Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-07-04 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-839083)
Cinq jours d’injections quotidiennes pour vider leur moelle osseuse, une greffe de moelle par voie intraveineuse le sixième jour sous anesthésie, jusqu’à cinq prises de sang, et pour certaines une injection de cardiotoxine qui lèse un muscle de la patte : 815 souris vont être utilisées, 455 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 360 un niveau léger. Le porteur indique que la greffe échoue dans environ 20 % des cas, la souris cessant alors de produire des cellules sanguines, s’affaiblissant et montrant des signes d’anémie avant sa mise à mort. Les gestes se répètent sur deux à cinq mois. Toutes sont tuées pour prélever muscles, rate, poumons et moelle, les géniteurs à 30 semaines, les femelles non génitrices dès la naissance.
Résumé produit par un modèle de langage à partir du seul texte du laboratoire, selon une méthode arrêtée par l’OXA. Publié sans relecture individuelle préalable, sous la responsabilité de l’association, et corrigé au fil des relectures.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet, selon le laboratoire
Réponses rédigées par le laboratoire demandeur, à des fins de communication. Elles ne sont ni sourcées ni relues par des pairs.
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Dans quel but fait-on ça ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Les dysfonctions et faiblesses musculaires, causées par des maladies héréditaires, le cancer ou le vieillissement, comptent parmi les problèmes de santé publique les plus dévastateurs. Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à̀ délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont repartis dans tout l’organisme. Il est essentiel qu’un traitement puisse cibler efficacement tous les muscles affectés. Ce projet vise à̀ développer une nouvelle stratégie de délivrance musculaire, basée sur l’utilisation de cellules immunitaires modifiées pour fusionner à ces cellules musculaires. En effet, les cellules immunitaires ont la capacité naturelle d’atteindre tous les tissus de l’organisme, et dans la plupart des maladies musculaires, on observe une infiltration importante de cellules immunitaires au niveau des muscles. Ce projet utilise donc la capacité des cellules immunitaires à atteindre tous les muscles de l’organisme. En modifiant ces cellules pour les rendre capables de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à̀ générer un outil de délivrance qui puisse délivrer des traitements thérapeutiques aux muscles blessés. Cette approche est testée chez la souris, dans la lignée naturelle puis dans le modèle de myopathie de Duchenne, pour apporter une preuve de concept. Les cellules immunitaires modifiées sont administrées par une greffe de moelle osseuse, afin que tous les types cellulaires sanguins soient porteurs de cet outil thérapeutique de manière durable. Ceci permettra d’analyser la stratégie globale et d’identifier plus précisément quel type de cellules immunitaires sont importantes dans ce processus. Le projet permet de tester la capacité de fusion des cellules du sang génétiquement modifiées avec les fibres musculaires dans un contexte inflammatoire aigu (lésion) ainsi que dans un contexte inflammatoire chronique (modèle de myopathie). Il est important d’évaluer la fusion dans les deux contextes car il est bien documenté que les acteurs inflammatoires présents lors de la régénération musculaire, et la signature qui les accompagne, sont différents entre inflammation aigüe et chronique. On pourra ensuite utiliser cet outil dans le contexte thérapeutique en ajoutant une solution thérapeutique dans les cellules du sang afin qu’elle soit délivrée aux muscles dystrophiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Est-ce « inutile » ou « nécessaire » ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation du système immunitaire en tant que système de délivrance aux muscles squelettiques est une piste clinique pertinente. En effet, l’enjeu majeur est aujourd’hui la délivrance systémique des outils pour atteindre tous les muscles squelettiques afin les soigner. Nous pourrons montrer, non seulement la pertinence de cet outil in vivo pour une pathologie type dystrophie musculaire, la dystrophie de Duchenne, mais aussi ouvrir la voie pour d’autres dystrophies en adaptant la solution thérapeutique contenue dans le vecteur (les cellules du sang). Ce projet permettra aussi de comprendre plus précisément comment les différents types de cellules immunitaires thérapeutiques participent à la régénération en condition d’inflammation aigue (lésion) ou chronique (modèle de la myopathie de Duchenne), pour préciser les mécanismes de cette stratégie thérapeutique.
Nuisances prévues, selon le laboratoire
Réponses rédigées par le laboratoire demandeur, à des fins de communication. Elles ne sont ni sourcées ni relues par des pairs.
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Un examen publié en 2018 a établi que les résumés allemands et britanniques décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Le droit d'accès aux documents · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Afin de réaliser la préparation des animaux pour la greffe de cellules souche de moelle osseuse, des injections auront lieu 1 fois par jour sur une durée de 5 jours sur animaux vigiles avec une contention maximum de 1 minute. Le sixième jour, la greffe de moelle est réalisée en injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (injection en 2 minutes, temps total d’anesthésie 10 minutes maximum avec endormissement) et anesthésie locale (gouttes anesthésiantes préalablement administrées). Par la suite, la prise de greffe est contrôlée par prélèvement sanguin sous anesthésie: 1 à 5 fois par individu dépendamment des procédures, en respectant le maximum de prélèvement de 7,5% du volume sanguin 1 fois par semaine maximum (durée totale maximum d’anesthésie 10 min avec endormissement). Deux procédures incluent l’injection d’une molécule provoquant une lésion musculaire et déclenchant la régénération musculaire. Cette injection est réalisée sous anesthésie gazeuse (injection en 30 secondes, temps total d’anésthésie 10 minutes maximum avec endormissement) avec administration préalable d’analgésique.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Un nouvel examen, publié en 2024, a mesuré que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces mesures portent sur l'Allemagne et le Royaume-Uni. L'examen de 2018 classait la France parmi les pays les moins bons pour l'identification, l'accessibilité et la qualité de ses résumés, sans les noter rubrique par rubrique (Taylor et al., 2018). Les résumés français suivent aujourd'hui le modèle européen commun.
Les animaux souffrent-ils ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur manipulation lors des expérimentations et des pesées. Les procédures sont classées sévères de par la répétition des gestes expérimentaux sur une durée maximale de 2 ou 5 mois et la douleur que peut ressentir l’animal. Les souris peuvent présenter : – une sensibilité́ de la peau au niveau des zones d’injection pendant une durée de 5 jours. – une douleur de légère à modérée au niveau de l’œil pour une durée de 5 min minimisée par antalgique et anesthésique. – une perte de poids pendant 15 jours. – une douleur légère après la lésion musculaire au niveau de la patte minimisée par antalgique et une boiterie légère (quelques heures) du fait de la perte de volume musculaire localisée. L’utilisation d’un protocole de déplétion de moelle puis de greffe de moelle afin de reconstituer un système hématopoïétique « thérapeutique » comporte le risque que la greffe ne prenne pas. Ainsi parfois les cellules souches injectées ne parviennent pas à coloniser la niche et la souris ne produira plus de cellules sanguines nécessaires à sa survie (environ 20% des cas). Dans ce cas, l’animal s’affaiblit et montre des signes d’anémie par manque de globules rouges. Il est alors mis à mort dès la détection des points limite (suivi quotidien). Durant la période de reconstitution du système sanguin, le système immunitaire est affaibli, les souris sont donc manipulées en conditions stériles ainsi que nourries avec de la nourriture stérile afin d’éviter toute contamination. Le phénotype de la lignée génétiquement modifiée (modèle de la myopathie de Duchenne), n’induit pas de douleurs ni signes cliniques à l’âge choisi pour ce projet. Des difficultés de locomotion ou une gêne cardio-respiratoire peuvent apparaitre vers environ 18 mois après épuisement des capacités de régénération musculaire à cause des cycles de régénération musculaire réguliers dûs au phénotype (inflammation chronique). La lignée doit régulièrement être recroisée avec des souris de type naturel afin d’éviter la consanguinité. Il faudra alors réaliser des biopsies (queue) et identification par tatouage pour retrouver des couples homozygotes après les croisements.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Peut-on parler d'éthique en expérimentation animale ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Pour chacune des procédures, on réalise des analyses histologiques des muscles concernés. Cela nécessite donc des prélèvements de muscles post mortem. On prélèvera également des organes impliqués dans le système immunitaire tels que la rate, les poumons, la moelle osseuse pour des analyses histologiques du devenir des cellules du système sanguin. Pour le maintien de lignée ainsi que la production, les géniteurs seront mis à mort post production ou dès qu’ils atteindront 30 semaines. Les femelles non génitrices seront mises à mort à la naissance et/ou pourront servir à d’autres équipes pour des prélèvements.
Application de la règle des "3R", selon le laboratoire
Réponses rédigées par le laboratoire demandeur, à des fins de communication. Elles ne sont ni sourcées ni relues par des pairs.
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Comment avancer vers la fin de l'expérimentation animale ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Une preuve de principe validant la stratégie a déjà été obtenue in vitro, et les constructions génétiques thérapeutiques sont toutes validées in vitro au préalable. Les validations comprennent : la validation de l’expression des gènes d’intérêt par les constructions dans un modèle hétérologue in vitro, l’infectiosité des lentivirus sur les cellules souches hématopoïétiques, l’expression par les promoteurs dans celles-ci, et enfin la viabilité des cellules souches lors de l’induction des gènes d’intérêts. Le projet vise maintenant à déterminer si une délivrance systémique de cellules sanguines modifiées peut permettre de cibler les muscles, ce qui doit nécessairement être réalisé in vivo chez l’animal. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Pour les étapes impliquant la cardiotoxine, l’étude de la régénération musculaire se fait en comparant le muscle lésé, et celui en contralatéral, témoin. Cela permet de réduire le nombre de souris utilisées. Le calcul du nombre d’animaux par procédure s’appuie sur des analyses statistiques qui nous permettent d’avoir des résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir d’autres tissus pour d’autres projets de l’équipe ou de l’institut. En particulier les femelles produites lors de la formation des lots de souris modèle de la myopathie de Duchenne mâles mais non utilisées dans ce projet pourront être partagées avec des équipes de l’institut ne possédant pas de colonie.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
La réglementation est-elle « très stricte » ? · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiants sont utilisés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal. Les manipulations pour les pesées seront effectuées avec l’utilisation de tunnel ou de préhension douce sur la main. Les premières étapes de ce projet permettront de préciser les conditions expérimentales de protocole (voie d’administration) afin de raffiner la méthode pour les étapes suivantes. Des enrichissements et de la nourriture stériles sont utilisés afin de réduire les risques notamment lors de la phase immunodéficiente. En particulier, une alimentation enrichie (graine de tournesol, gels) sera fournie aux animaux pour encourager la prise de poids. Des antibiotiques peuvent être administrés en cas d’infection sur consultation du vétérinaire référent. Une attention particulière pour des signes de douleur est portée aux animaux dans les deux jours qui suivent l’injection de cardiotoxine, ou dans les deux semaines qui suivent la greffe de moelle, afin de veiller aux points limites décrits. La lésion musculaire à la cardiotoxine est communément utilisée et est administrée en même temps qu’un antidouleur afin d’assurer le bien-être animal. Une régénération totale du muscle est attendue en deux semaines. Les animaux modèles de myopathie participeront au protocole avant l’apparition de signes cliniques liés à la maladie. Les prises de sang hebdomadaires seront réalisées conformément au respect des volumes sanguins : maximum 7,5% du volume sanguin total sera prélevé et une semaine de délai sera respectée pour la reconstitution du sang. Par exemple, pour une souris le volume sanguin total est en moyenne de 70-80 mL/kg soit une souris de 25g : vol sanguin 1,75 mL : vol prélevé max 131 µL. Le plan d’expérience a été assisté grâce à l’outil EDA (https://eda.nc3rs.org.uk) proposé par le nc3r.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Spécisme et expérimentation animale · Comment lire un résumé non technique
Texte du laboratoire demandeur, reproduit tel quel
Ce projet permet de tester l’efficacité de la stratégie de diffusion à l’échelle systémique de la solution thérapeutique. Il n’existe actuellement aucun moyen de reproduire cela in vitro, d’où l’utilisation de modèles animaux. La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immunologie pour des expériences de greffe de moelle osseuse et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. Le protocole suivi pour la préparation des cellules greffées est au plus proche de ce qui est actuellement utilisé en clinique. De plus, le modèle murin dystrophique sert couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques. En effet, les souris ont une organisation musculaire squelettique très similaire à celle de l’Homme . On dispose donc chez la souris de tous les éléments permettant de tester notre stratégie : des modèles de la myopathie de Duchenne et des techniques essentielles (greffe de moelle osseuse, modification de gènes, etc.). Les souris de type naturel seront utilisées entre 8 et 10 semaines en début de procédure. Tout d’abord, le développement musculaire chez la souris se termine vers 5 semaines. De plus, la déplétion de moëlle ne se réalise usuellement pas avant 8 semaines de vie minimum. Malgré leur utilisation en tant que modèle de maladie, les souris modèle de la myopathie de Duchenne se comportent normalement, elles peuvent commencer à avoir un phénotype dommageable aux alentours de leurs 18 mois. Les animaux géniteurs ou utilisés pour les procédures sont mis à mort au plus tard à 30 semaines. Cependant les animaux seront utilisés entre leurs 2 et 6 mois, période durant laquelle la régénération musculaire est la plus intense et bien avant l’épuisement des capacités de régénération, et donc une éventuelle apparition de signes cliniques . Pour les géniteurs ils seront gardés 30 semaines au maximum pour s’assurer de bonnes capacités de reproduction.