Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 07/02/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-490363)
2 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère pour plus de la moitié. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie nasale sous anesthésie puis suivies jusqu’à quatorze jours, pour tester des peptides antimicrobiens issus d’invertébrés et mesurer leur toxicité. Le porteur indique surveiller perte de poids, prostration et tremblements, et prévoit de tuer les souris avant l’apparition des signes de morbidité. Il affirme qu’aucun système in vitro ne reproduit l’infection pulmonaire et que la souris constitue un « modèle incontournable ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est de valider l’utilisation des Peptides Antimicrobiens (PAM), antibiotiques naturels, produit par des invertébrés issus d’environnement extrême. Ces PAM ont des propriétés physico-chimiques originales qui pourraient créer de nouveaux médicaments actifs, dirigé contre les infections pulmonaires. En amont des expérimentations animales, des expériences menées in-vitro ont permis de démontrer que certains peptides antimicrobiens issus d’environnement extrême, notamment certains membres de la famille des BRICOS-PAM ont obtenus d’excellentes valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) contre six pathogènes bactériens hautement virulents et résistants aux antibiotiques) ainsi qu’une thermostable (toujours actifs après 1h à 90 °C), pas activité hémolytique, activité anti-biofilm et une absence de toxicité sur lignées cellulaires. De ce fait, les résultats donnent une fenêtre thérapeutique très large. Cependant, il reste à évaluer son activité (pharmacologie), décrire son comportement et le devenir de la substance dans un organisme vivant (pharmacocinétique, PK) et déterminer le degré de toxicité (dose maximum tolérée, DMT) dans un organisme. Dans un premier temps, pour évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments sur des modèles infectieux pulmonaires pathogène (notamment des genres Pseudomonas), une preuve de concept (POC) sera mise en évidence. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Détermination de la dose du PAM à administrer par voie pulmonaire, intraveineuse ou par voie intrapéritonéale aux souris pour déterminer la meilleure fenêtre thérapeutique. Connaissance de la stabilité et du devenir de chaque composé dans les organes de la souris après une ou plusieurs administrations. Validation chez la souris de l’effet thérapeutique curatif des composés contre une infection Pseudomonas aeruginosa.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour les procédures « détermination du degré de toxicité » et « la pharmacocinétique », les composés seront administrés par voie intranasale ou par voie intraveineuse 1 fois par expérience sous anesthésie. L’infection des souris avec Pseudomonas est réalisée par voie intranasale sous anesthésie, 1 fois par expérience de preuve de concept (POC). Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés une ou deux fois par 24h sous anesthésie pour la POC. Les animaux après infection seront suivis jusqu’a 14 jour maximum
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Lors de la détermination du degré de toxicité et de la pharmacocinétique, les souris des temps courts (5, 15, 30 et 60 min) seront étroitement surveillées pendant la première partie du protocole puis surveillées toutes les deux heures par jours par la suite (pour les temps supérieurs à 2h) pour observer l’absence de douleur, de lésions et de maladie. Lors de ces observations la perte de poids sera également surveillée. Dans le cas où l’injection des composés testés entrainerait tout changement de comportement : prostration, tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d’aspect physique externe une grille d’évaluation a été mise en place. Pour limiter la peur et le stress physique de l’injection du composé cela sera fait sous anesthésie. Pour limiter la peur, la détresse et le stress physique de l’infection, les souris seront infectées une seule fois par voie intra-nasale en début de protocole expérimental (n°4) , après anesthésie à l’isoflurane 2% et leur état physique et comportemental sera évalué.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d’expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Seules les études in vivo permettent de déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution d’un composé, ainsi que son efficacité face à une infection pulmonaire aigüe. L’efficacité chez la souris constitue un prérequis avant toutes phases cliniques sur l’homme. A ce jour, aucun système in vitro ne permet à ce jour d’englober tous les aspects de l’interaction hôte-pathogène qui aboutissent à une infection pulmonaire aigüe. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable. En amont, la démonstration de la validité scientifique de méthode in vitro sera effectué sur lignées cellulaires, notamment pour tous les aspects de toxicité.
2. Réduction
Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, poumon, reins, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement analysables. La taille minimale de groupe nécessaire pour mener spécifiquement à bien la procédure a été faite. Ce nombre d’individus tient compte de la précision des mesures et de la différence statistique significative entre animaux témoins et animaux testés. Les tests seront réalisés de façon séquentielle plutôt que simultanés. De plus, le premier type d’étude nous permettra de réduire le nombre d’animaux pour les études deux et trois.
3. Raffinement
Le stress ayant une influence directe sur les mesures réalisées, le bien-être des animaux est impérativement pris en compte à chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toutes douleurs, souffrances, angoisses ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : Les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés. De façon à réduire le stress, l’inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l’infection ou l’injection du peptide. De plus, la surveillance sera accrue, de façon quotidienne, selon les procédures. L’apparence physique, le poids, l’alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plutôt possible une éventuelle morbidité. Des grilles de signes cliniques ont été établies et seront utilisées pour évaluer un « score » de douleur et permettre d’évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum à 14 jours post-infection, avant l’apparition des signes de morbidité. Si des signes de morbidité sont observés, les points de cinétiques seront revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocement par rapport à celles initialement prévues.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris possède d’importantes similitudes génétiques (98% des gènes sont communs à l’Homme) mais aussi immunologiques, physiologiques et pathologiques. Une très bonne connaissance anatomique et physiologique et de nombreux outils sont disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre les cellules immunitaires, des cytokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. La faible variabilité intra-individuelle et interindividuelle est à prendre en compte. De nombreuses pathologies infectieuses expérimentales ont été validées, notamment lors d’infection par Pseudomonas aeruginosa chez les modèles murins et notamment en C57BL/6 et BALB/c. La différence de gravité de l’infection pulmonaire induite par Pseudomonas aeruginosa peut être déterminée par des différences dans les réponses inflammatoires de l’hôte. Le choix de la souche sera effectué en fonction du choix de l’étude la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire. Dans un modèle de pneumonie chez la souris simulant également les concentrations pulmonaires mesurées chez l’Homme. Les modèles chez la souris ont permis d’établir l’efficacité in vivo des molécules mais aussi d’en évaluer les critères d’efficacité microbiologique d’un point de vue pharmacodynamique, indispensable à l’optimisation des doses chez l’Homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8 semaines au moment de la procédure expérimentale. Les souris possèdent un poids d’environ 21g à 8 semaines. Chez les souris, le mâle atteint sa maturité sexuelle à l’âge de 8 semaines et la femelle à seulement 7 semaines. Cet âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.