Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-10-31 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-470895)
1 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent un inhibiteur de macrophages dans la nourriture ou l’eau de boisson et des injections intrapéritonéales, avant mise à mort pour prélever les glandes surrénales, afin d’étudier le rôle des macrophages dans cet organe. Le porteur indique que les traitements oraux n’induisent pas d’effet indésirable en eux-mêmes mais qu’une dérégulation de la surrénale pourrait provoquer des changements de poids ou de l’hypertension. Il affirme d’abord chercher à remplacer les manipulations in vivo par de la culture cellulaire, puis conclut à la « nécessité » de recourir aux souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
La glande surrénale fait partie des organes endocriniens dont le bon fonctionnement est clé pour la régulation de l’homéostasie de l’organisme. Bien que l’activité endocrine du cortex de la surrénale repose majoritairement sur l’axe hypothalamo hypophysaire et le système Rénine/Angiotensine, d’autres modulations de l’activité endocrine, notamment par des cellules du microenvironnement immunitaire, ont été décrites. En 1984, de nombreuses recherches ont montré que les macrophages résident généralement dans les organes endocriniens, y compris la glande surrénale. Postérieurement, des études dans le pancréas ou dans le testicule ont mis en evidence que les cellules endocrines avaient besoin de la fonction trophique des macrophages pour assurer le maintien de la structure tissulaire et bon fonctionnement de l’organe. En effet, il semblerait exister une symbiose entre les cellules endocrines et les macrophages, chacun influençant profondément l’un l’autre. Cependant, la fonction des macrophages dans la glande surrénale est encore mal comprise. Dans ce projet, nous visons donc à étudier le rôle des macrophages dans l’homéostasie de la glande surrénale et leur association potentielle au dévelopement des maladies surrénaliennes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer un rôle global encore méconnu des macrophages dans le contrôle de la maturation et de l’homéostasie du cortex surrénalien. De même, notre projet envisage la réalisation du premier atlas haute résolution de toutes les cellules surrénales, y compris leur microenvironnement, grâce à des techniques d’analyse cellulaire à grande échelle. Tout cela nous permettra d’avoir un aperçu complet du rôle des macrophages dans le cortex surrénalien normal, et ouvrira la voie à des études futures visant à comprendre leur rôle potentiel dans les maladies surrénaliennes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : – Alimentation supplémentée avec ou sans inhibiteur des macrophages : les souris, mâles et femelles confondus, âgées entre 3 semaines et 6 mois seront nourris une seule fois avec de la nourriture formulée avec l’inhibiteur des macrophages pendant différents temps (allant de 1 semaine de traitement à 6 mois) selon les expériences scientifiques et les analyses pour lesquelles elles seront utilisées. – Traitement avec un agent permettant de mesurer la prolifération cellulaire dans l’eau de boisson : les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec le composant permettant de mesurer la prolifération cellulaire pendant 1 semaine. Cet agent est largement utilisé chez la souris pour étudier la prolifération cellulaire. – Traitement avec du KCl (chlorure de potassium) dans l’eau de boisson : les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec du KCl pendant 24 heures. Cet agent est largement utilisé chez la souris pour faire des tests de réponse hormonale. – Traitement avec un agent permettant de stimuler la sécrétion hormonale dans l’eau de boisson : afin d’induire une atrophie de la glande surrénale, les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec le composant permettant de stimuler la sécrétion hormonale pendant 1 semaine. – Injections intrapéritonéales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. Les souris (mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines), seront injectées soit avec l’agent permettant de mesurer la prolifération cellulaire, l’agent permettant d’induire l’expression d’un système de marquage cellulaire ou l’agent permettant de stimuler la sécrétion hormonale à différents temps. Ces injections seront réalisées au maximum deux fois en combinaison avec une ou plusieurs procédures décrites auparavant.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Les traitements réalisés par voie orale (formulées dans la nourriture ou dans de l’eau de boisson) n’induisent pas d’effets indésirables/délétères sur les animaux par eux-mêmes ni par la méthode d’administration. Cependant, on pourrait observer des effets indésirables associées à une possible dérégulation de la glande surrénale en absence de macrophages ou suite aux différents traitements, tels que des changements de poids ou de l’hypertension. En cas d’observation de ces effets indésirables sur les animaux, les traitements seront vite arrêtés et un retour à des conditions normales/physiologiques devrait avoir lieu dans les heures suivantes. Pourtant, on ne prévoit pas une durée de plus de 3 jours pour ces effets indésirables. De même, bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritonéales peuvent induire un stress sur les animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle des macrophages dans les divers processus impliqués dans le contrôle de l’activité endocrine de la surrénale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Afin d’eviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés pouvant participer à la communication entre les macrophages et les cellules endocrines. Cependant, les processus de differentiation et mort cellulaire, production hormonale, réponse immunitaire ou renouvellement tissulaire sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que la glande surrénale est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour générer une régulation hormonale correcte. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultannées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse de qPCR et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les expériences impliquant le dosage hormonal, et compte-tenu de la variabilité intrinsèque de ces analyses, nous avons estimé à 12 le nombre d’animaux minimum nécessaires par groupe. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux nourris avec de la nourriture formulée avec l’agent pharmacologique inhibiteur des macrophages, seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur mise à mort. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’endocrinologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant des altérations dans les glandes surrénales, mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La maturation de la glande surrénale a lieu entre 3 et 6 semaines après la naissance. Pour cela, nous allons déterminer le rôle des macrophages pendant la maturation de la glande surrénale chez des souris agées de 3 semaines (souris jeunes non sevrées). Une fois mature, la glande surrénale, est renouvellée constamment pour s’assurer du bon fonctionnnement tout au long de sa vie. Dans le but de caractériser le rôle des macrophages dans le renouvellement et la production hormonale de la glande surrénale, des souris adultes âgées de 2 à 6 mois seront utilisés dans ce projet.