Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-557914)
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Une partie est irradiée puis greffée de moelle osseuse et reçoit des injections de molécules pro-inflammatoires, tandis que les reproducteurs sont mis à mort après six mois d’accouplement et les animaux au génotype non recherché également éliminés. Le projet étudie le rôle du facteur PLZF dans le vieillissement du système sanguin, ou « inflammaging ». Le porteur affirme que le dialogue entre cellules souches et microenvironnement ne peut être reproduit et rend le « modèle murin » impossible à remplacer.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines (dans un processus appelé hématopoïèse) subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d’hémopathies. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons montré que le facteur de transcription PLZF est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin. PLZF participe à la régulation du compartiment des cellules souches hématopoiétiques (qui sont à l’origine de toutes les cellules du sang) et est associé à l’augmentation de certaines sous-populations que nous avons identifiées comme des cellules préactivées dans des voies de signalisation impliquées dans l’inflammation. Ces résultats suggèrent que PLZF pourrait être un acteur clé dans le vieillissement du système sanguin lié à l’inflammation chronique. Notre projet propose d’élucider le rôle de PLZF dans la physiologie du vieillissement des cellules sanguines soumises à des processus inflammatoires. Nous souhaitons donc étudier en détail les effets d’une inflammation chronique sur les différents types de cellules hématopoïétiques (notamment les cellules souches et les progéniteurs) ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles dans des modèles murins où l’expression de PLZF est altérée.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d’hémopathies. Le vieillissement du système sanguin est notamment lié aux inflammations subies tout au long de la vie de l’individu, processus connu sous le nom d' »inflammaging » qui favorise l’émergence d’hémopathies malignes. Nous souhaitons élucider certains mécanismes responsables de ce processus, pour mieux comprendre les causes du développement des hémopathies et cibler les acteurs clés de ce phénomène.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. L’anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d’environ 6-7 minutes. La greffe de cellules de moelle osseuse qui s’ensuit est réalisée sous anesthésie gazeuse d’une durée de 3 à 4 minutes. Les animaux seront soumis à des injections de molécules pro-inflammatoires (durée 1 à 4 semaines, injection 3 fois par semaine) nécessitant chacune quelques secondes d’intervention sur animal vigile.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. Les animaux recevront des traitements par des molécules inflammatoires. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation suivie d’une transplantation de moelle osseuse sous anesthésie gazeuse. L’irradiation est réalisée au sein d’un appareillage bruyant, ce qui peut être source de stress. Lors de ces transferts adoptifs, l’irradiation et le délai de reconstitution entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l’administration d’une antibiothérapie maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Les animaux seront soumis à des observations et pesées quotidiennes, qui peuvent être source de stress.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Ce projet nécessitera 456 souris. Les animaux reproducteurs sont mis à mort à l’issue de la période de 6 mois d’accouplement qui permet de générer les animaux de génotype d’intérêt. Les animaux ne présentant pas les génotypes d’intérêt sont également mis à mort. Les animaux d’intérêt utilisés dans ce projet sont mis à mort à l’issue des procédures à des fins d’analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques, lequel implique des mécanismes largement dépendants d’une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux (cytokines, molécules d’adhésion). Ce dialogue permanent entre la cellule souche hématopoïétique et son microenvironnement nécessite d’avoir recours aux modèles murins qu’il n’est donc pas possible de remplacer actuellement.
2. Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux grâce à l’utilisation des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre expérience passée nous a permis d’estimer le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un nombre suffisant de cellules souches et progéniteurs (populations rares) pour les analyses pré-citées, et nous permet d’avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
3. Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage et en mettant à disposition de la nourriture humide. Tous les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et expérimenté, le cas échéant sous anesthésie gazeuse (injections et prélèvements sanguins).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l’utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, à partir de 6-7 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures. Les greffes par transfert adoptif s’effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 âgés de 7 à 8 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe .