Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-651403)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact de PB1-F2 dans la pathogénicité de souches de virus influenza aviaires (souches H5N8). Le projet est très novateur car il vise à déterminer les bases moléculaires de la pathogénicité associée à PB1-F2 dans des modèles animaux pertinents, ici le modèle murin. Les virus mutants seront générés grâce au système de génétique inverse que nous maitrisons dans le laboratoire puis éprouvés en modèle souris en termes de morbidité (mesure des signes cliniques et analyses anapathologiques) et de mortalité. L’objectif ultime étant d’être capables de mieux prédire le potentiel pandémique d’une souche de VIA émergente (VIA = virus influenza de type A).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les virus influenza représentent un problème majeur en santé publique comme en santé vétérinaire. Les virus influenza de type A (VIA) sont à l’origine de zoonoses, c’est-à-dire qu’ils sont capables de franchir les barrières d’espèce et d’infecter un large spectre d’hôtes allant des oiseaux aquatiques (constituant le réservoir viral) à d’autres espèces aviaires (oiseaux de rente, volailles) mais également des mammifères dont l’Homme. Depuis 2013-2014, le monde est frappé par une panzootie due à l’émergence d’une nouvelle constellation virale H5Nx dérivant des virus H5N1 de 2003. Les virus H5Nx ne cessent de se diversifier génétiquement et causent d’importantes pertes économiques et des campagnes d’abattages massifs (déjà 16 millions de volailles abattues en France cette année). PB1-F2 est un facteur de virulence des VIA. Notre projet s’appuie sur l’étude de ces souches directement issues du terrain. L’objectif à court terme de ce projet est de comprendre les déterminants de cette adaptation à l’hôte mammifère et de l’exacerbation de la pathogénicité des souches associées à PB1-F2. A plus long terme, les résultats obtenus dans ce projet permettront de développer des outils de prédiction du potentiel pandémique des souches émergentes de VIA.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris seront anesthésiées chimiquement par voie intrapéritonéale afin de les infecter par une administration en intra-nasale de virus (durée 1 min). Elles seront ensuite surveillées quotidiennement avec une mesure de leur poids et de leur température ainsi qu’une observation des signes cliniques liés à l’infection. Des prélèvements de sang seront effectués à J3, J5 et avant l’euthanasie des souris à la fin du protocole expérimental. Expérience 1 : 2 prises de sang à J3 et J15, durée 1 à 2 min. Expérience 2 : 1 prise de sang le jour de l’euthanasie, durée 1 à 2 min.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’aspect dommageable de ce protocole réside dans l’infection virale elle-même. Les virus que nous souhaitons utiliser ont des virulences variables et peuvent générer des symptômes très légers à très sévères chez la souris. Le suivi quotidien est donc indispensable afin d’effectuer un contrôle drastique des signes cliniques. Les dommages principaux liés à l’infection sont : anorexie sévère avec perte de poids supérieure à 20% du poids initial, chute de température. Le suivi quotidien sera renforcé et 2 visites journalières seront faites par le personnel.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de la procédure, les animaux seront tous euthanasiés afin de prélever les organes et tissus nécessaires à l’analyse des effets de l’infection par les VIA dans ces différents organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le modèle d’infection grippale par le virus influenza chez la souris reproduit très bien les mécanismes inflammatoires que nous souhaitons étudier. L’emploi du modèle souris pour étudier les mécanismes pathologiques liés aux virus influenza est extrêmement puissant car il permet de comprendre la dynamique de l’inflammation pulmonaire et de suivre l’afflux de cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. D’autre part, le virus grippal induit une pathologie marquée qui peut être potentiellement mortelle pour la souris mais qui nous permet de déterminer le pouvoir pathogène d’une souche donnée chez l’hôte mammifère et par extension chez l’homme. De telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes et notamment les recrutements de cellules immunitaires. D’autre part, l’usage d’organoïdes, malgré les récents progrès dans ce domaine, ne permettent pas d’étudier le tropisme viral au sein d’un organisme complet, ce qui est un des objectifs du projet.
2. Réduction
Une attention particulière sera apportée à l’emploi d’un nombre minimal d’animaux tout en maintenant des effectifs compatibles avec l’analyse bio-statistique. Une expérience pilote repose sur l’étude de lots de 5-10 animaux pour minimiser le nombre de souris tout en gardant des résultats statistiquement relevant. Ainsi dans la première partie de l’expérience visant à établir la dose létale 50 (LD50) des 6 souches virales étudiées, nous réduirons les effectifs des lots à 5 souris (5 lots par dose virale soit 150 souris infectées auxquelles il faut ajouter un groupe témoin de 5 souris soit 155 souris pour la première expérience). La détermination de la LD50 nous permettra de designer plus finement la seconde et de ne pas avoir à tester plusieurs charges virales infectieuses. Nous infecterons ainsi à une dose sous-létale nous permettant d’étudier la réponse inflammatoire. Pour cette seconde partie du projet, nous infecterons des lots de 20 souris, avec les 6 différents virus à tester (+ un groupe de 20 souris témoin recevant du PBS) soit une estimation à 140 souris. Le total de souris nécessaires pour le projet est donc de 295 souris.
3. Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe sociaux dans des cages (5 animaux maximum dans une cage). Concernant l’enrichissement du milieu, nous ferons au mieux mais les conditions et contraintes de manipulation en animalerie de niveau 3 ne nous permettent pas un enrichissement équivalent à ce qui pourrait être mis en place en zone conventionnelle (confinement minimum). En effet, les souris sont en cages qui elles-mêmes sont dans un isolateur. Du papier absorbant sera ajouté pour enrichir le milieu. Nous pouvons voir pour mettre des aliments de récompense après leur manipulation. Pour l’administration des virus (par voie intranasale), les souris seront anesthésiées chimiquement par voie intrapéritonéale. L’état de santé des animaux fera l’objet d’une attention particulière, les souris seront surveillées tout au long de l’expérience et l’état pathologique sera évalué grâce à des critères stricts basés sur la perte de poids, et la température corporelle. En cas de perte de poids supérieure à 20% ou une température inférieure à 35°C, les animaux seront euthanasiés. Une grille de suvi clinique sera utilisée afin de suivre l’état général de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle d’infection grippale chez la souris permet de reproduire les mécanismes de la réponse inflammatoire que nous souhaitons étudier. Le modèle souris permet notamment d’étudier la dynamique de l’inflammation pulmonaire ainsi que l’afflux des cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. Le virus de la grippe induit une pathologie potentiellement mortelle chez la souris permettant l’étude du pouvoir pathogène des souches étudiées chez l’hôte mammifère donc par extrapolation chez l’Homme. Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 6 semaines.