Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/06/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-466401)
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de cellules hématopoïétiques sous anesthésie et jusqu’à six prélèvements de sang, pour étudier le rôle du récepteur PPARγ dans la fibrose de la moelle osseuse au cours de la myélofibrose, un cancer du sang. Le porteur indique que la maladie peut réduire la prise de poids et augmenter la taille de la rate, et que les souris sont tuées en fin d’expérience pour l’examen des fémurs, seuls les reproducteurs de la lignée étant gardés vivants. Sur le remplacement, il affirme qu’il reste impossible de reproduire in vitro la complexité du microenvironnement médullaire et conclut que la validation passe par le modèle murin.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La production des cellules sanguines (hématopoïèse) est réalisée au niveau de la moelle osseuse et résulte d’une interaction fine entre les cellules progénitrices (qui peuvent se diviser et donner les cellules du sang) et les cellules stromales qui sont une composante du microenvironnement de la moelle osseuse. La myélofibrose (MF) est un cancer du sang rare caractérisé par une fibrose de ces cellules stromales entrainant une altération de la production des cellules sanguines. C’est une pathologie grave, avec une médiane de survie de 5 à 6 ans. Il a été rapporté que l’activation du récepteur nucléaire (PPARγ) par des molécules pharmacologiques entraîne une réduction de la fibrose dans des modèles murins de MF. Ces résultats en font une une cible thérapeutique intéressante dans une pathologie où les traitements agissent principalement sur les symptômes de la maladie. Dans l’objectif d’utiliser des médicaments ciblant PPARy dans le traitement de la MF, il est impératif de caractériser le rôle physiologique de PPARy dans le stroma de la moelle osseuse. Pour répondre à cette question, un stroma médullaire murin qui, par l’utilisation d’une technique de génie génétique, n’exprime pas PPARy a été développé. Il récapitule des caractéristiques de la fibrose médullaire avec notamment une altération des capacités à soutenir l’hématopoïèse. Les premiers résultats obtenus in vitro ne permettent pas l’étude du rôle de PPARy dans toutes les composantes de l’hématopoïèse. Pour cela nous prévoyons de développer des systèmes d’étude plus complexes faisant appel au modèle murin. Nous mettrons en place une co-culture de cellules progénitrices hématopoiétiques murines et humaines sur stroma normal (WT) ou invalidé (KO) qui sera transplanté dans des modèles murins pour l’étude de leur hématopoïèse. La même approche sera utilisée avec des cellules progénitrices provenant d’hémopathies afin d’étudier l’effet sur une hématopoïèse pathologique En parallèle de cette étude un modèle murin d’invalidation (KO) de PPARy spécifiquement dans les cellules du stroma de la moelle osseuse sera développé. Il permettra après traitement par une molécule stimulant la MF de déterminer si la sensibilité à la fibrose est corrélée à l’expression de PPARy dans les cellules du stroma de la moelle osseuse. Enfin, on étudiera dans ce modèle la manière dont se développent différents cancers du sang afin de déterminer si la fibrose médullaire impacte l’histoire naturelle de ces maladies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) (famille de cancer du sang comprenant également la polyglobulie de Vaquez (PV) et thrombocytémie essentielle (TE) avec une médiane de survie de cinq à six ans. Les traitements actuellement disponibles ciblent principalement les symptômes et n’ont que peu d’influence sur l’histoire naturelle de la maladie. Seule la greffe de moelle osseuse est curative mais elle ne concerne qu’une faible minorité de patients qui sont éligibles au traitement. Récemment, il a été démontré que l’activation du récepteur nucléaire PPARy par ses ligands pharmacologiques permettait de réduire le développement anormal de la densité osseuse (ostéosclérose) et de la fibrose médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF. Au cours de ce projet, nous souhaitons caractériser la fonction physiologique de PPARy au sein des cellules du microenvironement de la moelle osseuse (stroma médullaire) qui supportent la production des cellules sanguines et sont les cibles de la fibrose. Nous souhaitons ainsi démontrer que PPARy est un acteur clé de la prévention du développement de la fibrose médullaire, de l’ostéosclérose et de la capacité des cellules mésenchymateuses à soutenir l’hématopoïèse. L’ensemble de ces travaux a pour objectif de mieux caractériser en quoi PPARy peut être une cible thérapeutique ouvrant de nouvelles stratégies de prise en charge (en monothérapies ou associées au traitement conventionnels) des NMP et particulièrement de la myélofibrose. Ces résultats pourront également être étendus à d’autres organes dont les pathologies impliquent le développement d’une fibrose. Dans un contexte plus général ce travail permettra également de mieux comprendre et appréhender la part relative au stroma médullaire dans le développement des hémopathies et le potentiel intérêt d’un ciblage thérapeutique du stroma en plus de celui des cellules hématopoïétiques. Des molécules pharmacologiques ciblant PPARy étant déjà sur le marché, ce travail permettra également d’envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis au maximum à : – Une irradiation : procédure indolore, réalisée en maintenant les groupes sociaux définis, et durant une dizaine de minutes. – Une unique injection pour chaque animal (animal sous anesthésie générale et analgésie) de cellules hématopoïétiques normales ou pathologiques. Cette intervention ne dure que quelques minutes et se déroule sous un contrôle permanent pour veiller à la bonne anesthésie, l’absence de douleur et gérer le réveil. – Des prélèvements de sang : pour le suivi de l’hématopoïèse, réalisés sur animaux vigiles sur une durée ≤ à une minute, avec un délai minimum de 3 semaines entre chaque prélèvement et un nombre maximum de 6 prélèvements – un traitement par injection impliquant un geste d’une durée inférieur ou égale à une minute sur une période maximale de 3 semaines.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’irradiation, l’anesthésie, la transplantation de cellules hématopoïétiques, les injections sous-cutanées et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale peuvent engendrer du stress chez la souris. Le développement d’une hématopoïèse pathologique peut également engendrer des modifications des constantes hématologiques avec notamment une augmentation de plaquettes et/ou de l’hématocrite, qui peuvent à terme générer de la fibrose et une diminution de production des cellules sanguines, ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. Durant le développement des hémopathies PV, TE, MF la prise de poids des animaux est réduite.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les analyses de la fibrose de la moelle osseuse ce font par examen histopathologiques des fémurs ce qui nécessite l’euthanasie des animaux à la fin de chaque expérimentation. Seuls les animaux reproducteurs seront maintenus en vie. En effet, si le modèle murin d’invalidation de PPARy dans les cellules stromales médullaires apporte les résultats escomptés, il pourra être utilisé pour d’autres hémopathies ou pour des questions plus fondamentales d’étude de la communication entre le microenvironnement et les cellules hématopoïétiques. Il constituera donc un intérêt pour la communauté scientifique et pourra être pérennisé.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Au cours de ce projet, une grande partie des expériences seront menées in vitro, cependant en raison de la complexité et du nombre d’intervenants cellulaires et matriciels composant le micro-environnement médullaire et régulant l’hématopoïèse, il est actuellement impossible de mimer la physiologie médullaire par des modèles exclusivement in vitro. Nos modèles in vitro seront donc utilisés autant que faire se peut afin de mettre au point les protocoles et de générer les résultats préliminaires, mais ils nécessitent néanmoins d’être validés dans des modèles in vivo murins dans un second temps. D’autre part, ce projet a pour objectif de caractériser la pertinence du ciblage thérapeutique de PPARy dans la myélofibrose. Il est donc important de valider sa fonction dans des modèles murins précliniques, validés et reconnus, de cette pathologie.
2. Réduction
Dans l’ensemble des expérimentations associées à cette demande les animaux sont hébergés en groupe (n=5 individus par cage). Nos expériences précédentes nous ont montré que pour une condition expérimentale en analyse non-paramétrique un minimum de deux boites (dix individus) était nécessaire. Le nombre d’expérimentations indépendantes pour chaque condition est réduite à 2 (pour vérifier la reproductibilité entre expérience). Lorsque cela était possible, nous avons choisi de réaliser des greffes compétitives. Cette stratégie présente deux avantages, 1) elle augmente la sensibilité en permettant de comparer les conditions au sein d’un même individu ce qui réduit dans les analyses de groupe la variation inter-individu et permet de réduire les effectifs, 2) chaque individu étant son propre contrôle cela permet de supprimer le groupe contrôle et de limiter encore le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les souris seront hébergées en groupe, avec des éléments d’enrichissement. Elles seront surveillées régulièrement pour limiter tout mal-être éventuel en accord avec les critères d’évaluation de l’état général des animaux. Certains critères biologiques spécifiques comme le taux l’hémoglobine seront également monitorés et pris en compte comme point limite. Les interventions de transplantation seront pratiquées sous anesthésie générale et analgésie en limitant la durée de l’anesthésie et en assurant un maintien de la température corporelle grâce à un tapis chauffant et de l’hydratation des yeux grâce à un gel oculaire. Les animaux sont traités par antibiotiques durant les 3 semaines post-transplantation pour limiter le risque d’infection. Les prélèvements de sang seront faits par voie sub-mandibulaire afin d’être le moins douloureux possible et seront espacés d’au moins 3 semaines.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle rongeur nous semble le plus adapté car c’est historiquement un modèle de prédilection pour l’étude de l’hématopoïèse. C’est un modèle bien établi, validé par la communauté scientifique, et qui fait l’objet de nombreuses publications scientifiques. Les modèles précliniques des différentes hémopathies étudiées, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la thrombocytémie essentielle (TE), la polyglobulie de Vaquez (PV) et la myélofibrose (MF) sont établis dans le modèle rongeur. Travailler sur la même souche murine apporte une pertinence à la comparaison entre nos données. Que cela soit pour obtenir une meilleure prise de greffe, ou pour avoir la possibilité de suivre le développement de la pathologie au cours du temps, nous devons utiliser des animaux jeunes (8 semaines).