Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/06/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-525480)
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du modéré au sévère, 284 d’entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées sans réveil. Une partie subit une ischémie du foie provoquée en ligaturant l’apport sanguin pendant soixante minutes après ouverture de l’abdomen, avant reperfusion puis mise à mort, d’autres une perfusion hépatique menée jusqu’au décès ou une péritonite provoquée. Le porteur ne mentionne comme atteinte qu’une douleur post-opératoire prise en charge, alors que 376 souris sont classées en gravité sévère. Il affirme qu’aucune méthode ne reproduit in vitro ce phénomène complexe et revendique le caractère « indispensable » du modèle murin pour les validations précliniques.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appeler ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Sur le plan physiopathologique, les lésions hépatiques d’IR sont caractérisées par un important infiltrat à polynucléaires neutrophiles (PNN) dans les zones de nécrose hépatocytaire. Ces neutrophiles migrent dans le foie sous l’effet de facteurs chimioattractants afin d’exercer sur le site de l’agression leurs fonctions de phagocytose et de défense antibactérienne. Dans le cas de l’IR, les neutrophiles vont avoir un effet délétère en étant responsables des lésions hépatiques. Notre équipe a récemment montré que NOD1, un récepteur des composés bactériens, était un régulateur intrinsèque indispensable aux fonctions de migration et de phagocytose du PNN. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appelé ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Pour faire face à ce problème majeur de santé publique, il est indispensable de mieux le comprendre. Cela nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme et donc l’usage des modèles animaux. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR. Cette étude nécessite des approches in vivo et ex vivo chez la souris. Elle nécessitera également des souris invalidées pour le gène NOD1. Des tests de puissance ont permis de calculer au plus juste le nombre d’animaux indispensable. Les cellules isolées de souris seront utilisées dans plusieurs expérimentations ex vivo afin d’optimiser leur utilisation. Si de nouveaux outils in vitro apparaissent, ils seront utilisés en remplacement des animaux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : 1-une perfusion hépatique : après anesthésie profonde, le foie est perfusé jusqu’à ce qu’il blanchisse (quelques minutes), puis les veines sus hépatiques, caves et l’aorte sont sectionnées pour permettre l’évacuation des effluents (Cela induit alors la mort de l’animal). A la fin de la perfusion, le foie est prélevé afin d’isoler les hépatocytes. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection de modulateurs de NOD1 ou d’un excipient. 2-une péritonite stérile est induite chez les animaux afin d’isoler les neutrophiles péritonéaux qui seront ensuite utilisés dans des expériences ex vivo. Les animaux sont mis à mort 18h après l’induction de la péritonite stérile. 3-une ischémie-reperfusion du foie. Après anesthésie, la peau de l’abdomen et le péritoine des animaux seront incisés sur 1 cm, le foie externalisé, les lobes médians et latéral gauche seront ligaturés afin d’arrêter l’apport sanguin. Au bout de 60 minutes, la ligature sera retirée puis le foie reperfusé sera replacé dans l’abdomen. 8h ou 18h après levée de la ligature, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour réaliser un prélèvement sanguin, puis directement mises à mort afin de prélever le foie pour analyses ultérieures. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection d’un activateur de la voie NOD1 ou d’un excipient.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La chirurgie est par essence à l’origine de douleurs post-opératoires qui seront prise en charge par un protocole de traitement anti-douleur adapté.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans les 3 procédures décrites, tous les animaux seront mis à mort, et leurs organes seront prélevés en vue d’effectuer des analyses histoloiques, de biologie cellulaire et moléculaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’ischémie-reperfusion est un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires à l’échelle du tissu. Il n’existe pas de méthode capable de reproduire in vitro ce processus physiologique. Par ailleurs, les molécules qui seront injectées aux souris auront été préalablement testées in silico et in vitro. Seules les molécules les plus efficaces seront testées chez les animaux.
2. Réduction
Les effectifs sont calculés à partir de données de la littérature et de données personnelles.
3. Raffinement
Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance animale (Raffiner). Lors de la chirurgie, les animaux recevront une anesthésie/analgésie avant le début de la chirurgie. Un anesthésique sera appliqué localement. Les animaux recevront, après la chirurgie, une injection d’antalgique toutes les 12h. Les animaux seront par ailleurs observés durant 15 à 30 min après la chirurgie, puis au bout de 2h jusqu’au réveil complet. Dans tous les cas, les animaux ne sont pas maintenus en vie plus de 24h après chirurgie. En cas de signes de douleurs : poil hérissé, absence de mouvement, baisse significative de l’activité motrice et/ou une perte de poids supérieure ou égale à 15% de la masse corporelle, les animaux seront euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle d’ischémie hépatique chez les souris est très bien décrit dans la littérature et est indispensable aux validations pré cliniques de candidats médicaments. De plus, pour décortiquer les mécanismes à l’origine de ce phénomène nous aurons besoin de modèles génétiquement modifiés uniquement disponible chez la souris. Enfin, la souris est le plus petit mammifère dans l’échelle de l’évolution parmi les modèles animaux. Les animaux utilisés auront entre 7 et 14 semaines car c’est l’âge optimal pour un développement reproductible des phénomènes d’ischémie-reperfusion.