Production de routine

Le nombre de souris utilisées chaque année dépend, selon le porteur, des "prévisions de vente de nos tests diagnostiques" de la toxoplasmose. 2 500 souris vont être utilisées en cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le péritoine une injection de Toxoplasma gondii, qui s'y multiplie pendant trois jours, avec poil hérissé, baisse d'activité, perte de poids et parfois abdomen distendu ou posture voûtée. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale, et les parasites récoltés par lavage de leur cavité péritonéale entretiennent la souche d'où l'établissement tire l'antigène qu'il vend.

Objectifs

Le diagnostic de la toxoplasmose, notamment chez la femme enceinte, repose sur l’utilisation d’un antigène toxoplasmique. Cet antigène est obtenu à partir de la culture du parasite Toxoplasma gondii. Le recours à des animaux permet de préserver les caractéristiques biologiques de la souche parasitaire avant sa multiplication en conditions in vitro. La quantité de souris utilisée chaque année dépend directement du volume d’antigène nécessaire, lui‑même lié aux prévisions de vente de nos tests diagnostiques. Ce projet a déjà fait l’objet d’une autorisation réglementaire.

Bénéfices attendus

Cette culture permet la production d'un antigéne Toxo utilisé dans le diagnostic de la toxoplasmose chez la femme enceinte.

Procédures

Les animaux subiront une seule injection. celle ci consiste à introduire les parasites (tachyzoïdes) dans le péritoine Injection de 0.5ml de cette solution en IP (intra péritonéale). l'animal est placé en stabulation durant 3jours. La récolte des tachyzoides se fait sur les animaux préalablement euthanasiés (dislocation cervicale)

Impact sur les animaux

Effets liés aux manipulations : stress transitoire lié à la contention et douleur brève et légère au moment de l'injection intrapéritonéale. Rarement, une réaction inflammatoire locale ou une lésion d'un organe abdominal liée au geste d'injection. Ce risque est limité par un personnel formé et par l'utilisation d'aiguilles de petit calibre. Effets liés à l'infection : la multiplication des toxoplasmes dans la cavité péritonéale entraîne une réponse inflammatoire et immunitaire. Sur la durée du protocole (3 jours maximum), elle peut se traduire par des signes cliniques débutants et d'intensité modérée : poil hérissé, légère baisse d'activité, diminution de la prise alimentaire et légère perte de poids. Dans certains cas, on peut aussi observer un début de distension abdominale ou une posture voûtée. Ces signes restent limités grâce à la durée très courte de l'infection. Les animaux sont euthanasiés avant l'apparition des signes plus marqués associés aux stades avancés de la toxoplasmose aiguë. Maîtrise des effets : les animaux sont observés au moins une fois par jour à l'aide d'une grille de score clinique (aspect du pelage, posture, activité, poids). Tout animal qui atteint un point limite est euthanasié sans délai (cf. § points limites). La récolte du parasite se fait post mortem. L'ensemble de ces mesures maintient la sévérité à un niveau modéré.

Devenir

Notre protocole d'amplification des Tachyzoide est de 3 jours. À l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés. Il s'agit d'une procédure terminale par nécessité d'une récolte post mortem : les tachyzoïtes sont récoltés par lavage de la cavité péritonéale, un geste qui ne peut être réalisé que sur un animal mort.

Remplacement

L’optimisation du protocole de production des tachyzoïtes a consisté à conserver uniquement la phase de stimulation du parasite (« boost »). Cette approche permet de remplacer partiellement la procédure in vivo, la suite de la production étant désormais réalisée in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés chaque année est estimé à environ 500 souris, soit 2 500 animaux sur cinq ans. Leur utilisation permet de préserver les caractéristiques biologiques de la souche de Toxoplasma gondii avant sa multiplication en culture in vitro. La quantité de souris nécessaire annuellement dépend directement du volume d’antigène toxoplasmique requis, lui‑même lié aux prévisions de vente de nos tests diagnostiques.

Raffinement

Les conditions d'hébergements des souris satisfont au principe de raffinement avec l'utilisation de cages adaptées avec un enrichissement de leur environnement (type copeaux de bois de résineux). Une surveillance quotidienne des animaux est mise en oeuvre par un personnel habilité. Il s’agit d’un protocole modéré n’induisant aucune modification de la physiologie animale (procédure courte, pas de production d’ascite, récolte post mortem).

Choix des espèces

Le modèle souris (Hôte intermédiaire et mammifère) est utilisé pour sa facilité de manipulation Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 8 semaines (souris adultes). A ce stade, les souris sont assez robustes pour supporter l'injection des parasites sans mortalité en cours d'expérimentation. Les animaux à réception sont identifiés via un code interne Bio-Rad, un fournisseur et un numéro de lot permettant ainsi la traçabilité à chaque moment du protocole.

10 831 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune servant à fabriquer environ 1 100 tests de diagnostic, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules de sarcome TG180, puis développe pendant quatorze jours une ascite abdominale qui lui fait prendre jusqu'à 50 % de son poids initial, avant d'être tuée pour que ce liquide soit prélevé. Le porteur compare cet état à une gestation, indique que les souris continuent à se toiletter, à se déplacer et à se nourrir, et écrit que la méthode ne demande pas d'analgésie du fait de son caractère "peu invasif". Douze références de réactifs marqués CE dépendent de cette production, et le porteur écrit que certaines ont déjà pu être produites in vitro, ce qui a divisé par deux le nombre de souris utilisées, l'arrêt complet restant conditionné au rythme des autorisations de commercialisation des nouveaux produits.

Objectifs

L’ascite de souris sarcome TG 180 est utilisée dans la production de 12 références de tests de diagnostic in vitro de pathologies humaines à forte mortalité ou graves conséquences parmi lesquelles nous retrouvons la toxoplasmose, les troubles thyroïdiens, différents cancers, l’anémie, des bilans hormonaux, des marqueurs d’allergies respiratoires… Tous les réactifs concernés sont marqués CE conformes à la directive européenne.

Bénéfices attendus

Ces tests de diagnostics sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule appelée alors antigène. Ces principes immunologiques sont exploités pour révéler une molécule d’intérêt présente dans l’échantillon du patient grâce à un/des anticorps spécifique(s) présent(s) dans le réactif. Une souris permet la fabrication d’environ 1100 tests de diagnostic. L’ascite TG180 de souris est utilisée pour éliminer des réactions non-spécifiques éventuellement dues à la présence d’anticorps anti-souris dans l’échantillon du patient et pouvant amener à un faux résultat.

Procédures

Une injection sur souris vigile d’une durée 15 secondes maximum Un prélèvement sur animal préalablement euthanasié.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules à des souris de 30g, provoque la production d’ascite après 14 jours d’incubation, avec une prise de poids n’excédant pas 50% du poids initial. Cette production provoque un inconfort comparable à une gestation. Toutefois les souris continuent à se toiletter, à se déplacer, à se nourrir, à boire ou à interagir.

Devenir

L’ensemble des animaux est euthanasié en vue de prélever leur ascite. En aucun cas ce prélèvement s’effectue sur animal vigile.

Remplacement

Le redéveloppement de ces tests de diagnostic nécessite de définir les matières de substitution, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Il s’agit là d’un programme d’innovation s’étendant sur des années. La réduction de l’utilisation du nombre de souris sera donc progressive et fonction du rythme d’obtention des autorisations de commercialisation des nouveaux produits dans les pays où ils seront commercialisés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste suivant les besoins nécessaires pour la fabrication de l’ensemble des kits dans lesquels rentrent le produit. Dans le passé un gros travail de sélection des souches, visant à sélectionner des souches les plus productives avec un niveau de qualité supérieur, a été effectué permettant d’avoir aujourd’hui une productivité optimisée et constante. Ce travail a permis, au fil du temps de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour le même volume de produit. L’ascite entre dans la composition de nombreux kits de dépistage de maladie humaine. Aujourd’hui certaines références ont pu être produites in-vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation de ce produit. Cette avancée a permis de diviser par deux le nombre d’animaux utilisés. Les essais vont continuer dans cette voie afin de diminuer voire arrêter cette production dans le futur.

Raffinement

Les souris réceptionnées sont acclimatées à leurs nouvelles conditions d’hébergement pendant 14 jours Les animaux sont hébergés sur litière sciure. Des lanières cartons sont introduites dans chaque caisse permettant aux souris de construire un nid. Un tunnel en PVC est également placé dans les caisses permettant aux souris de se cacher. Tous ces éléments assurent l'enrichissement du milieu. Un suivi quotidien et individuel permet en cas d’apparition de signe clinique lors du protocole, l’application de points limites prédictifs adaptés afin de limiter toute souffrance animale. Cette méthode ne nécessite pas de recours à l’analgésie du fait de son caractère peu invasif. Une observation attentive des animaux n’a pas montré d’altération significative du comportement des animaux, mais plus un inconfort lié à la prise de poids du fait de la production d’un volume conséquent d’ascite, comparable à un état de gestation.

Choix des espèces

La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains. Les animaux utilisés sont des souris de 21-39g. La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains.

Jusqu'à 23 injections et des prélèvements de sang atteignant 80 millilitres par animal : 150 chevaux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole immunise les animaux pour produire du plasma riche en anticorps, revendu comme traitement par une société de bio-défense, l'adjuvant employé pouvant provoquer nodules, abcès et granulomes douloureux au point d'injection. Le projet cherche justement un adjuvant moins réactif, tout en maintenant des taux d'anticorps élevés. Les chevaux ne sont pas tués : 100 sont réutilisés et 50 placés à l'adoption, selon les besoins de la structure.

Objectifs

La société impliquée est spécialisée dans les traitements contre des pathogènes (dont les maladies infectieuses émergentes et sévères) et les intoxications. Elle a déposé récemment une demande d’autorisation de mise sur le marché pour un produit dans le domaine de la bio-défense/menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). La société capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme est issue de procédés développés à l’origine par une autre entreprise et licenciés à la société actuellement dépositaire du brevet. Elle s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps. Le protocole d’immunisation comprend une série d’injections selon un calendrier qui optimise la production d’anticorps spécifiques de l’antigène, avec des titres les plus élevés possibles. Lorsque les titres maximaux sont obtenus (phase dite de « plateau »), le sang est prélevé dans des poches de grand volume contenant un anticoagulant, et il est ensuite traité pour obtenir du plasma. Les plasmas individuels sont poolés et utilisés pour purifier les immunoglobulines équines et obtenir les fragments qui constituent le produit thérapeutique final. Le projet vise à optimiser le protocole d’immunisation en identifiant un adjuvant et un schéma d’immunisation permettant d’améliorer l’innocuité tout en maintenant l’efficacité (fort taux d’anticorps). Cette optimisation du protocole s’accompagne de la recherche de marqueurs biologiques pertinents permettant de quantifier voire prédire la réaction inflammatoire potentiellement induite par le protocole d’immunisation.

Bénéfices attendus

Les fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique sûre à des problématiques majeures de santé publique pour lesquelles il n’existe pas d’autre solution. Il est crucial d’assurer la pérennité de la production et le raffinement des procédures permettant de les produire. Les antigènes correspondant aux cibles thérapeutiques doivent être administrés avec un adjuvant afin de stimuler la production d’anticorps spécifiques. L’adjuvant utilisé dans la technologie d’origine peut provoquer des réactions inflammatoires parfois douloureuses au site d'injection. Le projet vise à identifier un adjuvant et un schéma d’immunisation permettant de réduire ces réactions et d’améliorer le bien-être des animaux intervenant dans la production des traitements actuels et futurs. Le projet vise en parallèle à identifier un marqueur biologique prédicitf de la réaction inflammatoire induite par le protocole d’immunisation et utilisable en tant que point limite quantitatif dans toutes les procédures d’hyperimmunisation en cours et à venir.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des injections selon plusieurs modalités (sous-cutanée ou intra-musculaire). Les injections ne nécessiteront pas d’anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées maximum 23 fois par animal. Chaque injection durera environ 30 secondes. Au cours du suivi 10 prises de sang maximum par individus seront réalisées sans nécessité d’anesthésie. Les volumes prélevés allant de 10 à 80 mL (2 prélèvements de 10 mL et 8 prélèvements de 80mL) la durée de l’intervention pourra donc varier d’une minute 30 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

L’adjuvant utilisé dans la technologie d’origine peut provoquer des réactions inflammatoires parfois douloureuses au site d'injection (nodules, abcès, granulomes) pouvant altérer l’état général. Tous les adjuvants et protocoles d’immunisation qui seront testés sont définis afin de réduire significativement ces effets. Les adjuvants à tester ont été choisis sur base de leur innocuité démontrée. Tout adjuvant ou protocole ne permettant pas d’améliorer significativement l’innocuité seront arrêtés.

Devenir

Le projet comporte une seule procédure de classe modérée. Les animaux maintenus en vie pourront être réutilisés dans le cadre de procédures légères ou replacés. La réutilisation ou l’adoption seront décidées en fonction des besoins en animaux de la structure en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) dont le vétérinaire référent de la structure d'accueil des chevaux fait partie.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques et purifiées a largement démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production en grand volume d’anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo (et plus particulièrement avec des animaux de grande taille : bovins ou chevaux). Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Un maximum de 6 animaux sera utilisé pour chaque protocole d’immunisation à tester. Cet effectif est jugé suffisant pour établir une comparaison entre les réactions locales et générales induites par chaque adjuvant, l’évolution des paramètres biologiques ainsi que la quantité d’anticorps produits. Seule la première année exposera des animaux à l’adjuvant actuel connu pour créer des effets indésirables. Cette étape permettra d’avoir une référence et sa répétition non-nécessaire. Cet effectif permet également de limiter le volume de plasma à prélever sur chaque animal afin d’atteindre le volume minimal utilisable dans le procédé de purification Fab’entech.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe et observés bi-quotidiennement. Les animaux seront habitués dès le plus jeune âge au couloir de contention. Un enrichissement adapté est mis en place (hébergement en groupe, au pré dès que les conditions le permettent ou avec accès à une aire d’exercice). En cas de problème de santé, un vétérinaire diagnostique la maladie et prescrit un traitement. Le suivi santé des animaux se fait via des pesées régulières (a minima 1 fois toutes les deux semaines) et une grille d’observation et de suivi du bien-être animal est à disposition des équipes. Cette dernière leur permet d’identifier des signes d’inconfort, même en dehors des moments dédiés aux expérimentations (distribution d’alimentation par exemple). Les suivis et prélèvements sont réalisés par du personnel formé (habilitation à l’expérimentation animale de niveau 2) et connu des animaux. Ce projet met en œuvre des procédures maîtrisées qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines.

Choix des espèces

Le cheval est un animal de grande taille permettant de récolter une importante quantité importante de plasma (en respectant un maximum de 1% du poids vif). Les pathologies équines présentent très peu de risques zoonotiques, ce qui limite fortement les problématiques de biosécurité virale dans les plasmas. Le cheval est l’espèce décrite dans la technologie d’origine. La production d’anticorps polyclonaux tels que nécessaires dans la thérapeutiques humaines finales ne peuvent pas être produits in vitro. Seuls des animaux de plus de 2 ans seront inclus dans l’étude afin de travailler sur des individus dont l’immunité est pleinement acquise.

20 chevaux vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance modérée, réutilisés tant qu'ils restent en bonne santé, puis tués s'ils ne peuvent plus l'être. Ils reçoivent 32 injections sur dix mois et des prélèvements de sang trois fois par semaine pendant sept mois, avec des abcès et des plaies parfois purulentes aux points d'injection. Le porteur juge ces anticorps "indispensables" et sans équivalent de synthèse, leur plasma servant à fabriquer le seul antivenin contre les vipères d'Europe autorisé en France. Ce sont des chevaux de réforme, initialement destinés à la boucherie, chacun fournissant de quoi produire jusqu'à 400 doses.

Objectifs

Chaque année dans le monde, de nombreuses personnes décèdent où souffrent de lésions irréversibles par suite d’une morsure de serpent venimeux. C’est également le cas en Europe où les vipères d’Europe enveniment à des degrés divers environ 1000 personnes. 70% des morsures conduisent à une envenimation et 150 cas sont traités par cet antivenin par an. Dans le cadre de la production de spécialités antivenimeuses, ciblant les envenimations de Vipères d’Europe, l’obtention d’anticorps spécifiques est indispensable. Afin de produire ces anticorps, des chevaux sont immunisés de manière répétée dans le but d’obtenir une quantité élevée d’anticorps dans leur sang.

Bénéfices attendus

Le bénéfice escompté est d’assurer la fourniture de cet antivenin qui est la seule spécialité antivenimeuse avec autorisation de mise sur le marché (AMM) en France. Ce produit est plus largement utilisé en Europe, en fonction des besoins. Il n’existe aucune spécialité antivenimeuse ne faisant appel à l’animal pour la production d’immunoglobulines, les anticorps polyclonaux sont très efficaces pour la lutte contre les envenimations. Un cheval permet l’obtention de 125 litres de plasma anti-vipères d’Europe soit 200 à 400 doses d’antivenimeux.

Procédures

Deux ensembles de gestes techniques sont effectués chez tous les chevaux du projet. Tous les gestes techniques sont réalisés sur le cheval vigile : → Gestes associés à la technique d’hyper-immunisation: 32 injections sont effectuées par voie sous-cutanée réparties sur 10 mois. La durée de l’injection est de 2 à 10 secondes par animal. → Gestes associés aux prélèvements de sang pour la production des plasmas: • des prélèvements de sang par voie veineuse (à la veine jugulaire) d’une durée de 10 minutes par animal sont réalisés 3 fois par semaines toutes les 4 semaines sur une période de 7 mois une fois que le titre d’anticorps spécifique a atteint le plateau maximum. Si l’hématocrite du cheval prélevé a atteint un seuil bas prédéfini avec le vétérinaire désigné, il y a ré-administration des globules rouges par voie intraveineuse d’une durée de 20 minutes par animal (technique de « plasmaphérèse ») au maximum 3 fois par semaines toutes les 4 semaines sur une période de 7 mois.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont la formation de grosseurs inflammatoires au point d’injection pouvant entrainer des abcès froids qui peuvent se résorber sans plaie, mais qui occasionnent parfois des plaies avec écoulement séreux ou purulent. Dans ce cas, des soins locaux sont dispensés. Plus rarement, on observe une gêne transitoire de la mobilité de l’encolure des animaux, dans ce cas, le vétérinaire décrit la conduite à tenir et peut suspendre un protocole provisoirement ou définitivement. Une nuisance potentielle attendue, mais rare en pratique, est la baisse d’hématocrite consécutive à la répétition dans le temps des prélèvements sanguins de volumes importants. Quel que soit le protocole, si un animal présente des signes cliniques non attendus un examen clinique est réalisé par un vétérinaire. Celui-ci peut décider de réformer l’animal.

Devenir

En fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être réutilisés en interne après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

L’état actuel de la science ne permet pas de remplacer les anticorps polyclonaux (obtenus par immunisation d’animaux) par des anticorps monoclonaux, synthétisés en bio-fermenteur. Ceci est principalement dû au manque d’efficacité de ces derniers, trop spécifiques L’effet polyclonal est largement plébiscité car il agit avec un très large spectre face aux nombreuses protéines nocives des venins.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à un minimum. Les demandes commerciales et les titres des plasmas déterminent le niveau de production et par conséquent le nombre de chevaux producteurs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés dans des box en groupes sociaux de maximum 12 chevaux fixes dans le temps présentant une aire paillée et une aire d’exercice ouvertes sur l’extérieur. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Les contacts répétés avec l’homme contribuent à l’enrichissement. Des procédures optimisées sont en place pour l’habituation des chevaux aux injections et aux prélèvements de sang pour réduire le stress lors des opérations de production. Les manipulations (injection ou prélèvement de sang) sont réalisées en présence de chevaux du même groupe, dans des installations spécifiques adaptées. Une analyse des paramètres sanguins biologiques est réalisée mensuellement et suivie tout au long de la procédure. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire qui assure par ailleurs un suivi régulier. La possibilité de poursuivre ou non le protocole est évaluée au cas par cas par le vétérinaire désigné. Des points limites sont définis.

Choix des espèces

Les équidés représentent l’espèce de choix car leur gabarit leur confère un volume sanguin circulant élevé. Les volumes prélevés sont élevés, proportionnellement à ce volume sanguin, et leur capacité rapide à reconstituer ce stock en fait l’espèce de choix. C’est une espèce qui s’adapte bien à l’humain et pour laquelle il n’existe que peu de zoonoses sur le territoire français. Les chevaux utilisés pour ce projet sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’anticorps spécifiques est optimale. Ce sont des animaux de réforme (capacité compétition, infertilité…) destinés initialement à la boucherie.

Maintenus en vie à l'issue, 30 lamas sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cas rare où les animaux ne sont pas tués. Chacun reçoit quatre à six injections d'antigènes avec adjuvant, des contentions au couloir et des prises de sang, pour produire des anticorps de petite taille recherchés en biotechnologie. Les réactions attendues vont de l'inflammation locale à une fièvre et une fatigue passagères. Un même lama peut enchaîner trois séries d'immunisation au cours de sa vie, avec six mois de repos entre chacune.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de produire des petites molécules naturelles de défense très précises, appelées anticorps, en vaccinant des lamas avec des cibles, appelées antigènes, liées à la maladie d’intérêt. Les lamas fabriquent un type particulier d’anticorps, plus petits et plus stables que ceux des autres animaux. Grâce à leur taille réduite, ils peuvent atteindre des zones difficiles d’accès dans l’organisme tel que le système nerveux central. Ils sont déjà utilisés dans le domaine de la biotechnologie et constituent une avancée importante pour la médecine. Ce travail permettra de développer de nouveaux outils pour le diagnostic et le traitement de certaines maladies, avec des retombées potentielles pour la santé publique. Les lamas recevront des injections contenant les cibles afin d’activer leur système immunitaire. Des prises de sang seront réalisées régulièrement pour suivre la réaction de l’organisme et récupérer les anticorps produits.

Bénéfices attendus

Les Camélidés, espèce à laquelle appartiennent les lamas, ont une caractéristique unique qui consiste à produire des anticorps spéciaux beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur taille et leur stabilité leur permettent d’atteindre des zones difficiles, de résister à des conditions extrêmes et d’être faciles à produire. Grâce à ces qualités, ils sont utilisés en thérapie, diagnostic et biotechnologie, ouvrant la voie à des avancées majeures en médecine et en recherche.

Procédures

La vaccination consiste en 4 à 6 injections de la cible espacées de 7 à 14 jours. Une prise de sang est réalisée en début et milieu de vaccination afin d’évaluer l’activation du système immunitaire des lamas. En fin de vaccination, un prélèvement final est réalisé afin de récolter les anticorps produits. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile et immobilisé dans un couloir de contention à l’aide d’un licol par du personnel compétant. La durée totale d’une vaccination est de 40 ou 43 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les lamas suite à des injections d’antigènes avec adjuvant sont principalement des réactions locales au site d’injection (légère inflammation, induration, douleur transitoire), plus rarement des effets systémiques légers tels qu’une légère fièvre (n’excédant pas 40°C) ou une fatigue passagère (activité et/ou réactivité ralenties par rapport au reste du troupeau). Lors des prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir une douleur brève au moment de l’insertion de l’aiguille. Bien qu’un travail d’habituation et de conditionnement soit réalisé avec les lamas, le stress lié à la contention est également possible. Pour réduire ces nuisances, la procédure prévoit une manipulation douce par du personnel expérimenté, l’utilisation d’aiguilles adaptées et la surveillance clinique régulière.

Devenir

À l’issue du projet, tous les animaux seront maintenus en vie. En fin de programme d’immunisation un examen vétérinaire est réalisé pour vérifier l’état de santé complet de l’animal après l’enchaînement des injections et s’assurer qu’aucune nuisance ou complication anormale n’est survenue.

Remplacement

Les lamas ont la particularité de produire des molécules de défenses, appelées anticorps, de très petite taille. On peut fabriquer des anticorps en laboratoire, mais ces méthodes ne reproduisent pas la variété et la qualité obtenues naturellement. Pour avoir des anticorps très spécifiques et efficaces, il faut vacciner l’animal, car cela déclenche une vraie activation du système immunitaire. C’est pourquoi l’utilisation des animaux reste nécessaire : il n’existe pas d’alternative équivalente pour obtenir des résultats fiables et utiles en recherche et en médecine.

Réduction

Le nombre de séries de vaccination est estimé à 8 par an soit 40 sur 5 ans. Deux lamas sont utilisés par série. Au cours de sa vie, un même animal peut intégrer 3 séries d’immunisation en respectant un repos de 6 mois minimum entre 2 séries, de ce fait 30 lamas seront nécessaires.

Raffinement

Le projet intègre plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant la qualité scientifique des résultats. Les animaux seront choisis pour leur docilité et leur aptitude à la manipulation, afin de réduire le stress lors des procédures. Un contrôle de l’état de santé des animaux est réalisé avant immunisation afin de s’assurer qu’ils sont aptes à subir des injections et des prélèvements sanguins. Un examen vétérinaire en fin de programme d’immunisation est réalisé pour vérifier l’état de santé complet de l’animal après l’enchaînement des injections et s’assurer qu’aucune nuisance ou complication anormale n’est survenue. Les lamas sont identifiés individuellement et seront suivis tout au long du projet pour assurer leur bien-être et la traçabilité des données. Les injections et les prélèvements seront réalisés par du personnel compétent, auquel les animaux sont habitués afin d’assurer une contention douce et rapide et un geste précis et efficace. Les volumes d’injection et de prélèvement seront strictement conformes aux recommandations pour limiter les réactions indésirables. Des aiguilles adaptées seront utilisées pour réduire la douleur, les antigènes seront injectés en alternant les côtés. A l’issue des injections ou prélèvements, les animaux concernés seront gardés tous ensemble en observation dans le box « Infirmerie » ou dans l’enclos contigu à l’infirmerie pendant une trentaine d’heures pour s’assurer de l’absence de réaction anormale (le lama étant un animal grégaire, aucun animal ne restera isolé de ses congénères). Ils regagneront ensuite le reste du troupeau. L’isolement ne dépassera pas 4 jours pour éviter tout problème comportemental lors de la réintégration. Une surveillance clinique quotidienne permettra d’intervenir rapidement en cas de signe d’inconfort.

Choix des espèces

Le recours aux lamas est essentiel pour ce projet, car ils appartiennent à la famille des Camélidés, seule espèce capable de produire des anticorps de très petite taille leur permettant ainsi d’atteindre des cibles inaccessibles par les anticorps classiques. Les lamas utilisés pour les séries de vaccination doivent être des adultes jeunes, généralement âgés de 2 à 11 ans, car cet intervalle correspond à une maturité optimale du système immunitaire garantissant le succès du projet. Les animaux trop jeunes (moins de 2 ans) présentent un système immunitaire encore en développement, ce qui pourrait compromettre la qualité des anticorps produits. À l’inverse, les animaux âgés peuvent avoir un système immunitaire affaibli ou des comorbidités, augmentant les risques de réactions indésirables. Le choix d’animaux adultes en bonne santé assure donc la fiabilité scientifique des résultats tout en limitant les risques pour leur bien-être.

45 moutons vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, gardés en vie durant toute leur existence, jusqu'à environ huit ans. Chaque animal reçoit six à huit injections d'antigènes bactériens avec un adjuvant huileux qui peut enflammer le point d'injection, puis des prélèvements de sang répétés, jusqu'à six par an. Le sérum récolté sert à fabriquer des tests industriels de détection de Listeria, de salmonelles ou d'Escherichia coli dans l'alimentation. Le porteur indique que la plupart de ces moutons proviennent d'élevages classiques et ont été reclassés parce que jugés inaptes à leur production initiale.

Objectifs

L’objectif du projet est l’obtention d’anticorps polyclonaux de mouton, dirigés contre les antigènes spécifiques des bactéries pathogènes, recherchées dans les industries alimentaires : Listeria, Salmonelles, Escherichia Coli, Toxines de Staphylocoques Ces anticorps polyclonaux sont utilisés pour la réalisation de tests de détection, ou d’enrichissement préalable à la détection, des bactéries ou de leurs entérotoxines, à l'aide d'automates par l’industrie alimentaire. Un animal immunisé, permet de produire à chaque série de prélèvement 2 000 000 à 3 000 000 tests selon l’antigène, sachant qu’il peut réaliser jusqu’à 4 séries de prélèvement durant toute sa vie soit environ 8 ans.

Bénéfices attendus

Les anticorps produits, une fois purifiés, entrent dans la composition de tests d’immunocapture (Escherichia Coli,) ou de détection via la technique ELISA(Listeria, Salmonelles, Toxines de Staphylocoques), automatisés, destinés à la sécurité alimentaire. Les Listeria, cause de contamination de divers produits alimentaires, ainsi que dans des échantillons environnementaux prélevés, en particulier, dans des usines de transformation des aliments. Chez l'homme, Listeria monocytogenes peut provoquer une méningite, une septicémie, une encéphalite et des avortements. Les groupes les plus exposés sont les femmes enceintes, les nouveau-nés, les patients immunodéprimés et les personnes âgées. Des Salmonella, qui sont l’une des principales causes d’intoxication alimentaire. Lorsque des protocoles longs et fastidieux sont utilisés, la recherche des Salmonella peut nécessiter jusqu’à cinq jours pour confirmer qu’un échantillon est négatif. Des Escherichia coli O157 (H7) est une cause reconnue de colite hémorragique qui a été impliquée dans de nombreuses épidémies au Japon, aux États-Unis, au Canada, au Royaume-Uni et en Belgique. Dans près de 10 % des cas, l’infection conduit à des problèmes rénaux aigus (syndrome urémique hémolytique). Les enfants de moins de cinq ans et les personnes âgées y sont le plus sensibles. Des entérotoxines staphylococciques, qui comptent parmi les causes les plus courantes d'intoxication alimentaire.

Procédures

Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile. 6 à 8 injections durant toute la vie de l’animal (1 minute 30 par injection). Prélèvement de sang pour contrôle du titre : 15 secondes 4 fois par an. Prélèvement de sang pour la production de sérum : 5 minutes par prélèvement – contention 15 minutes à raison de maximum de 6 prélèvements par an.

Impact sur les animaux

Un stress de courte durée correspondant à la contention pour les injections (environ 3 minutes) Une douleur d’une courte durée liée à la première injection de l’émulsion de l’antigène avec de l’adjuvant huileux peut apparaitre chez l’animal, car cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Si présence, elles sont suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Un stress de courte durée correspondant à la durée du prélèvement et de la contention (environ 15 minutes) est possible. Néanmoins, la fréquence des prélèvements entraine une certaine habituation des animaux permettant une diminution du stress.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont gardés jusqu’à la fin de leur vie.

Remplacement

Indisponibilité de modèle in vitro performant pour la production d’anticorps contre les antigènes bactériens considérés ayant les caractéristiques nécessaires (spécificité, avidité, affinité) pour un dosage ELISA ou un enrichissement par immunocapture sur automate.

Réduction

L'effectif des animaux est adapté au plus juste pour répondre aux prévisions de production. La plupart de ces animaux sont issus de l’élevage classique et reclassés car inaptes à la production initiale à laquelle ils étaient destinés dans leur élevage d’origine.

Raffinement

Les moutons sont hébergés en groupe de 4 à 6 animaux, sur litière, ceci leur assurant une vie sociale adaptée à l'espèce et garantissant un enrichissement efficace. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies pour favoriser la réduction du stress. Le foin est accessible à volonté via un râtelier leur permettant d’avoir des moyens de grimper. Un granulé spécifique supplémenté leur est administré, et des cures d’aliments supplémentés leur est apporté durant le protocole. Une surveillance renforcée de l’état général des animaux est réalisée durant les jours suivant l’injection dont l’alimentation, la locomotion, l’isolement vis-à-vis de ses congénères. Si besoin une prise de température est réalisée et un traitement anti-douleur est administré. Toute dégradation de l’état général de l’animal déclenche la mise en place d’un protocole de soin adapté.

Choix des espèces

Le mouton est une espèce documentée et classiquement utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux. Bien que présentant une grande hétérogénéité, les anticorps polyclonaux sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités. Les animaux utilisés sont des jeunes mâles adultes afin de permettre le prélèvement de volumes sanguins (donc de sérums hyper-immuns) suffisamment importants pour la réalisation des diagnostics visés par l’étude. Ces moutons sont castrés très jeunes afin de garantir une sociabilité optimale et d'éviter les problèmes comportementaux des mâles.