Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 14/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-669624)
56 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées puis soumises à un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition infantile, elles reçoivent jusqu’à vingt-cinq injections sous-cutanées d’un analogue hormonal, un test de tolérance au glucose par gavage avec prélèvements à la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le porteur affirme que le régime carencé n’induit ni faim ni stress anormal chez les jeunes souris. Il indique qu’aucun modèle in vitro ne reproduit un « organisme entier » en contexte de malnutrition et rattache les retombées à la prise en charge des enfants.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d’enfants dans le monde. Des études récentes ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté par l’appauvrissement en nutriments et qu’une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement le retard de croissance dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits dans le contexte de la malnutrition, un déficit en protéines pendant l’enfance résulte en des déficits neurocognitifs, métaboliques et immunitaires sévères qui persistent à l’âge adulte. Cependant, les altérations métaboliques exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique chronique, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique dans ces conditions, sont encore mal connus. Des études portant sur les cellules productrices d’hormones de l’intestin (appelées entéroendocrines), ont permis d’identifier une sous-population de cellules particulièrement impactée par la malnutrition protéique juvénile. Le but de ce projet est 1) D’évaluer comment les effets bénéfiques d’une intervention probiotique en contexte de malnutrition sont dépendants de ces cellules et 2) de caractériser plus finement les modifications de la signalisation d’une hormone produite par ces cellules dans un contexte de malnutrition protéique juvénile par rapport à un régime contrôle. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi que, pour certains animaux, à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. La moitié des animaux recevra 5 jours par semaine pendant la durée de la procédure une injection sous-cutanée d’un analogue hormonal (soit 25 injections au total). L’autre moitié des animaux recevra, une seule injection sous-cutanée d’un antagoniste de cette même hormone. Un test de tolérance au glucose durant 120 minutes sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins de 2-3 μL (5 prélèvements toutes les 15 minutes puis 2 prélèvements toutes les 30 minutes) et 3 prélèvements de 20 µL post gavage seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer respectivement la glycémie ou l’insulinémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé en fin de procédure. Pour cela, 30 minutes après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. Le prélèvement en veine porte durera deux minutes. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 56 animaux femelles appartenant à deux procédures.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Ces procédures devraient entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de ces procédures a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’agressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Le test de tolérance au glucose implique des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Pour la procédure impliquant des injections sous-cutanées de sémaglutide : les injections sous-cutanées peuvent induire de l’inflammation, les points d’injection seront surveillés quotidiennement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des femelles ayant subi la procédure expérimentale seront mises à mort à la fin de la procédure. En effet, la mise à mort est nécessaire afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes qui seront analysés par la suite.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l’organisme à l’ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition, nécessaire pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité entre individus. Le nombre de 7 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, l’ensemble des organes impliqués dans le métabolisme, mais qui ne seront pas directement utilisés dans le cadre de ce projet, seront conservés au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.
3. Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée en pesant la nourriture présente pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. A la suite des injections, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés cinq fois par semaine et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Des points limites suffisamment prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Les animaux recevront une analgésie et une antalgie avant le prélèvement en veine porte.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s’agit d’un modèle préclinique de choix afin de comparer l’effet d’un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l’identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L’objectif du projet est d’étudier la signalisation GLP-1 en condition de malnutrition pendant la période juvénile. Il faut donc utiliser des animaux juvéniles après leur sevrage.