Protection de l’environnement

5 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis éventuellement réintégrées au troupeau non expérimental. Hébergées en stabulation entravée pendant quinze semaines, elles subissent des prélèvements sanguins et des prélèvements répétés de jus de rumen par une canule, avec collectes totales d'urine et de fèces sur cinq jours par période. Le porteur indique que certains régimes peuvent réduire l'ingestion et la production laitière. Il affirme qu'aucune autre approche ne peut remplacer la vache pour étudier les flux d'azote, notamment au sein du rumen.

Objectifs

Dans l’objectif d’atteindre la multi-performance, les élevages laitiers doivent mieux valoriser les ressources alimentaires, notamment celles non consommables par l’homme, comme les fourrages, distribués frais ou conservés. Les conséquences de ces associations de fourrages conservés et pâturés (ou distribués en affouragement vert) sur les performances animales, la possibilité de réduire les intrants, l’efficience d’utilisation de l’azote et la composition des effluents doivent être approfondies. Cet essai aura pour but de suivre les variations de flux d’azote à l’échelle de la vache laitière lorsque celle-ci est nourrie avec des rations associant herbe fraiche et ensilage de maïs selon des proportions variables. Il sera réalisé à l'auge afin de pouvoir mesurer précisément les flux d'azote (ingéré et excrété) à l'échelle individuelle et de la journée. Cinq traitements expérimentaux seront comparés : un traitement à base d’une ration mélangée d’ensilage de maïs et de tourteau de soja en proportion 85/15, 3 traitements permettant l'ajout progressif d’herbe verte à cette même ration mélangée maïs-soja, à hauteur de 25, 50 et 75% d’herbe verte, et 1 traitement à base d’herbe verte seule.

Bénéfices attendus

L’influence des traitements sur la composition des effluents (urine seule, fèces seuls, lisiers reconstitués) sera évaluée afin d’estimer les pertes d’azote vers l’environnement, potentiel source de pollution, et le potentiel d’émission de NH3. Le suivi en cinétique des paramètres fermentaires dans le rumen (ammoniac, acides gras volatiles, pH), et de la caractérisation de l'activité fermentaire du rumen (dégradation d'un aliment témoin permettront de caractériser les conséquences de ces stratégies d'alimentation sur la dynamique des fermentations, la digestibilité de l'azote et la valeur protéique réelle des rations étudiées.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront hébergés en stabulation entravée, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (10 traites par semaine). Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale, à raison de 4 par périodes (soit 16 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang). Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisés pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées, avec les prélèvements en cinétique de jus de rumen par la canule à raison de 10 prélèvements par période, de 5 minutes maximum chacun répartis sur 1 journée (soit 40 prélèvements au total), ainsi que des mesures de dégradabilité in sacco avec incubation de coques de soja dans le rumen sur une période de 24h, 1 fois par période (soit 4 fois au total, 5 minutes de pose et de retrait des sachets dans le rumen).

Impact sur les animaux

Il est possible que certains des régimes étudiés entrainent une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Quantifier les effets de ces régimes sur l’ingestion et la production des animaux est un des objectifs de l’essai. Toutefois ces cinq traitements sont des rations pratiquées en élevage qui ne devraient pas entrainer de conséquences néfastes sur la santé des animaux.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre approche pour cet essai car le but est d’étudier les flux d'azote à l'échelle de la vache, incluant des mécanismes de recyclage/mobilisation notamment au sein du rumen et par la salive.

Réduction

Le schéma expérimental en carré latin ainsi que l'analyse statistique des données permettront de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le nombre de vaches à 5 dans ce projet. L’utilisation d’un carré latin permet que chaque animal soit son propre témoin, pour ainsi réduire le plus possible le nombre de vaches tout en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer les effets des traitements expérimentaux. L'utilisation d'analyses de variance permettra de tester l'influence du facteur "proportions d’herbe verte" sur les variables de production (ingestion, production laitière...) et de flux d'azote (azote ingéré, azote excrété dans le lait, l'urine, les fèces) en corrigeant des effets "vache" et "période".

Raffinement

Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront isolés et soignés selon les prescriptions du vétérinaire. Les régimes testés, classiques, n'induiront a priori aucune douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisées seront de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée.

1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.

Objectifs

Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.

Bénéfices attendus

En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée deux plaies dorsales par chirurgie sous anesthésie, on leur pose une puce télémétrique et on les traite au plasma froid une à deux fois par jour, pour mettre au point un modèle de plaie chronique infectée par des bactéries résistantes. Le porteur reconnaît une douleur et une gêne aux déplacements au réveil, et prévoit des prélèvements de peau et de rate après la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'aucun modèle in vitro ne représenterait un cas clinique.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmatiques existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fourniront les données d’une preuve de concept. Les résultats du projet ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également d’améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance résistantes en médecine humaine et vétérinaire.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation du kINPen ou du Multijet avec un nouveau mélange de gaz soi efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques et pour améliorer la cicatrisation des plaies d'animaux présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduira notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne sur la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma, le multijet, sera également utilisé. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace , sinon plus, que le premier quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, permettant ainsi de traiter une surface de plaie plus importante et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de ce système pour entièrement décontaminer du matérial médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie général, suivi d'un protocole de gestion de la douleur post-opératoire (injection en intra-péritonéale des immunostimulants (introduction aiguille) une à deux fois par jour durant 3 jours. Les animaux auront une prise de sang à veine sub-mandibullaire (introduction aiguille) une fois tous les 5 à 7 jours pendant quelques secondes. Les animaux seront équipés d'une puce télémétrique (introduction aiguille) en début d'expérimentation (1 fois) pendant quelques secondes. Les animaux seront traités par le plasma à froid 1 ou 2 fois par jour pendant quelques minutes (non invasif).

Impact sur les animaux

Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 364 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-morterm pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) popur l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (animaux du même groupe et de même sexe pour limiter la variabilité). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique : Kruskall-Wallis pour l’étude de la réponse immunitaire d’animaux et cicatricielle.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation sera effectuée pour limiter au maximum les perturbations liées à un nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour (télémétrie, signes cliniques tels que le poids, l’apparence et le comportement général). L’eau et la nourriture seront ad libitum. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Les souris sont hébergées dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. La pose des puces est faite sous anéthésie générale à l'isoflurane. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, un dépôt de Tronothane® 1 % (pramocaïne, gel). Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire de buprénorphine (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie Période opératoire : anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate de méloxicam (20 mg/kg, SC). Suivi Injection de buprénorphine (même dose) le soir. Injection de méloxicam (20 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection de buprénorphine (même dose) à la demande (2 fois/jour, à J1, J2 et J3) en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique. Age des souris = 6-7 semaines. Les souris doivent être de jeunes adultes pour pouvoir faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature.

3 150 rongeurs, soit 1 050 souris, 1 050 rats et 1 050 rongeurs d'autres espèces, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des appâts rodenticides, une entreprise cherchant à développer et homologuer ces produits destinés à les tuer. Le porteur reconnaît qu'il est "certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort", les survivants étant ensuite tués. Il présente ces essais comme une "obligation réglementaire européenne" imposant de tester chaque espèce cible et un nombre minimal d'animaux.

Objectifs

Il existe un vrai besoin de développement de nouveaux appâts rodonticides à mettre sur le marché de la lutte contre les rongeurs nuisibles. Cette lutte est justifiée par la nécessité absolue de préserver les personnes et les biens (alimentation, bâtiments et matériels) des risques et méfaits induits par ces rongeurs cibles nuisibles. En effet, ces derniers sont porteurs de zoonoses (maladies transmissibles à l’homme) et sont responsables de plusieurs milliers de morts chaque année, via des contaminations directes ou indirectes. Les maladies véhiculées par les rongeurs ont tué plus de personnes au cours des 10 derniers siècles que toutes les guerres. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité de divers appâts rodenticides, depuis leur développement jusqu'à leurs autorisations de mise en marché (AMM), aux renouvellements périodiques des homologations, ainsi qu'à leur benchmark par rapport aux produits du marché. Il permettra également de faire progresser la connaissance scientifique. La société développe et commercialise des produits de lutte contre les rongeurs nuisibles, sous forme d’appâts. Ces appâts doivent répondre à de nombreux critères pour être efficaces et homologués. Ils doivent être appétents pour les cibles visées afin qu’ils soient consommés et que les rongeurs ingèrent la substance active qu’ils contiennent. Ils doivent être adaptés aux conditions d’utilisation variables selon les cas : lieu sec, humide, chaud, froid … et assurer la stabilité de la substance active et de l’appétence au cours du temps. Le besoin de régulation des populations de rongeurs nuisibles et les exigences réglementaires contraignantes imposent le développement et l'optimisation des formulations d'appâts. Pour procéder à leur développement et à leurs homologations, la société a besoin de conduire des essais sur des produits nouveaux. Elle doit également conduire des essais sur des produits connus en vue du renouvellement périodique de leurs homologations. Enfin, elle se doit de benchmarquer les produits concurrents qui arrivent sur le marché. L’objectif de ce protocole doit permettre de développer puis de valider l’appétence et l’efficacité de formulations d’appâts contenant des substances rodonticides en vue de leur homologation sur les 3 espèces cibles. Les animaux seront utilisés au stade adulte et répartis entre mâles et femelles, le plus équitablement possible. Pour être validé, un essai devra afficher une efficacité d’au moins 90%.

Bénéfices attendus

La conduite de ces essais d'efficacité et d'appétence permettra à l'entreprise de progresser dans ses connaissances au niveau de la formulation d'appâts et de finaliser le développement des nouveaux produits, avant d'engager les demandes d'homologation. Dans les dossiers de demande d'homologation, la réglementation européenne impose la présentation de résultats d'essais conduits en laboratoire avec des animaux de chacune des espèces cibles revendiquées dans les demandes d'AMM. La guidance de l'ECHA impose également le nombre minimum d'animaux par essai, afin d'avoir une représentativité suffisante.

Procédures

Lors de la procédure expérimentale n°2, les animaux seront soumis à des opérations de gavage. Ces gavages pourront être uniques : 1dose gavée une seule fois, ou répétés, une fois par jour sur 2 à 5 jours consécutifs. Les opérations de gavages auront une durée limitée d'une minute par gavage. Pour les procédures expérimentales 1 et 2, les animaux pourront être soumis à un prélèvement sanguin (procédure n°3), sous anesthésie terminale, juste avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans la mesure où les produits à tester sont des rodonticides, il est certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort. Afin de réduire au maximum ces nuisances, la règle des 3R et le respect de l'atteinte des points limites seront appliqués.

Devenir

Tous les animaux survivants à l'issue des procédures 1 et 2 seront euthanasiés. En effet, l'exposition aux substances actives et la durée des essais ne permettront pas de les réutiliser dans d'autres essais.

Remplacement

La conduite des essais sur les rongeurs cibles : rats (Rattus norvegicus et Rattus rattus) et souris (Mus musculus) répond à une obligation réglementaire européenne et ne peut être remplacée. Pour pouvoir accéder au marché, ces appâts doivent être homologués. Une des conditions requises pour l'obtention de l'homologation consiste à fournir des résultats d'essais d'efficacité, conduits en laboratoire, selon la guidance de l'ECHA (Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018) qui impose que les essais soient conduits sur les espèces cibles. Par ailleurs, il n'existe pas de méthode de substitution pour valider l'efficacité et l'appétence des appâts. Le recours aux animaux est donc obligatoire.

Réduction

Les trois espèces cibles (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) ont des comportements alimentaires différents. Elles ne sont donc pas substituables. Selon la réglementation européenne, les essais doivent être conduits en laboratoire sur chaque espèce cible pour l'obtention des AMM. Les guidances mentionnent qu'il est nécessaire d'utiliser au moins 10 animaux par essai afin d'atteindre une représentativité suffisante des résultats. Imposé par la réglementation, ce nombre d'animaux par essai ne pourra être réduit. Il est prévu, pour la première année du projet : Procédure 1 : 10 essais par espèce, puis 15 essais par an les 4 années suivantes, soit(10x12x1+15x12x4=) 840 animaux par espèce, soit 3x840= 2520 animaux au total, pour la procédure 1 sur la durée du projet. Procédure 2 : 5 essais, dont 2 avec groupe témoin, par espèce et par an soit (5x6x5 + 2x6x5=) 210 animaux par espèce cible sur la durée du projet, soit au total 630 animaux pour la procédure 2 sur la durée du projet. Pour la procédure 3, il n'est pas prévu d'animaux supplémentaires. Les animaux intégrant cette procédure seront tous issus des procédures 1 ou 2. Le total d'animaux prévu sur l'ensemble du projet est donc de 2520 + 630 = 3150 animaux sur les 5 ans du projet. Ce nombre est justifié par le besoin d'appâts de formulations variées afin de répondre aux besoins des différents sites à traiter selon leurs caractéristiques.

Raffinement

Les essais seront conduits dans un environnement enrichi - objets susceptibles d’être rongés ou déchiquetés et pouvant servir à la construction de nids (papiers, cartons, etc)-, par des personnels qualifiés formés au respect des conditions du bien-être des animaux, afin de minimiser au maximum le stress et la souffrance imputables à ces essais. Afin de respecter le caractère grégaire des animaux, les rats seront hébergés à 3 par cage et les souris par groupe de 5 ou 6, en veillant à séparer les mâles des femelles. Pour éviter toute souffrance inutile, le concept de Raffinement et de points limites sera mis en œuvre. Un suivi clinique des animaux sera effectué, au moins quotidiennement, afin de relever la présence d’éventuels symptômes de mal-être. Les animaux moribonds ayant atteint des points limites seront euthanasiés, en accord avec la structure en charge du bien-être animal de l’EU. Pour les essais par gavage et pour les prélèvements sanguins, les gestes techniques seront réalisés par des personnels formés et expérimentés.

Choix des espèces

Les 3 espèces (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) répondent à une exigence réglementaire européenne (Règlement BIOCIDE au niveau européen, selon guidance ECHA : Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018). En effet, ces trois espèces représentent les 3 cibles majoritaires des produits développés pour la protection des personnes et des biens, contre les rongeurs nuisibles. La réglementation impose que des essais d'efficacité et d'appétence soient conduits en laboratoire sur chacune des espèces cibles. Les animaux des 3 espèces seront utilisés au stade adulte afin de respecter les guidances de l'ECHA (European CHemical Agency) pour ce type d'essai.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par asphyxie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés en cage métabolique puis mis à jeun seize heures, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des farines de quatre insectes destinées à l'alimentation humaine. Le porteur reconnaît que l'environnement appauvri et la privation de nourriture induisent une angoisse et un stress modérés. Il affirme que ces effets nutritionnels ne peuvent être évalués in vitro ni maîtrisés directement chez l'homme.

Objectifs

Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de poissons (dont la disponibilité diminue) et de viandes. Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à̀ la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets organiques et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Suite aux résultats obtenus dans une étude préliminaire précédemment autorisée, il a été identifié une première farine d’insectes, source de protéines et enrichie en certains oligo-éléments (fer). Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’approfondir les effets observés en évaluant les impacts sur d’autres nutriments (fibres, acides gras, acides aminés) mais aussi en évaluant des impacts physiologiques (activité anti-inflammatoire, effet prébiotique, effet sur l’immunité). De plus, 3 autres types de farines provenant d’autres insectes seront étudiées et comparées.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel en minéraux, oligo-éléments, vitamines, acides aminés, acides gras essentiels et le statut antioxydant de ces farines d'insectes seront supérieur à une alimentation standard, ce qui mettra en évidence un potentiel bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées en alimentation humaine en substitut aux protéines d'origine animale.

Procédures

Les rats seront placés en cage métabolique pendant 40 heures au total. Durant les 24 premières heures, les rats recoivent eau et aliments spéciaux sans restriction. Ensuite, les rats seront placés à jeun pendant 16 heures toujours en cage métabolique, l'eau sera accessible sans restriction durant cette période. A l'issue de la procédure expérimentale, les rats seront mis à mort par asphyxie.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole et la mise à jeun pendant 16h, ceci classe la procédure en classe gravité modérée selon les recommandations réglementaires (https://www.legifrance.gouv.fr/loda/id/LEGITEXT000027038877/2020-09-23/) : en effet, l'environnement apauvri (pendant 2 jours) et la privation alimentaire (pendant une journée) induisent une angoisse et un stress modérés.

Devenir

Les rats seront mis à mort par asphyxie afin de recueillir tissus et organes qui doivent être analysés pour obtenir les résultats scientifiques escomptés.

Remplacement

L'étude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (42 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres, ce qui ne serait pas possible si l’étude était réalisée directement chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. De plus, nous souhaitons tester des farines issues de quatre insectes qui présentent des propriétés nutritionnelles différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à proposer pour l'alimentation humaine.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera ajouté au maximum 30 % de farines d’insectes. La formulation finale des aliments permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels, caloriques et physiologique des rats (aliments sous forme de croquettes à ronger). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelle, dans un environnement adapté et contrôlé dépourvu de pathogènes. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies sans restriction excepté pendant les heures de jeun. Le milieu sera enrichi pour pallier l'isolement. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle animal a été choisi en tenant compte de la littérature récente. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des rats. Nous nous appuyerons sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. De plus, ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude préliminaire précédemment autorisée réalisée sur des rats. Nous utiliserons de jeunes rats âgés de 6 semaines au démarrage de l’étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc adapter notre modèle animal à cette tranche d'âge.

370 poissons sauvages, bars européens et lieus jaunes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu subit une chirurgie abdominale sous anesthésie pour l'implantation de marques électroniques, avec prélèvement d'écailles et d'un fragment de nageoire. 350 poissons sont relâchés en mer après marquage et 20 sont tués en milieu contrôlé pour caler le protocole sur le lieu jaune. Le porteur indique que le traumatisme de la pêche, de l'anesthésie et de la chirurgie peut entraîner des mortalités, et juge ces connaissances "indispensables" à la gestion des pêches.

Objectifs

Un manque de connaissance existe sur les habitats dont les poissons ont besoin pour se reproduire, se nourrir ou grandir, et sur leurs connectivités, empêchant une mise en œuvre à grande échelle de l’approche écosystémique des pêches. Pour atteindre le double objectif d’optimisation des équilibres entre les différents usages des richesses de l’océan tout en préservant la biodiversité et de minimisation des impacts des activités humaines sur les écosystèmes marins, l’approche écosystémique des pêches doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie du mouvement des espèces et à la fréquentation des habitats essentielles et leur connectivité. Le projet cherchera à combler ces lacunes par le déploiement d’un réseau de télémétrie acoustique et le suivi par marquage des déplacements d’une sélection d’espèces d’intérêt halieutique. Nous analyserons les mouvements et migrations du bar européen (Dicentrarchus labrax) et du lieu jaune (Pollachius pollachius) au stade adulte en Manche. Ces espèces cibles sont des composantes importantes des écosystèmes littoraux étudiés et des espèces commercialement importantes pour la région. Ces connaissances participeront à la compréhension de la structure spatio-temporelle de ces populations et de la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. Dans ce cadre, notre étude prévoit de marquer 370 poissons sauvages adultes (bar européen (Dicentrarchus labrax) et lieu jaune (Pollachius pollachius)). Ces opérations de marquage se basent sur un protocole qui a été développé et validé sur le bar adulte lors d’une étude pilote (2010-2012) et d’une étude à grande échelle (2014-2016) pour suivre ses mouvements et migrations. La présente demande d’autorisation de projet concerne 2 procédures de classe modérée : la première concerne l’adaptation du protocole de marquage au lieu jaune (n=20 individus), qui se déroulera en milieu contrôlé à l’issue d’une période d’acclimatation d’individus sauvages aux structures expérimentales ; la deuxième procédure concerne le marquage en milieu naturel de poissons sauvages adultes (n=350 individus ; 50%-70% bar et 30%-50% lieu jaune).

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et ainsi de répondre aux questions suivantes : Comment se comportent-elles sur la verticale ? Dans quel but ? Quels sont les habitats fréquentés et quelles fonctions (alimentation, reproduction, croissance, etc.) permettent-ils de réaliser ? Existe-t-il des migrations saisonnières entre ces habitats ? Comment ces mouvements structurent-ils la population ? Existe-t-il des sous-populations démographiquement indépendantes ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur le lieu jaune. Bien moins que pour le bar européen, pour lequel un gros effort de marquage a eu lieu dernièrement. Cependant, pour ce dernier, les résultats attendus de ce projet permettront de démontrer l’intérêt à moindre risque (en terme de maitrise du protocole de marquage) d’un réseau pérenne de télémétrie acoustique (inexistant en Manche), de préciser la délimitation de 2 sous-populations à la fois côté français et côté anglais de la Manche à l’aide de reconstructions validées. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces 2 espèces d’intérêt halieutique, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour implémenter l’approche écosystémique des pêches sur les sites suivis afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général.

Procédures

La présente demande d’autorisation de projet concerne 2 procédures de classe modérée : la première concerne l’adaptation du protocole de marquage au lieu jaune (n=20 individus), qui se déroulera en milieu contrôlé à l’issue d’une période d’acclimatation d’individus sauvages aux structures expérimentales ; la deuxième procédure concerne le marquage en milieu naturel de poissons sauvages adultes (n=350 individus ; 50%-70% bar et 30%-50% lieu jaune). Lors de ces 2 procédures, bars et lieus jaunes seront soumis à une intervention chirurgicale nécessaire à l'implantation de marques électronique et acoustique dans la cavité abdominale. Il y aura une chirurgie par individu, sauf pour 10 individus de la procédure 1. Elle se fera sous anesthésie et des antalgiques seront donnés par injection intra-musculaire pour minimiser les douleurs post-opératoires. Des prélèvements auront lieu de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale afin de déterminer l'âge des individus et faire des analyses génétiques respectivement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus du marquage en milieu naturel sont des mortalités liées au traumatisme de l’expérimentation (pêche, anesthésie et chirurgie) et à la cicatrisation de la suture (infection). Des problèmes de croissance, de comportement et de mouvement liés à l’encombrement des marques dans la cavité abdominale peuvent être aussi attendues, cependant le poids total des marques ne représentant pas plus de 2% de la masse corporel des poissons marqués, ces effets devraient être minimes. Les effets indésirables attendus du marquage en milieu controlé sont les mêmes qu'en milieu naturel, à la différence que les individus pourront être surveillés. En milieu controlé, il se rajoute le stress de la captivité et des conditions d'élevage.

Devenir

L'objectif de l'étude est d’analyser les mouvements et les migrations du bar européen (Dicentrarchus labrax) et du lieu jaune (Pollachius pollachius) au stade adulte en Manche afin de mieux comprendre la structure spatio-temporelle de ces populations et la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. Il est donc indispensable de travailler sur des animaux issus du milieu naturel et que nous relacherons dans le milieu naturel après leur marquage. 20 individus seront prélevés dans le milieu naturel et sacrifiés (euthanasie en fin d'expérimentation) pour adapter en milieu controlé un protocole de marquage, qui sera ensuite utilisé sur le terrain.

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. Il est nécessaire de faire des marquages électroniques de poissons qui seront ensuite relâchés dans le milieu naturel. Deux sources de données seront utilisées pour reconstruire les mouvements des individus marqués : 1) des données de température et de profondeur acquise à haute fréquence temporelle par les marques DST permettent d’inférer les mouvements grâce à de la modélisation ; 2) des données de télémétrie acoustique permettent de détecter la présence de poissons marqués (émetteur acoustique) sur un réseau de récepteurs déployé en milieu côtier. La combinaison des deux approches permettra de valider les mouvements obtenus par modélisation. Du fait que nous ne disposons pas de retours d’expérience de marquage sur le lieu jaune en milieu naturel et que ce poisson soit une espèce plus fragile que le bar, il est indispensable d’évaluer en milieu controlé la survie des individus marqués et l’adaptation du protocole de marquage à cette espèce notamment en termes de sédation et d’anesthésie.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Procédure 1 (adaptation du marquage au lieu jaune en milieu contrôlé): L'expérience sera conduite sur 2 lots de 10 poissons chacun. L'analyse consistera à la comparaison des taux de survie et d'indice de condition par traitement statistique pour petits échantillons. Procédure 2 (marquage en milieu naturel): Il est prévu de marquer, dans le milieu naturel, 350 poissons adultes (50%-70% bar européen et 30%-50% lieu jaune) sur 3 sites répartis en Manche. Ce nombre est un compromis entre le coût de l'opération et le nombre de recaptures escomptées de 15% en moyenne soit 17 poissons par site et 51 poissons au total, ces recaptures devant être considérées comme représentatives des populations étudiées.

Raffinement

Pour la phase de captivité, les mesures de raffinement tiennent compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés et seront surveillés de manière régulière. Ils seront retirés de la procédure dès qu'un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale), la perte de poids ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). La méthode de mise à mort envisagée est une euthanasie par administration d'une dose létale d'anesthésiant après sédation. Les expérimentations en mer utiliseront des techniques de pêche qui n’altèrent que peu l’état de santé des poissons capturés (ligne ou palangre). Si leur condition corporelle est bonne, les individus seront maintenus en groupe dans de grands bassins afin qu’ils s’y sentent bien (comportement calme). Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés et seront surveillés au moins deux heure avant d’être relâchés dans le milieu naturel. Ils seront retirés de la procédure dès qu'un point limite sera atteint. Les points limites auront été affinées via la première procédure en milieu contrôlé. La méthode de mise à mort envisagée est une euthanasie par administration d'une dose létale d'anesthésiant après sédation.

Choix des espèces

Le projet se focalise sur le bar européen, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. La structure spatio-temporelle de cette ressource remet en cause la délimitation actuelle des stocks de bar. Il existe un besoin d’affiner nos connaissances sur l’espèce au niveau de la zone de mélange de stocks, i.e. en Manche. Le projet s’intéresse aussi au lieu jaune, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale dont les stocks sont classés à données limitées, conjugué à un manque patent de connaissances sur l'écologie de cette espèce. Du fait, de son poids économique plus important et de ses enjeux de gestion omniprésents (reconstitution de la biomasse du stock Nord, et remise en cause des limites de stocks), le marquage de bars est jugé prioritaire. La proportion attendue des espèces marquées pourra être plus forte pour le bar, i.e. 50%-70% de bars et 30%-50% de lieus jaunes. Nous nous focaliserons sur le stade adulte, car il permettra d'améliorer nos connaissances sur les migrations de reproduction et les zones de frayère, habitats essentiels à protéger pour exploiter durablement ces espèces.