections selon le groupe). Les animaux seront soumis à un maximum de 7 prélèvements sanguins à la queue lorsqu’ils seront endormis. Les tests comportementaux seront réalisés à J1, J7 et J14 de manière à évaluer la sévérité de la lésion ainsi que la récupération post-AVC. Ces tests durent de 15 à 20 minutes par animal lors de chaque session de test. Les imageries auront lieu à J2, J3, J8 et J17 post-ischémie et devraient durer 30 minutes chacune. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J17.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, de petits volumes, qui seront effectués suite à la pause d’un cathéter au niveau de la veine caudale et pourraient engendrer de petites lésions au niveau de la queue ainsi qu’une douleur au moment de la piqure. La première nuisance est l’acte chirurgical en soi. Par la suite, la chirurgie va avoir pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. De même, la zone incisée puis suturée engendre une plaie cutanée. Durant les premières heures, l’animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie. Les imageries sont réalisées relativement tôt après la chirurgie et de manière répétée au cours du protocole pouvant engendrer un stress pour l’animal. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque d’hypothermie. Plusieurs injections intraveineuses de radiotraceurs dans les veines caudales seront réalisées et pourraient engendrer une douleur au niveau de la zone d’injection. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J17,et pourraient être à l’origine de légère gènes au niveau du vagin suite aux pipetages répétés. Enfin, les animaux seront soumis à divers tests comportementaux, sensorimoteurs et cognitifs, au cours du protocole qui pourrait engendrer un stress.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux seront mis à mort après la dernière imagerie à J17 pour obtenir des tissus cérébraux destinés à des analyses histologiques et de biologie moléculaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
L’étude de l’effet d’un médicament sur les suites d’un accident vasculaire cérébrale (AVC), nécessite de prendre en compte l’étude des lésions cérébrales et les impacts moteurs et sensoriels qui en découlent. De nos jours, aucun modèle in vitro ne permet de prendre en compte l’ensemble de ces paramètres. C’est pourquoi, nous avons choisi un modèle d’obstruction temporaire de l’artère cérébrale moyenne chez le rat, car en plus d’être bien d’écrit dans la littérature, il permet d’obtenir les déficits les plus comparables à ceux observés chez l’Homme. De plus, cette espèce permet l’obtention de prélèvements sanguins répétés avec un volume suffisant sans impacter le bien être de l’animal.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Cette étude nous permettra d’évaluer s’il existe ou non, un effet du traitement répété à l’Apeline sur la réduction du volume final de l’infarctus/réduction des troubles cognitifs dû à la survenue d’un AVC. Nous prévoyons un maximum de 60 rats pour cette procédure. Pour évaluer le modèle AVC chez la rat au cours du temps nous utiliserons l’imagerie moléculaire in vivo, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Le modèle d’AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Dans notre étude nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’Apeline sur 3 jours sur la récupération au cours des 2 premières semaines post-AVC. Nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et utiliser différentes méthodes d’analyses moléculaires.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections intraveineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal ainsi que son réveil rapide. Les rats anesthésiés seront toujours placés sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et/ou générale par injection sous cutanée de morphinique. Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, rat prostré, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement sont classiques et comprennent des animaux hébergés en groupe, avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction . Les cages seront enrichies de tunnels et de la nourriture humidifiée sera placée dans la cage pour faciliter l’accès aux croquettes (rendu plus difficile en raison des séquelles motrices) mais aussi contribuer à la réhydratation. En cas de mort du congénère, l’animal survivant pourra être associé à un autre animal pour éviter la sollitude au cours du protocole.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Le rat présente des similitudes anatomo-fonctionelles avec l’être humain au niveau du système vasculaire cérébral (contrairement à la souris). De plus, les mécanismes cellulaires sous-jacents à la mort neuronale, induit par l’AVC chez le rat sont également proches de ce qui a été observé chez le patient. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux ou moléculaires de vérifier l’efficacité de nouvelles stratégies de rééducation dans des études précliniques. De part la difficulté du modèle AVC et les nombreuses pertes qu’il peut engendrer, aucune étude n’a, à notre connaissance, adapté ce modèle à des rats plus âgés. Pourtant, l’incidence de l’AVC augmente avec l’âge et l’apparition de nombreuses commorbidités. Ainsi, nous avons choisi de tester un traitement pharmacologique chez des rats plus âgés, de 6 à 8 mois, permettant d’augmenter la transférabilité de notre étude à la clinique. Pour se faire, des rats femelles âgées de 6 à 8 mois seront utilisées dans cette étude et auront atteint un poids compris entre 300g et 400g (stable depuis le 4ème mois).