Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 07/11/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-708409)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le cancer du pancréas (ADK) est un cancer agressif avec un des plus mauvais pronostic suivant l’annonce. Moins de 10% des patients ont une survie de 5 ans après le diagnostic. Des chimiothérapies existent mais il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies ciblées pour permettre une meilleure survie des patients. La médecine nucléaire offre une alternative en plein essor pour le diagnostic et le traitement du cancer. Des éléments radioactifs peuvent être couplés à une molécule thérapeutique capable de se lier spécifiquement à un marqueur tumoral et de tuer uniquement la cellule tumorale. En fonction du radioélément utilisé, il est possible de diagnostiquer par imagerie la tumeur chez le patient, ou de la détruire. Nous avons identifié la protéine X comme un marqueur précoce de l’ADK pancréatique pouvant servir de porte d’entrée du radioélement dans la cellule. Nous avons développé un anticorps capable de la reconnaître et ainsi de porter la radioactivité dans la cellule . Une demande de brevet en cours nécessite l’anonymisation en protéine X. Afin de développer cette thérapie nous devons évaluer l’effet de cette rotéine X sur le développement des tumeurs dans un modèle vivant : la souris et nous assurer que son expression à la membrane des cellules tumorales est bien homogène Nous utiliserons des lignées cancéreuses humaines, et murines dont nous décrirons les cinétiques de croissance en présence de la protéine X surexprimée ou non. Nous disposons aussi de lignées cancéreuses dérivées de greffes de cellules de patients chez la souris exprimant la protéine X dont nous décriront aussi la cinétique de croissance mais aussi inhiberons l’expression, de façon stable. Pour répondre à ces objectifs, un modèle de greffe dans le pancréas et sous-cutané, pour chacun des modèles cellulaires, seront nécessaires au développement d’une radiothérapie ciblée contre la protéine X. En début et fin de procédure, nous réaliserons un prélèvement sanguin pour déterminer si la protéine X circulante permettrait de développer un diagnostic sanguin. Ce projet vise à mettre en place un modèle murin adapté au développement d’un outil pour la médecine nucléaire qui permettra de diagnostiquer le cancer du pancréas, mais aussi de le traiter. Il amènera également des connaissances fondamentales sur le rôle de ce marqueur précoce dans Le cancer du pancréas.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le cancer du pancréas est un des cancers avec le plus mauvais pronostic suivant l’annonce du diagnostic dont l’incidence augmente en France et en Europe. Les traitements disponibles ne permettent pas aux patients de survivre au-delà de quelques années. Il est primordial d’identifier de nouvelles cibles biologiques pour développer de nouveaux traitements. Ce projet présente un enjeu majeur car l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique, la protéine X, permettrait de développer une alternative thérapeutique dans cette maladie. 20 publications seulement sont référencées dans la littérature concernant cette protéine X qui n’a jamais été décrite dans le cadre du cancer du pancréas. Cette découverte laisse penser que la protéine X pourrait être un nouveau marqueur du cancer pancréatique. La mise au point des modèles animaux de cancer pancréatique que nous voulons développer permettrons de caractériser la présence et l’expression membranaire de la protéine X dans les tumeurs pancréatiques. Nous comparerons la cinétique de croissance des tumeurs exprimant ou non la protéine X, nous pourrons ainsi déterminer son rôle dans la croissance tumorale. Cette étape sera indispensable pour les tests d’efficacité de l’anticorps, capable de reconnaître spécifiquement cette protéine X, que nous avons développé. En attachant un agent thérapeutique à cet anticorps, il serait possible de détruire spécifiquement les tumeurs tout en épargnant les tissus sains. Cette seconde phase ne fait pas l’objet de cette demande et sera réalisée par nos collaborateurs. Afin d’évaluer le potentiel de ce nouveau traitement, nous aurons besoin d’étudier son efficacité dans un modèle animal que nous nous proposons donc de mettre au point dans ce projet.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Certains animaux subiront une procédure chirurgicale pour la greffe orthotopique de cellules cancéreuses au niveau du pancréas (durée 30 minutes) sous anesthésie générale gazeuse avec un prélèvement sanguin (30 secondes) au niveau de la veine caudale, des anesthésies gazeuses répétées pour des échographies abdominales (durée 15minutes) 2 à 3 fois par semaine. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse (15 minutes) pour procéder à prélèvement sanguin intracardiaque et prélever plusieurs organes (pancréas, rate et foie). D’autres animaux subiront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses réalisée par injection sous-cutanée (1 minute) sous anesthésie générale gazeuse avec un prélèvement sanguin (30 secondes) au niveau de la veine caudale. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse (15 minutes) pour procéder à prélèvement sanguin intracardiaque et prélever plusieurs organes (pancréas, rate et foie).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les souris NMRI que nous utilisons présente une immunodéficience qui induit une fragilité aux infections mais une tolérance aux greffes de cellules humaines. La greffe de cellules cancéreuses induit une maladie tumorale sévère surtout pour la voie orthotopique dans le pancréas. Le développement de la tumeur pourrait rendre l’organe dysfonctionnel pouvant s’accompagner d’une dégradation de l’état général (perte de poids et d’activité). La chirurgie viscérale dure 30 minutes avec une anesthésie durant 45 min, l’incision de la peau et du péritoine nécessite des sutures internes et cutanées pouvant créer une gêne ou une douleur chez l’animal. Les animaux seront manipulés pour pesées et évaluations du bien-être le jour de la chirurgie, pour le suivi échographique des pesées régulières et des anesthésie gazeuses de 30 minutes seront nécessaires 2 à 3 fois par semaine selon la vitesse de croissance de la tumeur. Dans le cas des injections sous-cutanées,la mesure des tumeurs nécessite la manipulation des animaux éveillés donc pouvant induire un stress pendant 5 à 10 minutes 2 à 3 fois par semaine. Le développement de tumeur sous-cutanée peut induire une gêne voire des douleurs mais aussi des lésions cutanées.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour la procédure 1, tous les animaux sont euthanasiés sous anesthésie gazeuse en fin de procédure pour le prélèvement du pancréas et d’organes supplémentaires (rate et foie). Un prélèvement sanguin intracardiaque est réalisé avant le prélèvement des organes. Pour la procédure 2, tous les animaux sont euthanasiés sous anesthésie gazeuse en fin de procédure pour prélever la tumeur sous-cutanée. Nous pourrons aussi prélever des organes (ex : pancréas).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les modèles cellulaires de lignées cancéreuses ne reproduisent pas fidèlement le contexte tumoral pour étudier l’expression de marqueur membranaire comme la protéine X. Même s’il existe des modèles organoïdes de tumeurs pancréatiques, nous ne pouvons pas nous baser sur ce type de modèle dans le cadre de la mise au point de radiothérapie qui nécessite d’observer la réponse des tissus proches de la tumeur. Le modèle de greffe au niveau du pancréas de cellules cancéreuses pancréatiques permet de se rapprocher d’un contexte pathophysiologique proche de celui des patients en reproduisant la complexité tissulaire, cellulaire et du micro-environnement tumoral, ce qui est impossible in-vitro. Ce deuxième modèle de greffe, permettra de se placer dans les conditions les plus proches pour l’administration d’une radiothérapie curative. La greffe sous-cutanée présente l’avantage de reproduire le contexte tridimensionnel des tumeurs solides mais ne récapitule pas la spécificité de l’organe atteint. Le modèle sous-cutané permettra d’adapter les paramètres de la future radiothérapie qui nécessite un modèle vivant. Le modèle sera utilisé en cas de problème de croissances de nos cellules en implantation au niveau du pancréas. L’utilisation de cellules dérivées de tumeurs de patients, nous permettra de récapituler les caractéristiques des tumeurs pancréatiques humaines afin de reproduire plus fidèlement la pathologie observée chez les patients, notamment avec une expression sans doute plus faible de la protéine X. Les derniers modèles dans notre projet, nous permettrons d’étudier l’expression de la protéine X dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel comme chez les patients par rapport aux souris immunodéficientes.
2. Réduction
Nous envisageons une expérience pilote sur 6 souris pour calibrer la procédure chirurgicale, adapter le nombre de cellules tumorales à injecter et mettre au point l’imagerie par échographie au sein du laboratoire. Si nous observons la formation d’une tumeur à chaque implantation, et pas de mort des animaux due à la chirurgie du pancréas, nous pourrons envisager de diminuer le nombre d’individus prévus. Pour ce projet, nous utiliserons 134 souris au total au maximum. Ce nombre est évalué au plus près grâce à un outil statistique informatique EDA (Experimental Design Assistant) . Ils pourront être revus à la baisse. En effet suite à l’étude pilote d’injection orthotopiques de cellules humaines sur 6 souris, nous relancerons les calculs statistiques pour éventuellement réduire le nombre d’animaux nécessaires. Sur tous les animaux du projet, nous ne nous limiterons pas à prélever seulement la tumeur induite ou le pancréas mais aussi plusieurs organes (rate, foie, éventuellement poumons) qui peuvent être des sites de métastases. Aussi nous recueillerons le sang des animaux pour rechercher la présence circulante de notre cible la protéine X. Les coupes de tissus et tumeurs seront utilisés pour des immunomarquages et radiomarquages par nos collaborateurs. De plus, l’ensemble des prélèvements seront stockés pour étudier des partenaires de la protéines X inconnus à ce jour.
3. Raffinement
Nos animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; cycle jour/nuit : 12h/ 12h). Les conditions d’hébergement de notre animalerie respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux avec accès à l’eau et à des croquettes à volonté. Les souris seront hébergées par groupes de 5 animaux par cages pour respecter leur instinct grégaire, les cages seront en portoir ventilé individuel. Nous mettrons des enrichissements à disposition des animaux pour éviter tout comportement de stress. Nos animaux présentant une déficience immunitaire, nécessitant de travailler en environnement aseptisé. Nous prévoyons de travailler avec des souris mâles qui nécessitent une vigilance sur une potentielle agressivité entre les animaux dans les cages. Nous envisagerons d’isoler certains individus si nous observons des comportements de domination. . Tous les animaux de ce projet seront suivis quotidiennement à partir de la procédure de greffe de cellules cancéreuses et dès le développement de la maladie pour les modèles orthotopiques. Pendant la chirurgie, les yeux des animaux seront protégés pour éviter le dessèchement. Les animaux, ayant subi une greffe orthotopique au niveau du pancréas, seront réchauffés et retrouveront leurs congénères après la chirurgie pour éviter le stress lié à l’isolement. Nous évaluerons le degré de douleur au cours de la procédure avec une grille de score établie au laboratoire. Nous réaliserons des mesures régulières de croissance de la tumeur soit au pied à coulisse ou par échographie abdominale, et déterminerons une taille limite maximale. Un suivi quotidien des animaux sera assuré par les personnes habilitées pour ce projet et le personnel de l’animalerie et pourrons se rapprocher du SBEA en cas de doute sur un animal ayant subi une des procédures du projet. En cas de signe d’inconfort ou souffrance nous agirons en fonction de la grille de score établie soit en administrant un analgésique ou bien par l’arrêt de la procédure si un des points limites établis est atteint.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est un modèle classiquement utilisé pour étudier les processus de tumorigenèse. Le modèle murin présente une forte homologie génétique avec l’homme et permet de s’affranchir de la limitation d’accès à du matériel humain. Les tumeurs pancréatiques induites chez la souris montrent de nombreuses similarités avec ce qui peut être observé dans les tumeurs humaines, faisant de la souris un bon modèle d’étude. Les modèles de greffes ectopiques et orthotopique dans la souris sont rapides à obtenir, en quelques semaines, et reproductibles. Nous utiliserons des souris adultes pour tout le projet, elles seront âgées de 6 semaines au moment des procédures de greffes. Cet âge est choisi car nous étudions l’adénocarcinome canalaire pancréatique qui affecte les patients adultes. Les animaux doivent être âgés d’au moins 6 semaines pour s’assurer qu’ils supportent la procédure chirurgicale. Ces paramètres seront utilisés pour la deuxième phase de ce projet (non incluse dans cette demande et qui sera réalisée par nos collaborateurs) qui sera une radiothérapie interne vectorisée après le développement tumoral. Pour que les animaux tolèrent les radiations induites par le traitement ils doivent être âgés de 8 semaines.