Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 30/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-648846)
702 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour prélèvement des organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes subissent un prélèvement du bout de la queue pour génotypage, puis des injections intrapéritonéales et jusqu’à six prélèvements sanguins en sous-mandibulaire étalés sur cinquante jours. Un lot est infecté par un virus qui provoque une perte de poids pendant les sept jours suivants, le reste étant vacciné avec la même souche pour comparer réponse infectieuse et réponse vaccinale. Aucune analgésie n’est prévue avant l’atteinte d’un score de douleur de 10, le porteur affirmant que les analgésiques créeraient un biais expérimental et que sa table de score est « stricte pour éviter toute souffrance animale ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Suite à une infection ou une vaccination certains globules blancs peuvent se différencier en cellules qui produisent des anticorps, les plasmocytes (PC) de courte durée de vie ou de longue durée de vie. Dans le premier cas, les PC vont sécréter des anticorps de faible affinité pour le pathogène et ces cellules meurent dans les 3 à 5 jours après leur genèse. Dans le second cas les PC seront aptes à produire des anticorps hautement spécifiques du pathogène et pourront perdurer plusieurs années voir toute la vie dans la moelle osseuse. Depuis la moelle osseuse ils vont sécréter de grandes quantités d’anticorps qui sont essentiels pour une protection efficace et de longue durée contre les infections. Leur rôle est central dans les réponses vaccinales et l’efficacité de ces réponses est mesurée sur la base de leur production d’anticorps. Cependant il est maintenant bien établi que les PC générés lors d’une vaccination se maintiennent moins bien que ceux générés lors d’une infection. La protéine CD93 a été montré comme nécessaire pour le maintien des plasmocytes à longue durée de vie, cependant son rôle fonctionnel dans ces cellules reste à établir. L’objectif de ce projet est donc d’étudier de façon détaillée le rôle de CD93 sur la réponse immune humorale. L’étude sera réalisée sur le modèle murin délété entièrement ou pour partie de CD93 (CD93-/- et CD93+/- respectivement), ne présentant pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons ce modèle pour analyser les réponses immunes primaires et mémoires après immunisations ou vaccination dans nos deux modèles expérimentaux (souris CD93-/- et CD93+/-). In fine ces travaux permettront d’apporter de nouveaux éléments en vu d’améliorer les stratégies vaccinales.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de la biologie des plasmocytes. Ces cellules encore trop considérées comme une seule et unique population souffrent de méconnaissance et d’un manque de thérapies ciblées. L’étude de ces souris permettra d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de la complexité de cette population cellulaire, de leurs régulations et maintien. Cette caractérisation fondamentale est essentielle pour apporter à court terme des éléments d’améliorations aux stratégies vaccinales et appréhender l’étude des plasmocytes dans un contexte pathologique à plus long terme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux décrits dans le projet subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer le génotype des animaux. Dans la procédure 1 les animaux subiront une injection en intrapéritonéal d’une molécule non pathogène permettant de tracer les cellules spécifiques de cette molécule. Pour la procédure 2, nous comparerons réponses infectieuse et vaccinale vis-à-vis d’un même virus. Un lot de cette procédure fera l’objet d’une infection virale. Les souris restantes (majoritaires) de cette procédure seront vaccinées avec la même souche virale. Les animaux de ces différentes procédures seront également soumis à des prélèvements sanguins sur souris vigiles en sous mandibulaire. Pour la procédure 1, les souris étudiées dans le cadre d’une réponse secondaire (lot 2) seront prélevées 4 fois et celles utilisées pour une réponse mémoire (lot 3) 5 fois durant les 50 jours de la procédure. Pour la procédure 2, les souris des lots 1 et 2 seront analysées 21 jours après l’infection/vaccination et les prélèvements sanguins auront lieu à J0, J+7 et J+14. Pour la procédure 2, les souris des lots 3 et 4 seront analysées 60 jours après la vaccination et les prélèvements sanguins auront lieu à J0, J+7, J+14, J+21, J+28 et J+35.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans ce projet nous utiliserons les animaux délétés partiellement ou totalement de CD93 ce qui nécessitera une procédure de génotypage et donc un prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux. Sur les 3 procédures engagées dans ce projet 2 sont de classe modérée et une de classe sévère. Pour les procédures de classe modérée les effets indésirables potentiels sont très restreints. Pour ces procédures la douleur maximale est le jour de l’immunisation et ne dépasse pas la douleur induite par la piqure. Pour la procédure de classe sévère, les animaux sont infectés avec un virus. Cette infection va conduire au développement de la pathologie qui va notamment engendrer une perte de poids durant les 7 jours suivant l’infection. Ce symptôme est le plus sévère de la procédure.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes lymphoïdes seront prélevés pour analyse
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les réponses immunes sont des processus complexes dépendants de nombreux types cellulaires et de l’organisation tridimensionnelle des organes lymphoïdes. Il est donc nécessaire d’avoir un organisme vivant entier pour cette étude afin de reproduire toutes les interactions in vivo entre les différents types cellulaires impliqués dans ces processus. Cette approche nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de la réponse vaccinale afin de pouvoir l’améliorer chez les individus à risque (patients immunodéprimés ou atteints de cancer, population âgée, nourrissons) mais aussi de l’inhiber dans les patients atteints de maladie autoimmune.
2. Réduction
De façon à minimiser le nombre d’animaux utilisé nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d’un animal (récupération dans une seule expérience des fémurs, hanches et tibias des souris afin de réaliser des analyses en cytométrie en flux sur les fémurs, des études transcriptomiques sur les hanches et de l’histologie sur les tibias ; les rates sont coupées en 2 pour les mêmes raisons.) Afin d’obtenir des résultats statistiquement, nous avons calculé a priori l’effectif nécessaire. Dans notre cas, 9 animaux par groupe seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
3. Raffinement
Afin de réduire la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d’abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé. Un suivi quotidien (par les animaliers ou les expérimentateurs au cours des procédures expérimentales) des animaux est réalisé. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir de la table de score des points limites (annexe) est supérieur ou égale à 10. Une analgésie des animaux n’est pas prévue avant l’atteinte du point limite 10. Ces animaux étant utilisés pour des procédures visant à étudier le système immunitaire, les analgésiques créeraient un biais expérimental rendant les résultats inexploitables, de ce fait notre table de score est stricte pour éviter toute souffrance animale. Cependant pour les scores inférieurs à 10, différentes actions seront mises en place: 10 > score ≥ 6: nourriture humidifiée dans la cage 6 > score ≥ 4: nourriture dans la cage 4 > score ≥ 0: suivi quotidien augmenté à 2 visites journalière pour vérifier que les points limites n’évoluent pas défavorablement
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La souris mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, un modèle transgénique pour notre protéine d’intérêt existant justifie encore plus le choix du modèle murin. Concernant le gène étudié ici il y a plus de 90% d’homologie de séquence entre l’homme et la souris. Les modèles d’immunisation sont bien décrits et ne nécessitent donc pas d’être ré-établis limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Enfin nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Les souris seront âgées de 8 à 16 semaines, âge auquel le système immunitaire est totalement développé et fonctionnel.