Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-672372)
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés et hébergés seuls, les femelles reçoivent des embryons manipulés par chirurgie, et les souriceaux subissent une phalangectomie pour le génotypage, décrite comme « indispensable ». Le porteur produit des lignées de souris knock-in par CRISPR/Cas9 à l’aide de vecteurs viraux, une mise au point de méthode destinée à être proposée comme prestation dans toute la France. Les femelles non fécondées sont réutilisées une fois puis tuées, les mâles gardés environ un an avant d’être tués.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à la création de modèles murins par knockin, la matrice ADN de remplacement étant amené par un vecteur Adeno Associé ou AAV. Il se déroulera en deux étapes. La première étape aura pour objectif de définir le meilleur sérotype et le meilleur titre d’AAV par la manipulation de zygotes murins et l’analyse, d’une part de la fluorescence et d’autre part du nombre de copies du gène rapporteur codant pour la gfp, intégré au génome murin. Une fois les conditions optimales définies, des zygotes seront transduits et retransplantés dans des femelles pseudogestantes pour donner naissance à des souriceaux. Ces animaux seront eux-mêmes génotypés par analyse de la présence et du nombre de copies du gène codant pour la gfp.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus sont de ceux ordres. Un bénéfice scientifique car, même si la technologie Crispr-cas9 devient de plus en plus utilisée et est de plus en plus efficace pour créer des modèles d’invalidation, elle pêche encore dans la création de modèles KI. L’utisation d’AAV amenant la matrice portant la ou les modifications est une voie d’amélioration de cette méthodologie. Techniquement, il s’agira d’électroporer les constructions dans les embryons au stade zygote. Cette étape, déjà nécessaire pour la création des modèles KO par Crsipr-cas9, se révèle demander peu d’animaux, bien moins que la méthodologie originelle d’invalidation dans les cellules souches embryonnaires par recombinaison homologue.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Pour certains des mâles, il s’agit de la stérilisation par vasectomie, opération qui ne dure que 15 minutes une fois l’animal anethésié. Pour les femelles pseudogestantes, il s’agit d’une petite chirurgie pour permettre l’implantation des embryons manipulés. Celle-ci n’excède pas 10 min une fois la souris anesthésie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux obtenus à l’issue des manipulations seront élevés dans les conditions standards d’hébergement. Le seul acte qu’ils subiront sera une phalangectomie pour déterminer leur génotype, il n’y aura pas d’autre nuisance. Cet acte est indispensable pour permettre à la fois, lors d’un prélèvement unique, l’identification et le génotypage de l’animal. Pour ce qui concerne les animaux subissant des chirurgies, deux cas de figure se présentent. La nuisance pour les mâles vasectomisés réside essentiellement dans leur hébergement isolé un par cage. Pour la limiter ils seront tous hébergés dans la même pièce à proximité visuelle de leurs congénères. De plus, ils seront régulièrement mis en accouplement même en dehors des périodes nécessitant les retransplantations d’embryons manipulés. Pour ce qui concerne les femelles retransplantées, dans la mesure où les précautions pré- et post-opératoires sont respectées, il n’y a pas de nuisance particulière à craindre.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les femelles induites hormonalement et prise par les mâles (présence d’un bouchon vaginal) sont euthanasiées pour récolte des embryons. Celles qui n’auraient pas été accouplées sont gardées 5 jours avant réutilisation. A l’issue de cette nouvelle utilisation, celles qui n’auraient pas été prisee une deuxième fois sont euthanasiées. Les mâles vasectomisés et les mâles fertiles sont gardés environ un an puis euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’approche méthodologique a tout d’abord été validée par modifications de cellules eucaryotes. Cependant pour travailler sur des modèles mimant des pathologies parfois complexes, la modification du génome murin par ces nouveaux outils de transgénèse demeure l’une des voies indispensables d’approche.
2. Réduction
Pour cette preuve de concept, l’analyse de la bibliographie a aidé au design des outils (sérotypes à tester, concentrations) et nous nous appuions sur notre savoir-faire pour toute la partie production des zygotes. Ce protocole sera mené en parallèle sur plusieurs plateformes technologiques ce qui permettra de ne pas multiplier en interne les lots expérimentaux et qui correspond au souhait de pouvoir, à terme, offrir les mêmes types de prestations sur toute la France. Aucun test statistique ne sera utilisé car il s’agit ici de produire des souris transgéniques. Le nombre de manipulations sera de deux pour la partie in vitro de détermination du sérotype et de la concentration de l’AAV et de quatre pour les expériences in vivo. Le nombre d’animaux utilisé est détaillé dans chaque procédure.
3. Raffinement
Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé et compétent. Du METACAM ND est administré par voie sous-cutané en pré et post-opératoire. Un mélange de kétamine/xylazine est utilisé pour les anesthésies (vasectomies et retransplantations). Du coton est ajouté à l’enrichissement habituel pour favoriser la création de nid par les femelles pseudogestantes. Les points limites de ce projet sont ceux classiquement décrits lors de tout expérience de transgénèse : prostration, perte de poids ou non prise de poids (femelles pseudogestantes), aréactivité lors de l’ouverture de la cage ou de la préhension, aspect corporel.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris fait partie des espèces historiques et de choix pour l’étude des conséquences de modifications géniques; elle est utilisée en transgénèse depuis 1981. D’autre part la méthodolgie CRISPR/Cas9 y a donné de très bons résultats lors de l’invalidation globale de gènes, résultats tellement bons que le nombre d’animaux utilisés a ainsi été grandement diminué. Enfin, il existe dans cette espèce de nombreux outils d’analyse aux niveaux moléculaire, cellulaire ou de l’animal in toto des caractéristiques phénotypiques. Tous les animaux seront utilisés à partir de leur maturité sexuelle puisque les objectifs sont la production de zygotes sauvages et la retransplantation d’embryons modifiés aux stades une ou deux cellules. Les femelles donneuses d’embryons C57BL/6J seront induites hormonalement puis sacrifiées entre 5 et 7 semaines d’âge. Les femelles pseudogestantes des fonds Swiss-CD1 ou B6CBA/F1 seront retransplantées entre 8 semaines et 6 mois d’âge. Les mâles Swiss-CD1 vasectomisés ou C57BL/6J fertiles seront utilisés à partir de 6 semaines et jusqu’à un an.