Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-835042)
36 832 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la grande majorité des têtards tués pour analyse et 112 femelles adultes maintenues en élevage pour la reproduction. Les têtards subissent des injections intraoculaires et des lésions physiques de la rétine sous anesthésie, pour étudier les mécanismes de régénération rétinienne propres à cette espèce. Le porteur qualifie la dégénérescence rétinienne d' »indolore » et présente la rétine comme un « organe non-vital qui régénère entièrement ». Il décrit la fécondation in vitro et le recours au xénope comme relevant d’une « stricte nécessité ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Une maladie neurodégénérative est une altération progressive et souvent irréversible des fonctions nerveuses. Par exemple, les maladies neurodégénératives de la rétine, comme le glaucome, la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) ou la rétinite pigmentaire, conduisent très souvent à une perte de la vision. Comme d’autres maladies neurodégénératives (Huntington, Parkinson ou Alzheimer), ces pathologies rétiniennes résultent de la mort de certaines cellules indispensables au fonctionnement du tissu neural : cellules ganglionnaires chez les patients atteints de glaucome ou photorécepteurs dans la DMLA ou la rétinite pigmentaire. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour réellement traiter ces pathologies. La biologie des cellules souches de la rétine est en plein essor afin de développer de nouvelles approches pour combattre la cécité. Notre programme de recherche vise à étudier la manière dont des signaux externes et des facteurs internes interagissent et se coordonnent pour finement réguler le comportement des différentes populations de cellules souches de la rétine dans des conditions physiologiques ou pathologiques (lésions et dégénérescences). Plus particulièrement, nous nous intéressons à l’influence du contexte inflammatoire. Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines. Il existe de nombreux modèles (souris et rat) de dégénérescence rétinienne mais ces derniers ne sont pas les plus appropriés pour l’étude des processus de régénération en raison d’un potentiel de réparation extrêmement limité, comme chez l’Homme. En revanche, les amphibiens, en raison de leurs capacités de régénération remarquables, constituent des modèles de choix pour l’étude de l’implication des cellules souches dans la réparation tissulaire. En ce qui concerne la rétine du xénope, plusieurs travaux dont les nôtres ont démontré une régénération très efficace après lésion ou ablation rétinienne à partir des cellules gliales de Müller ou des cellules souches de l’extrémité de la rétine. La rétine du xénope offre donc un terrain d’investigation de choix pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des processus régénératifs dans un contexte de dommage rétinien (lésions physiques et neurodégénérescence).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce travail devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent le comportement des cellules souches en général, et des cellules souches rétiniennes en particulier. Cette étude devrait par conséquent permettre d’expliquer les raisons de la perte des capacités régénératives chez les mammifères afin de trouver des pistes pour restaurer ce potentiel dans une perspective de thérapie cellulaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans le cadre de ce projet, 80 femelles adultes sauvages et 32 femelles adultes transgéniques ou mutantes seront soumises, tous les 4 mois, à une injection sous-cutanée d’hormone afin de réaliser des fécondations in vitro. Par ailleurs, des larves autonomes sont soumis à plusieurs actes expérimentaux : – 10800 individus : (i) anesthésie une fois pendant la procédure juste avant une injection intraoculaire afin d’éviter la douleur qui aurait été générée par l’injection. La durée de l’anesthésie est d’environ 5 minutes. (ii) injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L’injection s’effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. – 6480 individus : (i) anesthésie deux fois pendant la procédure, juste avant une injection intraoculaire et juste avant une lésion physique de la rétine. La durée de chaque anesthésie est d’environ 5 minutes. (ii) injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L’injection s’effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. (iii) lésion physoqie de la rétine : une fois pendant la procédure. La lésion s’effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l’animal pour réaliser cette lésion. – 19440 individus : (i) anesthésie deux fois pendant la procédure, juste avant chaque injection intraoculaire. La durée de l’anesthésie est d’environ 5 minutes. (ii) injection intraoculaire : deux fois pendant la procédure. L’injection s’effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l’animal pour réaliser l’injection.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La mise en œuvre de ce projet requiert l’utilisation de larves autonomes. Les dommages escomptés les concernant sont limités. L’établissement de lignées transgéniques modèles de pathologies reposent sur des systèmes qui permettent l’ablation réversible d’une population de cellules bien précise à un instant choisi. Ainsi, l’apparition du phénotype se fait uniquement au stade requis et sur une durée limitée et il est important de mentionner que la déficience visuelle consécutive à une dégénérescence cellulaire, comme dans la DMLA, est indolore. En revanche, certains aspects du projet requièrent des lésions physiques via piqure d’aiguille ou des injections intraoculaires d’agents chimiques, dont le niveau de sévérité attendu est de classe modérée bien que ces actes soient réalisés sous anesthésie. Toutefois, notons également que les phénotypes concernent une population précise de cellules dans un organe non-vital qui régénère entièrement chez l’espèce concernée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
– Procédure 1 : maintien en élevage des femelles adultes – Procédure 2 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et l’expression de gènes dans leurs rétines. – Procédure 3 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et l’expression de gènes dans leurs rétines. – Procédure 4 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et l’expression de gènes dans leurs rétines. – Procédure 5 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaireet du devenir cellulaire des cellules de Müller dans leurs rétines.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité car : -la fécondation in vitro constitue la seule méthode pour obtenir des ovocytes matures de manière non invasive (sans chirurgie) puis des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques. – Le projet a pour objectif l’étude des mécanismes impliqués dans le développement et la régénération d’un organe, la rétine. La nécessité d’avoir recours à des animaux, les xénopes, se justifie par le fait que ces processus sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire in vivo. Des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux ne sont donc pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Cependant, afin de satisfaire au principe de remplacement, – nous pratiquons des approches in silico en bio-informatique. – En amont du présent projet, nous planifions la mise au point de culture en explant de rétines ex vivo, provenant d’animaux euthanasiés sans manipulation préalable. Cette technique pourra s’avérer être un bon modèle alternatif de dégénérescence rétinienne et permettra ainsi d’étudier l’effet de molécules pro- ou anti-inflammatoires sur la capacité régénérative des cellules de Müller. Ce modèle ex vivo va permettre de sélectionner les molécules inflammatoires les plus efficaces qui pourront être ensuite utiliser in vivo.
2. Réduction
La réalisation de notre projet implique notamment l’injection d’hormone chez des femelles xénopes adultes pour la production d’ovocytes afin d’obtenir des embryons. Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés, nous prenons en compte que : – Les femelles, ayant une période reproductive longue (15 ans), peuvent être induites à pondre de nombreuses fois – Il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles sacrifiés. – Si possible, nous réalisons des fécondations naturelles évitant le sacrifice du mâle (mâles transgéniques). – Nous utilisons au moins dix animaux par groupe afin que les résultats obtenus soient statiquement valides. Nos expériences sont réalisées 3 fois.
3. Raffinement
Dans le but de réduire la douleur, souffrance ou angoisse, nous imposons : – des conditions d’élevage conformes aux directives européennes. – l’utilisation des femelles par roulement tous les 4 mois permettant le renforcement positif lors des manipulations. – Pour les larves autonomes, les lésions physiques induites et les injections intra-oculaires se font sous anesthésie. Nous prenons également en compte le fait que : – Le phénotype vise un organe non-vital qui régénère entièrement chez l’espèce concernée. – La dégénérescence cellulaire au niveau de la rétine, comme dans la DMLA, est un processus indolore.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le xénope est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Nous disposons des génomes pour les deux espèces (X.tropicalis et X.laevis) et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain : 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs équivalents chez le xénope. Par ailleurs, ces espèces sont faciles à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. X. tropicalis est diploïde avec un temps de génération plus court que X. laevis. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches d’étude génétique sont couramment utilisées. Dans le cadre de notre projet, le xenope, en raison de ses capacités de régénération remarquables de sa rétine, constitue un modèle de choix pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ces processus régénératifs. Pour effectuer les fécondations in vitro, nous utilisons des animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle. Nos expériences d’étude de la régénération de la rétine nécessitent de travailler sur des stades larvaires autonomes car nous avons démontré que les cellules de Müller permettant la régénération ne se réactivent de manière efficace qu’après ce stade. Par conséquent, toutes les expériences visant à étudier l’activation des cellules de Müller et la régénération sont effectuées sur des têtards.