Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/01/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-882912)
2 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des gavages ou injections quotidiens jusqu’à deux mois, des prises de sang à la queue et passent des tests de force et d’endurance musculaires, rotarod, grille inversée et tapis roulant, avec des isolements de 48 heures en calorimétrie et des mises à jeun. Le porteur étudie le rôle de métabolites du tissu adipeux dans la perte musculaire liée à l’âge et l’intérêt de les supplémenter chez la souris âgée. Sur le remplacement, il affirme que seule une approche intégrée in vivo rend compte de l’action systémique de ces métabolites entre organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Avec l’augmentation de l’espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu’elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Or, il a récemment été montré que le vieillissement du tissu adipeux blanc (TA) pouvait avoir un impact délétaire sur la fonction musculaire, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, on retrouve les métabolites, de petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence un défaut de production de certains métabolites par le TA âgé qui corrèle avec une diminution de leur concentration circulante et intra-musculaire chez la souris âgée. Compte tenu de leur importance dans le maintien de l’intégrité musculaire, un défaut d’approvisionnement des métabolites du TA vers le muscle au cours du vieillissement pourrait participer au développement du processus sarcopénique ainsi qu’aux désordres métaboliques qui lui sont associés (intolérance au glucose, résistance à l’insuline). Ainsi, l’objectif de ce projet est 1. de tester si une carence en métabolites-cibles identifiés comme sous-produits par le TA avec l’âge participe à la faiblesse musculaire et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. 2. de tester si supplémenter ces métabolites – individuellement ou en combinaison – chez la souris âgée (afin de restaurer leur disponibilité systémique) permet de prévenir/contrecarrer la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge. Cette procédure sera réalisée à la fois dans l’Etablissement Utilisateur 1/2 (US006/CREFRE Inserm/UPS/ENVT Zootechnie Expérimentale Langlade, EU0583 APAFiS N°#45674) et dans l’Etablissement Utilisateur 2/2 (US006/CREFRE/INSERM/UPS/ENVT/Rangueil, EU0549 APAFiS N°#45663), certains équipements nécessaires au phénotypage de nos animaux n’étant disponibles que dans l’EU1 ou que dans l’EU2.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l’âge en évaluant l’impact d’une carence en métabolites-cibles (précédemment identifiés comme étant déficitaires au cours du vieillissement) sur la mise en place des désordres musculaires et métaboliques associés à l’âge. Le potentiel thérapeutique de leur supplémentation chez la souris adulte/âgée devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir/contrecarrer le développement du processus sarcopénique ainsi que les désordres métaboliques qui lui sont associés.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Certains animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par gavage (moins de 15 secondes par souris), soit par injection intra-péritonéale ou sous-cutanée (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 2 mois (EU1/2). D’autres animaux seront supplémentées avec les métabolites-cibles de façon non invasive pour une durée de 2 à 6 mois en intégrant ces molécules à leur eau de boisson ou à leur nourriture (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (espacées d’au moins 6 semaines, durée approximative d’intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système de résonance magnétique nucléaire (RMN) (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l’aide de différent tests non invasifs (mesure de l’équilibre avec le système Rotarod (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche lors d’une marche spontanée à l’aide d’un test de distribution pondérale cinétique (KWB) (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire grâce à un dynamomètre relié à une grille (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l’animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l’animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose (GTT) et à l’insuline (ITT) pourront également être réalisés (prélèvements de sang durant les GTT/ITT pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) pour la GTT ou une injection intra-péritonéale d’insuline (moins de 15 secondes par souris) pour l’ITT (EU1/2). L’ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu’à 4 fois dans la vie de l’animal, avec une période minimale de 6 semaines entre deux tests.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée); 2. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine.; 3. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu’aux dispositifs expérimentaux); 4. Des gavages répétés quotidiennement peuvent induire une irritation de l’oesophage et des injections intra-péritonéales ou sous-cutanées répétées quotidiennement une douleur au niveau du point d’injection (les sites d’injection seront changés chaque jour) 5. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 6. les prises de sang à la queue sont source d’inconfort (prélèvement d’un volume restreint de sang (80ul) espacé de 15 jours au minimum)
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d’expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l’âge et des désordres métaboliques qui lui sont associés, ainsi que leur potentielle amélioration par des stratégies de supplémentation en métabolites-cibles. Ceci nécessite de prendre en compte l’action systémique des métabolites-cibles administrés, ainsi que la contribution relative des différents organes métaboliques au phénotype, ce qui ne peut être réalisé que par une approche intégrée in vivo. Lorsque possible, une partie de l’étude sera réalisée sur des lignées immortalisées de cellules musculaires humaines afin de répondre à des questions plus ciblées ne nécessitant pas une approche intégrée.
2. Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d’études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l’âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d’animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. De plus, une veille bibliographique sera effectuée afin d’éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d’autres équipes de recherche sur les mêmes molécules. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
3. Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Lors du transport des animaux, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Lors de leur arrivée à la zootechnie, les animaux seront placés en pièce d’acclimatation. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l’on vient attraper l’animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins une fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu’aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. De plus, en ce qui concerne la stratégie de supplémentation en métabolites-cibles, une approche physiologique non invasive via leur eau de boisson/nourriture sera privilégiée afin d’améliorer le bien-être animal et réduire le stress lié aux expérimentations. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d’expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes», 10-14 mois pour les souris adultes d’âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de caractériser la contribution d’un déficit en métabolites-cibles dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.