Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-682461)
Pour tester la fermeture d’un tympan perforé par des feuillets de cellules cultivées, 24 lapins de deux mois sont utilisés dans des procédures d’un niveau de souffrance modéré, tous tués pour les prélèvements. Chaque animal subit d’abord une perforation totale du tympan sous anesthésie générale, puis un mois d’attente destiné à vérifier que la perforation ne se referme pas d’elle-même, puis une reconstruction chirurgicale d’une heure. Les deux oreilles sont opérées, ce qui porte à 48 le nombre d’oreilles incluses et permet au porteur d’annoncer une réduction du nombre d’animaux. Quatre de ces oreilles sont perforées puis laissées telles quelles, sans aucune tentative de reconstruction.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La tympanoplastie est le terme communément utilisé pour désigner la chirurgie de la perforation tympanique. Les causes sont multiples et la chirurgie vise à fermer cette perforation pour éviter les surinfections, faciliter l’appareillage auditif, améliorer l’audition lorsqu’elle est atteinte et prévenir la migration épidermique dans l’oreille moyenne à partir des berges de la perforation. C’est également le geste technique clé de reconstruction après l’exérèse d’un cholestéatome de l’oreille moyenne, afin d’éviter une récidive secondaire. Ce travail se base sur l’ingénierie tissulaire qui regroupe l’ensemble des techniques permettant la génération de substituts tissulaires ex vivo. Plus précisément, c’est ici la technique des feuillets cellulaires, issue de l’ingénierie tissulaire, qui va être utilisée dans cette étude. Celle-ci combine l’utilisation de cellules progénitrices provenant du périchondre auriculaire et l’induction de la différenciation chondrogénique par des facteurs de croissance présents dans le milieu de culture. Le projet de recherche va donc s’articuler autour de la réalisation d’une tympanoplastie, après perforation tympanique induite chez le lapin, par l’utilisation de feuillets cellulaires en superposition. On cherchera alors à évaluer la qualité de fermeture de la perforation par l’étude de son aspect macroscopique, de son intégration immunohistochimique ainsi que par sa capacité vibratoire. L’objectif principal de l’étude va donc être axé sur la réalisation d’une tympanoplastie chez le modèle animal (ici le lapin) à partir de la superposition de feuillets cellulaires en multicouche (MLCS), après perforation tympanique induite. Le but sera alors d’étudier la qualité de cette fermeture par superposition de feuillets cellulaires comparativement à une tympanoplastie standard utilisant du cartilage auriculaire et de l’aponévrose temporale. Les critères d’évaluation seront alors : la fermeture complète, partielle ou inexistante de la perforation tympanique, l’intégration immunohistochimique de la greffe avec le tympan restant, les capacités vibratoires du tympan avant et après tympanoplastie et la survenue de surinfections après le geste. Les perspectives pourront être une application in vivo chez l’homme, dans le cadre de fermetures tympaniques simples ou de reconstruction après exérèse de cholestéatome. Cette dernière constituant un enjeu important, étant donné le risque élevé de récidive de cette pathologie.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif principal de l’étude s’attachera à vérifier la fermeture ou non de cette perforation à l’aide de cette greffe tympanique faite à partir des feuillets cellulaires. Nous pourrons ensuite évaluer la qualité de fermeture de la perforation selon le nombre de feuillets utilisés ou le type de cellule à l’origine du feuillet. Les critères secondaires pourront être : – L’étude immunohistochimique de l’intégration du feuillet sur le tympan du lapin – La mesure de la vibration tympanique. Les perspectives de l’étude seraient une potentielle application chez l’homme pour la fermeture de perforations tympaniques. On peut imaginer qu’il serait intéressant de pouvoir refermer une perforation tympanique sur oreille saine avec une superposition de feuillets cellulaires dont l’épaisseur est la plus fine possible. Ceci visant alors à reproduire une structure la plus proche possible du tympan initial. A contrario, la reconstruction tympanique après exérèse de cholestéatome nécessite une certaine résistance afin d’éviter les récidives et donc une superposition de feuillets cellulaires avec une épaisseur plus importante. La création de ces substituts cartilagineux pourrait trouver notamment un bénéfice non négligeable pour les patients ayant subi de multiples récidives de cholestéatome et dont la réserve cartilagineuse (conque, tragus…) commencerait à s’épuiser. Par ailleurs, le degré de transparence de ces feuillets pourrait faciliter la surveillance clinique des patients opérés d’un cholestéatome. Les perspectives d’application de ces feuillets cellulaires s’étendent évidemment au-delà du domaine de l’otologie. On pourrait alors envisager également une application future en rhinologie pour la greffe cartilagineuse des rhino septoplasties. D’autres études seront alors nécessaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le but de l’étude est d’induire une perforation sur des tympans de lapins puis de procéder à une reconstruction tympanique par des feuillets cellulaires. Au total, 24 lapins seront sujet à une perforation tympanique totale (chirurgie rapide pratiquée sous anesthésie générale et durant environ 20 minutes). On attendrait alors un délai minimal de 1 mois avant de réaliser la tympanoplastie, dans le but de vérifier l’absence de cicatrisation spontanée du tympan. L’intervention se déroule également sous anesthésie générale et dure environ 1 heure. Une mesure de la vibration du tympan est effectuée par tympanométrie, qui est un test complètement indolore, durant quelques secondes et ne necessitant pas de contention ou de sédation. Il consiste en l’introduction d’une sonde au niveau du conduit auditif du lapin durant la mesure.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures chirurgicales sont pratiquées sous anesthésie générale afin de limiter au maximum le stress et la douleur chez les animaux. Il existe des risques d’infection liés à la chirurgie pouvant mimer une otite. Ceux-ci seront limités par la détersion des zones cibles. Une antibiothérapie locale et générale sera administrée si elle devait survenir.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les lapins seront mis à mort afin de pratiquer les prélèvements.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les études de développement de nouvelles techniques chirurgicales pour la tympanoplastie exigent l’utilisation de modèles pour leur validation préclinique avant l’utilisation en routine clinique. Le modèle animal qui correspond le mieux avant un potentiel essai clinique dans des études sur le tympan qui soit le plus similaire possible à l’homme est le lapin. Sa taille et positionnement du tympan permet d’étudier la tympanoplastie de façon similaire à celle de l’homme. De plus, le prélèvement des cellules progénitrices provenant du périchondre auriculaire est bien connu du laboratoire et permet d’éviter les rejets cellulaires. La culture cellulaire postérieure est également maitrisée. L’utilisation de feuillets cellulaires pour cette tympanoplastie prévoit de mesurer entre autres la vibration tympanique, un modèle in-vitro est donc inenvisageable dans ce cas.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est basé sur des données antérieures, sur des données de la littérature et sur l’utilisation de tests de puissance statistique. Les mesures réalisées se font sur les deux oreilles incluant des contrôles, réduisant ainsi le biais possible et le nombre final d’animaux à utiliser. Ainsi nous prévoyons d’utiliser un premier lapin pourvoyeur de cellules progénitrices pour preparer les feuillets en amont et une expérimentation comprenant 24 lapins ( 48 oreilles, cf description plus haut). Ces derniers subiront ou pas une perforation tympanique et une reconstruction selon le schéma suivant, 1 mois plus tard : 10 oreilles (perforation + greffe d’une superposition de 4 feuillets cellulaires), 10 (perforation + greffe de 2 feuillets cellulaires), 10 (perforation et greffe d’un feuillet cellulaire constitué à partir d’un autre type cellulaire), 10 (perforation + greffe cartilagineuse et aponévrose temporale), 4 (perforation sans intervention) et 4 (groupe contrôle, pas de perforation induite. Nous avons considéré que le nombre de 10 oreilles était un minimum pour obtenir des résultas exploitables d’un point de vue statistique.
3. Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en charge dès leur arrivée. Une personne habituée au travail avec les lapins est en charge de leur réception et surveillance quotidienne. Les conditions d’habituation et d’hébergement sont prévues pour assurer un maximum le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés ensemble au cours du projet. Une acclimatation à l’animalerie sera faite à l’arrivée des animaux depuis le site du fournisseur. Hébergement, enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Nous prévoyons l’installation des lapins en batteries d’hébergement avec enrichissements mais également la sortie quotidienne en parc afin de garantir une surface plus grande avec un enrichissement supplémentaire et la possibilité de réaliser de l’exercice à souhait. Ce type d’hébergement mixte batterie / sol avec de la paille permet d’avoir les lapins plus détendus. La personne en charge de leur bien-être a une grande habitude des lapins, et s’occupera de les suivre tous les jours. De plus, une période d’habituation est prévue afin de permettre aux lapins de prendre connaissance avec la cage de contention et de s’y rendre plus facilement. Des caresses et récompenses aident à cette habituation qui durera minimum une semaine. Les gestes techniques nécessaires à l’étude sont bien réfléchis et le timing prévu au plus réel afin de ne pas avoir des temps de latence qui imposeraient une contention ni une anesthésie plus longue que le strict minimum. Des récompenses sont également prévues à la fin de chaque expérience. Les manipulations des animaux seront faites par du personnel formé, expérimenté et avec du matériel adapté. L’observation des groupes sera faite et des scores de bien-être sont prévus pour chacune des procédures. Des points limites ont été définis pour chaque procédure.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Notre choix s’est porté sur le lapin pour i) c’est l’espèce gold standard utilisée pour la réalisation de tympanoplastie selon les données de la littérature iI) la question de taille du tympan pour pouvoir réaliser les chirurgies aisément, et iii) parce que nous avons l’habitude de ce modèle animal ayant déjà eu une première expérimentation sur l’otopoïèse. Aussi, l’anatomie de son oreille moyenne et la taille de la membrane tympanique et de l’oreille externe chez le lapin seraient adaptées à nos procédures expérimentales. Lapins d’environ 6-8 semaines à l’arrivée au laboratoire, donc environ 2 mois au moment des observations. Ils ont l’oreille déjà développée et sont assez légers et moins grands pour les garder en observation le temps des expériences.