Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 05/03/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-778344)
Exposées de façon prolongée à des nanoparticules de polystyrène et à des phtalates, 3 336 souris seront toutes tuées, dans des procédures d’un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole prévoit 72 heures en cage métabolique individuelle, 48 heures en cage d’observation, des tests d’anxiété en espace ouvert éclairé et sur surface surélevée, des mesures de seuils de sensibilité par stimulations thermiques chaudes ou froides et par stimulations mécaniques, une injection de carragénine dans la patte pour provoquer une inflammation cutanée, et pour certaines une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur attend chez les groupes exposés des troubles du comportement alimentaire, de l’anxiété et des hyperalgies de type fibromyalgie, et ouvre la même rubrique par la phrase « ce projet obéit à la règle des 3R ». Il précise retenir des polluants « dont les effets sont avérés » sur la santé humaine et animale, ce qui situe l’apport attendu du côté des mécanismes plutôt que de la démonstration du danger.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les matières plastiques sont omniprésentes dans notre environnement. Quand ils ne sont pas éliminés ou recyclés correctement, les plastiques perdurent dans l’environnement pendant des années car ils ne sont pas biodégradables. Ils se décomposent alors en particules de micro et nanoplastiques (respectivement inférieures à 5 et 0,1 µm) qui sont des sources de pollution environnementale. Cette forme de pollution a atteint un niveau record en Méditerranée où la concentration de plastique y est quatre fois plus élevée que dans « l’île de plastique » du Pacifique Nord. La Méditerranée représente 1% des eaux marines du globe mais abrite 7% de tous les microplastiques. Par ailleurs, les plastiques libèrent des additifs plastifiants (bisphénol A, phtalates, etc.) dans l’environnement dont les effets nocifs pour les animaux et les humains sont bien documentés. Les mesures récentes réalisées pour Santé Public France montrent que ces polluants sont présents dans l’organisme de l’ensemble des adultes et des enfants, avec des niveaux d’imprégnation plus élevés chez les enfants. Les phtalates sont des perturbateurs endocriniens et métaboliques, et des reprotoxiques, pour lesquels des effets néfastes sur l’asthme chez l’enfant, l’obésité juvénile et le diabète de type 2, les TDAH, et chez l’adulte sur l’endométriose, l’infertilité, ainsi que sur le développement neurologique ont été documentés. Les enquêtes épidémiologiques montrent une forte incidence de neuropathologies centrales, périphériques ou autonomes, chez les professionnels exposées. Si le diagnostique est clair, les mécanismes neurobiologiques impliqués sont inconnus. Il a été montré que les nanoplastiques traversent la barrière hématoencéphalique et provoquent un stress oxydatif dans le système nerveux. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence que l’exposition prolongée aux nano et microplastiques et adjuvants phtalates affecte les profils inflammatoires systémiques et induit une neuroinflammation dans les régions du système nerveux central impliquées dans la réponse au stress, l’anxiété et la prise alimentaire (hypothalamus, amygdale et hippocampe), et le système nerveux périphérique impliqué dans la nociception et la réponse autonome (ganglion sensoriels de la corne dorsale de la moelle épinière et ganglions autonomes), et que cette réponse neuroinflammatoire impacte le comportement animal en comparaison à des animaux sains non exposés.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude présente un intérêt translationnelle car il est clairement démontré que l’exposition aux particules de plastiques et aux adjuvants de phtalates, polluants environnementaux d’origine anthropique, affectent la santé humaine. L’étude apportera des connaissances sur l’impact de ces polluants sur la santé mentale et les comorbidités neuronales. Elle permettra de comprendre les mécanismes neurobiologiques fondamentaux responsables des effets toxiques de ces polluants. A ce titre, les connaissances acquises sur les animaux seront applicables pour les études sur la santé humaine et éclaireront les agences responsables de la définition des normes environnementales et industrielles pour la santé humaine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le métabolisme des souris est mesuré dans des cages métaboliques individuelles pendant 72heures. L’activité spontanée des souris est mesurée dans des cages d’observation individuelles pendant 48heures. La mesure est répétée pour 3 stades de développement après la naissance. La répartition des masses grasses et maigres tissulaires est mesurée sous anesthésie générale gazeuse, pendant 5 minutes. Pour les souris engagées dans l’étude de l’anxiété, 3 tests sont réalisées d’une durée respective de 20, 20 et 30 minutes. Chaque souris subie ces 3 tests à 3 périodes de développement après la naissance. Pour l’étude de la sensibilité au toucher des souris, le seuil de sensibilité mécanique cutanée est mesuré par 2 tests réalisés dans des boxes individuels en plexiglas transparent d’une durée totale approximative d’1h. Le seuil de la sensibilité cutanée à la température est mesuré par des tests d’exposition à des stimulations thermiques chaudes ou froides. Les stimuli sont calibrés pour un délai moyen de réponse de l’animal de 10 secondes. Le temps maximum d’exposition au stimulus de température est de 30 secondes. Pour certains tests, les souris subissent une période d’habituation de 4 jours. Les souris qui subissent la perfusion intracardiaque sont sous anesthésie générale avec un anesthésique et un antalgique injectable. Elles sont perfusées par la circulation générale avec le tampon de rinçage et le fixateur pendant environs 30 min.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Ce projet obéit à la rège des 3R. Toutefois, il est attendu que lors de l’exposition prolongée aux nanoparticules de plastiques de polystyrène et phtalates, les animaux des groupes tests pourraient développer des troubles métaboliques et du comportement (troubles du comportement alimentaire, perturbation du métabolisme glucidique, stress et anxiété, hyperalgie nociceptives et inflammatoires, hyperalgies généralisées de type fibromyalgie), en comparaison aux groupes témoins. Les effets indésirables sont évalués par des tests de comportements qui visent à en observer l’apparition et en mesurer l’intensité : Stress-anxiété : exposition à des situations anxiogènes, à savoir, déplacement dans un espace ouvert éclairé ou sur une surface surélevée. Hyperalgie nociceptives : mesure des seuils de sensibilité thermique et mécanique par l’exposition à des stimuli thermiques chauds ou froids ou mécaniques jusqu’au seuil de réponse des animaux. Hyperalgie inflammatoire : la nuisance est une réaction inflammatoire cutanée (œdème et chaleur) au niveau de la patte après injection de carragénine. Métabolisme glucidique : hypo- ou hyperglycémie transitoire provoquée par l’injection d’insuline ou de glucose.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d’organes pour analyses biologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude et la veille bibliographiques permanente de la littérature scientifique abondante sur le sujet nous permettent de choisir les polluants dont les effets sont avérés sur les organismes pour la santé humaine et animale. En parallèle, les études préliminaires sur des cultures cellulaires in vitro, menées dans un laboratoire du consortium européen Horizon Europe-MSCA-Staff Exchange-2022 Psycomed (cité précédemment) et en collaboration avec les équipes du projet PLASTICHEAL financé par l’union européen, sont réalisées pour définir le choix et les quantités des matériaux plastiques et phtalates qui seront utilisées sur les animaux. L’étude de l’impact des polluants micro-nanoplastiques et adjuvant phtalate sur la santé et le comportement (prise alimentaire, proprioception et nociception), impliquant possiblement des effets pro-inflammatoires et de perturbateurs endocriniens, affecte simultanément plusieurs organes (les organes périphériques : foie, tissus adipeux, tube digestif, pancréas, tissus lymphoïdes, les glandes endocrines, la peau) et les systèmes nerveux centraux et périphériques responsables des comportements de prise alimentaire, proprioception, nociception et réponses autonomes. De plus, l’effet des polluants dépend de leurs voies de pénétration dans l’organisme (per os ou volatil). Il est par conséquent impossible aujourd’hui de pouvoir réaliser notre étude d’impact des polluants autrement que dans un contexte in vivo global. Le développement des effets sur la santé psychique et neurologique (stress-anxiété, prise alimentaire, proprioception, nociception et autonome) fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car il n’est pas modélisable in vitro pour l’instant.
2. Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables (basé sur nos expériences et un calcul statistique pour trouver un effet significatif). Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu’elle soit normale ou non. En cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques. En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques, même si ceux-ci sont moins sensibles. Un nombre minimum d’animaux sera utilisé dans nos procédures expérimentales en respectant strictement ces différents points: (i) Utilisation d’un groupe de souris contrôles commun pour plusieurs séries d’études chaque fois que cela est possible. (ii) multi-prélèvements et création d’une base d’échantillons (cerveau et sang après sacrifice).
3. Raffinement
Les animaux, en provenance d’élevages accrédités, seront hébergés dans une animalerie certifiée, dans des cages sur portoirs, avec nourriture et boisson ad libitum, dans le respect des règles d’hébergement en vigueurs (respect du nombre d’animaux par cage, condition de vie dans les cages…). Avant expérimentation, les souris seront acclimatées pendant plus d’une semaine durant lesquelles les expérimentateurs les habitueront à être manipulées, pour réduire toutes formes de stress au cours des expérimentations. Les souris sont suivies quotidiennement. A partir du début de l’expérience, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs évalueront aussi l’état général des souris quotidiennement afin de déterminer la présence ou non de signes de souffrances excessives (comportement d’isolement, attitude soumise, dos voûté, respiration difficile, extrémités pâles, démarche anormale, diarrhée, vocalises, agressivité…). En cas de souffrance, les animaux seront traités selon la sévérité du comportement observé et en cas où les signes de souffrance persisteraient, les animaux seront euthanasiés. Une fiche d’observation longitudinale et une grille d’évaluation de l’état de nos souris ont été établies. Nous utiliserons des souris mâles et femelles. Notre étude présente un intérêt translationnelle, étant donné que l’exposition aux plastiques polluants environnementaux affecte les humains, il est donc nécessaire de mesurer les effets des molécules étudiées sur les deux sexes. Par ailleurs, il est bien documenté que mâles et femelles peuvent avoir des différences notables dans la réponse inflammatoire et leur sensibilité aux polluants environnementaux
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est une espèce très utilisée dans les études précliniques et en recherche fondamentale pour analyser la relation entre l’exposition à des substances potentiellement toxiques et les effets sur le métabolisme, les états inflammatoires et le comportement des animaux. La proche similitude du patrimoine génétique de la souris avec l’homme nous permet dans la mesure du possible de tirer des conclusions extrapolables pour la santé humaine, dans une étude au potentiel translationnel important.