Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-965674)
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes et greffées avec des cellules souches humaines, elles reçoivent des injections répétées à doses croissantes d’un traitement anticancéreux, des prélèvements sanguins et une imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine, avant euthanasie. L’objet est le développement préclinique d’une immunothérapie contre des cancers du sang avant un essai clinique, les retombées pour les patients restant renvoyées à ce projet futur. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut se modéliser in vitro et invoque l’effet de l’organisme entier.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR in vivo (stratégie d’immunothérapie cellulaire) ciblant un marqueur tumoral que nous souhaitons mener jusqu’à la démonstration de sa sécurité et de son efficacité thérapeutique dans des indications de cancers du sang. Ces résultats sont un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2022. Il s’agit d’évaluer l’efficacité anti-tumorale lorsque notre CAR in vivo est injecté et distribué entre les différents compartiments de l’organisme dans un modèle murin humanisé. Ce projet nous permettra également de démontrer chez l’animal que la modification des cellules sanguines est bien spécifique des lymphocytes T (globules blancs du système immunitaire) ciblés et que notre CAR in vivo est bien toléré lors d’administrations répétées à des doses croissantes. Ces problématiques ne peuvent être abordées que via l’expérimentation animale. Aussi nous explorerons l’efficacité anti-cancéreuse, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines. Le choix de la souris NSG-hCD34+ est justifié car c’est un modèle de référence en oncologie très largement caractérisé́ et dont la prédictibilité a été démontrée dans de nombreuses études en immunothérapie.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR T-cell in vivo dirigé contre le marqueur tumoral CD19 qui doit nous permettre de démontrer sa sécurité et son efficacité thérapeutique dans des modèles de cancers hématologiques. Cette preuve de concept d’efficacité anti-cancéreuse est un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2023 chez les patients atteints de cancers hématologiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins à 5 temps différents (J-7, J+3, J+10, J+17, fin de projet). Ils seront aussi soumis à des injections par perfusions ou injections, ces perfusions/injections seront au nombre de 3 à 5 d’affilé. Ils passeront ensuite des examens d’imagerie par bioluminescence 1 à 2 fois par semaine.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isolflurane
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La biodistribution d’un composé implique une interaction forte entre les différents compartiments de l’organisme, c’est à dire un échange entre le sang et les organes. Actuellement, il n’est pas possible de modéliser cette répartition tissulaire in vitro. Par ailleurs, même si l’innocuité des composantes de notre produit (lentivecteur + polymère + agent de ciblage anti-CD3) a déjà été vérifiée dans nos tests cellulaires et in vivo (par d’autres groupes), l’effet de l’organisme entier sur le lentivecteur associé au polymère ne peut être complétement évalué. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l’efficacité, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris NSG (NOD scid gamma) immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines. L’expérimentation chez la souris est nécessaire pour démontrer que la transduction des cellules cibles est toujours efficace quand notre produit injecté en systémique et distribué entre les différents compartiments de l’organisme.
2. Réduction
Afin de minimiser la consommation inutile des 105 souris qui pourraient être exposées à des doses dépassant la dose maximale tolérée, nous avons prévu 3 procédures qui seront lancées de manière séquentielle après avoir vérifié que les doses et protocoles d’injections de la procédure précédente ne présentent pas de toxicité macroscopique particulière. Le nombre de souris par groupe nécessaire et suffisant pour pallier à la forte variabilité interindividuelle observée en imagerie de bioluminescence et en cytométrie de flux a été défini. De plus il permet de démontrer l’efficacité du traitement par rapport aux groupes contrôles grâce à l’analyse statistique des résultats (tests one-way ANOVA et Kaplan-Meier) avec une signification suffisante (valeur p
3. Raffinement
Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d’anesthésie et de prise en charge de la douleur par l’injection d’analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement est aussi quotidiennement contrôlé et l’enrichissement est présent et adéquat au vue de l’espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose)
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le modèle de référence en oncologie, notamment du fait de l’existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. La multitude de références bibliographiques en fait donc un modèle de choix. Par ailleurs, de nombreuses études en immunothérapie ont montré de bons résultats dans le modèle murin NSG-hCD34+. Ces animaux sont greffés avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines et se caractérisent par une excellente maturation des cellules T et la présence de cellules CD4+ et CD8+ dans la circulation et autres tissus. Cette souche constitue un modèle idéal pour vérifier in vivo la spécificité pour les lymphocytes T des promoteurs humains et des aptamères anti-CD3 développés en interne. Enfin le modèle de lymphome choisi et basé sur l’injection systémique de cellules Ramos humaines exprimant la Luciférase est également un modèle reconnu qui a été utilisé pour l’évaluation préclinique de différents agents anti-cancéreux. Les animaux utilisés seront adultes. Ce choix est nécessaire pour pouvoir injecter des volumes d’au moins 250 µL en iv ou 450 µL en perfusion contrôlée et lente (22,5 µL/min) étant contraints par les titres (nombre de particules virales infectieuses) de nos préparations de lentivecteurs. Après réception dans l’animalerie et observation de la quarantaine, une période supplémentaire de 2 semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et régime alimentaire sera respecté afin de réduire autant que possible l’état de stress des individus et ainsi avoir des animaux dans un état général optimal pour supporter des anesthésies générales répétées.