Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 30/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-610306)
Section définitive du nerf sciatique pour une partie, pincement du nerf par mini clamp pour l’autre : 54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour prélèvement d’organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L’opération vise à savoir si le stress oxydatif lié à la dénervation altère la capacité des cellules satellites à régénérer le muscle. Le porteur décrit cette chirurgie comme « modérément invasive » comparée à une chirurgie abdominale, et souligne que les souris, quadrupèdes vivant à ras du sol, sont peu invalidées par la perte d’usage d’une patte arrière. Il conclut que le recours à la souris est « indispensable », la mise en culture des cellules satellites leur faisant perdre l’état de quiescence qu’il veut étudier.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Il a été décrit que pendant la dénervation, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif et nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier les capacités régénératives des myoblastes. Notamment, un dommage oxydatif chimiquement induit diminue la capacité de fusion et d’accrétion de cellules dérivant des cellules satellites musculaires. Les cellules satellites sont quiescentes in vivo et elles peuvent être isolées du muscle adulte. Une fois en culture, elles perdent leur statut quiescent pour proliférer en myoblastes. Actuellement les conséquences sur les cellules satellites du stress oxydatif lié à la dénervation sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation. La base du matériel biologique étudié correspond aux muscles innervés par le nerf sciatique. Notre projet a donc 3 objectifs principaux : 1. Évaluer l’ampleur du dommage oxydatif dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation par marquage des espèces réactives de l’oxygène (ROS), mais aussi à l’aide de marquages fluorescents spécifiques visualiser les modifications chimiques de l’ADN, et les modifications des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN en particulier au niveau des nucléoles lieu de synthèse des ARN ribosomiques. 2. Évaluer la réparation des dommages oxydatifs dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation à différents temps après la dénervation. La réparation sera évaluée par la disparition des signaux observés dans le point 1 3. Mesurer l’index de fusion des cellules satellites après dénervation, par mise en culture et différentiation. 4. Mesurer l’accrétion des cellules satellites après dénervation, par marquage fluorescent de leur ADN et co-culture avec des myotubes non marqués. L’ensemble des tissus prélevés seront soumis à des analyses, en imagerie à fluorescence, éventuellement biochimiques par extraction de protéines et d’extraction/isolement des cellules satellites pour leur mise en culture in vitro
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif conséquence de la dénervation va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des ROS, thérapies anti-oxydants, lignes directrices nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact très limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une partie des souris subira par chirurgie une dénervation définitive par section du nerf sciatique et une autre partie un pincement du nerf permettant une dénervation réversible.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on la compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et locale du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. La dénervation par pincement du nerf sciatique reprend les éléments de chirurgie de la dénervation définitive, la section du nerf étant remplacé par son pincement à l’aide d’un mini clamp hémostatique. 15 jours après pincement du nerf les souris commencent à retrouver une mobilité quasi normale qui est complète à 30 jours, seule persiste une atrophie musculaire comme observée lors de la dénervation définitive. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.
2. Réduction
La première phase du projet portant sur le comportement des cellules souches musculaires à fusionner ou s’agréger in vitro après dénervation a pu être réalisée en limitant à 18 le nombre de souris initialement prévu et a permis une bonne robustesse de nos observations. Dans la deuxième phase, où nous nous sommes rendu compte de la faible durée de conservation des muscles fixés pour des signaux histologiques de qualité, nous estimons nécessaire l’utilisation de 36 souris pour satisfaire l’ensemble des analyses à réaliser comprenant des analyses histologiques en immunofluorescence sur des fibres musculaires isolées. Ces considérations nous permettent de maintenir à 54 le nombre de souris.
3. Raffinement
Grâce aux précautions prises lors de l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses analgésiques et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leur congénère non traités Les animaux seront élevés en groupe avec une litière adaptée et quelques éléments d’enrichissement avec pas plus de 5 individus par cage aux dimensions adaptées, et observés quotidiennement par les personnels de l’établissement utilisateur de façon à pouvoir intervenir le plus rapidement possible pour limiter la douleur ou souffrance e. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage. Pour respecter le mode de vie grégaire de l’espèce, des souris compagnons de même lignée, âge et sexe seront ajoutés quand ce sera nécessaire pour éviter l’isolement des souris en expérimentation.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.