Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 01/08/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-811990)
511 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tuées à l’issue et vingt-sept gardées en vie pour la reproduction. Porteuses d’un modèle de maladie de Charcot, elles reçoivent une injection de vecteur viral dans le cerveau ou la moelle et subissent deux tests moteurs mesurant force et coordination. Le porteur indique que les animaux perdent du poids et de la mobilité, et sont mis à mort avant la paralysie totale des membres. Il affirme que le modèle murin reproduit les traits de la maladie et qu’une approche sur cellules souches humaines est « à ce jour impossible ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Charcot ou sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative rare caractérisée par la dégénérescence des motoneurones de la moelle épinière qui innervent les muscles. La perte des motoneurones conduit à la paralysie des membres, puis au décès par détresse respiratoire. Au cours de la progression de la maladie, les premiers motoneurones touchés sont ceux impliqués dans l’effort intense (motoneurones vulnérables) alors que les posturaux résistent à la maladie (motoneurones résistants). Un des enjeux majeurs est de comprendre les mécanismes responsables de la perte sélective des motoneurones. Pour aborder cette question, nous avons séquencé l’ARN des motoneurones impliqués dans la posture et de ceux impliqués dans l’effort bref et intense. A partir des banques d’ARN, nous avons sélectionné un gène dont l’expression est spécifique des motoneurones impliqués dans les efforts musculaires intenses. Ce gène contribue au transfert d’information entre neurones et neurones-muscles : la neurotransmission Sa délétion chez la souris n’induit pas de phénotype locomoteur. La souris modèle de la maladie de Charcot utilisée dans le projet est très bien caractérisée et reproduit les traits cliniques de la pathologie. L’effet de la perte du gène candidat sera évalué sur la progression de la maladie. Ce projet a une pertinence médicale directe en abordant la question de la vulnérabilité et la résistance dans les maladies des motoneurones.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet devrait permettre d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques en ciblant les acteurs responsables de la vulnérabilité des motoneurones vis-à-vis de la maliadie de Charcot. Notamment, réduire spécifiquement l’excitabilité des motoneurones est une approche qui permettrait de prolonger et/ou d’améliorer la qualité de vie des patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions l’expression de gènes candidats participant au processus de dysfonctionnement des neurones moteurs. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Les souriceaux recevront une seule injection de vecteur viral en intracerébroventriculaire et les souris agées de 30 jours recevront une seule injection virale en intrathécal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le modèle rongeur de la maladie de Charcot que nous utilisons récapitule les principaux traits de la pathologie humaine et a fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique. Les nuisances attendues sont une perte de poids, une mobilité réduite .Les animaux sont euthanasiés avant la paralysie totale des membres (quand le temps de retourment de l’animal mis sur le dos est supérieur à 15 secondes) et donc avant la détresse respiratoire (qui n’a jamais été observée dans le modèle rongeur).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
27 animaux seront en utilisation continue pour la reproduction. Tous les autres seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier des paramètres histologiques. 2) l’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans le modèle murin de la maladie de Charcot utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le modèle murin de la maladie de Charcot mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine et la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. De même notre stratégie ciblée sur les sous population de motoneurones spinaux est à ce jour impossible sur des cellules souches humaines pluripotentes induites, car ce modèle in vitro ne permet pas de reproduire la diversité fonctionelle électrique et synaptique des populations de motoneurones de la moelle épinière.
2. Réduction
Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes d’animaux. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Pour les cohortes de suivi de la progression de la maladie : N= 24 souris par condition (12 males et 12 femelles). Pour les analyses histopathologiques, N = 8 souris par condition (4 males et 4 femelles) .
3. Raffinement
Une connaissance extensive du modèle murin de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc de normaliser le suivi des animaux. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement non stressant propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse ou de douleur est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La lignée de souris transgénique modèle de la maladie de Charcot qui est utilisée dans ce projet récapitule la progression rapide de la pathologie, ce qui est le plus souvent observée en clinique. De plus ce modèle reproduit les traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie, à savoir la perte précoce des motoneurones impliqués dans les efforts musculaires intenses. Nous avons identifié un gène marqueur des motoneurones vulnérables dans la maladie de Charcot et qui pourrait intervenir dans les fonctions d’effort musculaire. Nous allons induire la perte de fonction de ce gène chez la souris modèle de la maladie de Charcot et suivre l’effet sur la progression de la maladie. Les cohortes utilisées pour l’analyse de la progression de la maladie sont suivies à différentes étapes de la maladie (non symptomatique, début de la maladie et symtomatique) jusqu’au point limite défini pour ce modèle de la maladie de Charcot (environ 4.5 mois pour des animaux sans traitement).