Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 22/12/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-505710)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le microbiote, c’est-à-dire la flore bactérienne intestinale non pathogène, joue un rôle essentiel non seulement dans l’assimilation des résidus alimentaires non digestibles, mais aussi dans la protection de certaines infections en dialoguant avec le système immunitaire de l’hôte. Il est donc essentiel, au même titre que les cellules intestinales, à la santé humaine et vétérinaire. Ce projet a pour objectif de créer des lignées de lapins présentant une modification génétique ciblée, grâce à une nouvelle méthode qui utilise des cellules souches modifiées en laboratoire, injectées dans de jeunes embryons. Le gène que nous cherchons à désactiver, produit normalement une protéine présente dans les cellules de l’intestin, chez plusieurs espèces de mammifères. Cette protéine pourrait jouer un rôle important dans différentes fonctions intestinales et donc intervenir dans la régulation de l’environnement intérieur de l’intestin et influencer le microbiote qui est un acteur clé dans la physiologie digestive. Le gène étudié n’étant pas présent chez la souris, le lapin représente le seul modèle expérimental possible pour ces analyses, car les mini-organes intestinaux créés in vitro ne représentent pas encore la complexité des interactions entre microbiote et cellules de l’intestin. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs (EU1 et EU2) qui conjuguent leurs expertises.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les retombées attendues de ce projet sont de trois ordres. Le premier est la validation de l’utilisation de cellules souches pour produire des lapins transgéniques, technique disponible actuellement uniquement chez les rongeurs. Le second est le développement de cette méthode pour produire des lapins modèles de maladie humaine ou de thérapie cellulaire. Enfin le troisième est la création d’un modèle animal permettant l’étude des fonctions physiologiques des cellules intestinales exprimant le gène d’intérêt dans la régulation du microbiote et de l’environnement intérieur de l’intestin.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
injections d’hormones durant 3 secondes chacune (2 minutes maximum avec la contention) sur 4 jours, 50 femelles (EU1); 2. Insémination artificielle des lapines vigiles: 1 fois par lapine, durée de la contention et de l’intervention 5 minutes maximum, 50 femelles (EU1); 3. Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l’opération 1h15 jusqu’au réveil, 30 lapines prévues (EU1); 4. Echographie sur lapines vigiles: 1 fois par lapine opérée, durée de la contention et de l’échographie 10 minutes maximum (EU1); 5. Prélèvements de salive, de sang et éventuellement de peau sur lapereaux vigiles d’un mois avec anesthésie locale : 1 fois par animal, durée de l’expérimentation 5 minutes (25 minutes avec le temps d’action maximal de la pommade anesthésiante), 260 lapereaux (EU1 et EU2).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les lapines subiront de faibles douleurs liées aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants avec une durée de contention de 2 minutes. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles avec une durée de contention de 5 minutes maximum et des douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire (durée 1h15 jusqu’au réveil). Les lapereaux sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles, avec une durée de contention un peu stressante de 25 minutes maximum (10 à 20 minutes pour l’effet de la pommade anesthésiante et 5 minutes d’intervention). Les responsables de ce projet resteront attentifs à l’apparition de problèmes digestifs ou de douleurs chez les lapins dépourvus du gène d’intérêt.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les lapines productrices d’embryons seront euthanasiées pour récupérer les embryons de 1,5 jours. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d’embryons. Seules, les femelles issues des transferts d’embryons microinjectées avec des cellules souches modifiées seront utilisées pour produire les lignées de lapins dépourvus du gène d’intérêt, les mâles seront eux, à ce stade, euthanasiés. La création de ces lignées de lapins nécessitera ensuite deux générations de croisement de lapins porteurs ou non du gène d’intérêt, avec une sélection après génotypages des animaux à garder ou à euthanasier. Les lapereaux issus de ces croisements et dépourvus du gène d’intérêt seront alors euthanasiés pour les études des fonctions de ce gène.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le projet nécessite l’utilisation d’animaux puisqu’il vise à créer des lignées de lapins dépourvues d’un gène d’intérêt. Cependant l’utilisation de cellules souches permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés, car l’élimination du gène peut être vérifiée et validée in vitro avant la microinjection des cellules dans les embryons, contrairement aux techniques classiques basées sur des manipulations génétiques réalisées directement sur les embryons. De plus, les cellules de l’intestin exprimant le gène d’intérêt ne peuvent être étudiées qu’in vivo, car les modèles in vitro de type mini-organes ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de tube digestif et de son interaction avec le microbiote. Il n’existe donc pas d’alternatives à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène d’intérêt dans le dialogue entre les cellules de l’intestin et le microbiote.
2. Réduction
Le recours aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire des embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons des lapines ayant déjà eu des lapereaux pour transplanter des embryons, ce qui permettra d’éviter d’employer des lapines présentant des problèmes de nidation ou d’allaitement lors des transferts embryonnaires. Enfin, à chaque étape du projet, les expériences seront réalisées de façon séquentielle sur un petit nombre d’animaux, puis seront renouvelées uniquement si les résultats obtenus sont insuffisants pour poursuivre le projet.
3. Raffinement
Les injections nécessaires aux différentes procédures seront faites de préférence par voie sous-cutanée, moins douloureuse que par voie intramusculaire. Dès que possible (pour 1 à 3 femelles puisque nous hébergeons 3 mâles), des accouplements naturels seront réalisés à la place des inséminations artificielles pour éviter du stress et de la douleur aux femelles. Les lapines opérées seront placées par deux dans une cage propre à leur réveil. Elles seront surveillées deux fois par jour par des animaliers qualifiés et bénéficieront d’un régime alimentaire amplifié avec des croquettes adaptées, à volonté à partir du second tiers de leur gestation. Après vérification des gestations par une échographie de contrôle, les lapines seront déplacées pour être seules par cage et une boite à nid adaptée aux cages sera ajoutée 5 jours avant la mise-bas, ainsi que du papier absorbant qui leur servira à amorcer la préparation de leur nid fait avec leurs poils. Après la mise-bas, une surveillance de l’allaitement et du bien-être des lapereaux sera faite chaque matin, avec le recours à une adoption ou à une supplémentation par biberon en cas de défaillance ou d’agression de la mère. Les lapereaux seront maintenus avec leur mère jusqu’à leur sevrage, soit entre 6 à 8 semaines, puis les mâles et les femelles seront séparées. Les lapereaux issus des transferts embryonnaires seront transportés dans la seconde animalerie, par camion agréé, sous température régulée, en plaçant deux à trois lapereaux par carton à air filtré contenant du foin et un bloc d’hydrogel. Toute manipulation sera effectuée de mamnière douce, après habituation progressive des lapins aux contacts humains (animaliers et expérimentateurs). Lors de l’application des procédures expérimentales et des mises à mort, des analgésiques et/ou anesthésiants seront utilisés, afin de réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. De même, une surveillance adaptée avec une grille de score et des points limites ont été définis pour chaque procédure et seront appliqués par des animaliers qualifiés qui surveilleront les lapins quotidiennement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le but du projet est de créer des lignées de lapins dépourvus d’un gène d’intérêt impliqué dans la physiologie digestive. L’intérêt de l’espèce lapin est de deux ordres : d’une part la création d’un modèle expérimental, puisque la souris ne peut être utilisée, le gène d’intérêt étant absent chez les rongeurs ; et d’autre part la validation de la technique employant des cellules souches pour créer des animaux modèles, qui a été récemment développée chez le lapin. Dans ce cadre, le lapin présente de nombreux avantages comme sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. Il est physiologiquement et génétiquement apparenté à l’Homme, et présente un développement embryonnaire et une organisation du placenta identiques à ceux des primates. De ce fait, l’utilisation de cellules souches de lapin faciliterait la création de modèles de maladies humaines et de réacteurs biologiques, des lapins capables de produire des molécules pharmaceutiques dans leur lait. Enfin, ce projet est réalisé en collaboration avec un laboratoire qui s’intéresse au gène étudié dans différentes espèces, dont le lapin qui exprime ce gène dans 5% des cellules de son tube digestif. Une partie des animaux sera utilisée en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 5 et 36 mois pour les femelles. L’autre partie sera utilisée précocement, soit à 18 jours ou 5 à 6 semaines, pour le génotypage ou les études des fonctions du gène étudié.