Protection de l’environnement

6 036 xénopes vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes reçoivent une injection hormonale pour se reproduire puis retournent dans leurs aquariums, tandis que les têtards issus des pontes sont exposés à des nanoparticules de graphène et pour certains soumis à une ponction cardiaque sous anesthésie, avant d'être tués par surdose d'anesthésique. Le porteur indique travailler à de faibles concentrations et n'attendre aucune toxicité aiguë, et présente le projet comme visant la protection des écosystèmes aquatiques. Sur le remplacement, il décrit un test préalable sur des daphnies pour cibler les concentrations et réduire le nombre de têtards.

Objectifs

Le présent projet s'intéresse aux effets des nanoparticules de graphène et composites à base de graphène. Du fait de leurs applications dans des domaines aussi variés que l'électronique, la science des matériaux ou la médecine, les nanoparticules connaissent un développement extrêmement important au niveau industriel. L'intégration de ces nanoparticules dans les produits de la vie quotidienne est une réalité et on peut s'attendre dans les années à venir à retrouver ces contaminants au sein des écosystèmes. Les écosystèmes aquatiques, qui sont les réceptacles finaux majeurs des pollutions, pourraient être impactés par le relargage de ces nanoparticules au cours du cycle de vie des produits qui en contiennent (production, utilisation, fin de vie des produits). Plusieurs études se sont intéressées aux effets de ces nanoparticules au niveau in vitro ou in vivo chez les modèles murins (rats et souris). L'ensemble de ces études est très intéressant d'un point de vue des modes d'action mais n'est pas représentatif des réalités environnementales. De plus, depuis une trentaine d'années on assiste à un déclin global des populations d'amphibiens à travers le monde. Un des objectifs importants de ce projet est d'évaluer par conséquent l'impact potentiel du graphène et d'autres nanoparticules à base de graphène (dont des composites intégrés dans des produits de la vie quotidienne) au niveau de la santé humaine mais également au niveau de l'environnement. A l’heure actuelle, peu d’études se sont intéressées à la toxicité de ces contaminants émergents au niveau des écosystèmes aquatiques. Les expérimentations entreprises dans le présent projet seront inédites et seront effectuées dans un but final de protection de la faune des écosystèmes aquatiques. La toxicité de nanoparticules de carbone sera ici évaluée chez le crapaud (Xenopus laevis) comme modèle biologique représentatif des écosystèmes aquatiques et dont la pertinence d'utilisation en écotoxicologie est reconnue depuis plusieurs années. Les adultes xénopes sont utilisés pour obtenir les tétârds après injection hormonale, tétârds qui eux sont utilisés pour étudier les effets de ces nanoparticules.

Bénéfices attendus

Selon les résultats obtenus dans le présent projet, des préconisations d'emploi des nanoparticules et de nanocomposites pourront être données par le biais d'une approche Safer-by-design (pour minimiser l'écotoxicité des nanoparticules dès leur fabrication, en tenant compte de l'ensemble de leur cycle de vie jusqu’à leur mise en déchet après leur utilisation). Cette approche pourrait permettre de faire avancer la réglementation en matière de nano et notamment auprès des industriels. D'un point de vue de l'évaluation réglementaire des risques, des prérogatives pourront également être apportées pour mettre à jour les recommandations "nano".

Procédures

Les xénopes adultes sont délicatement pris en main pour recevoir une injection hormonale (gonadotropine) qui stimule l'accouplement et qui permet d'obtenir une fertilisation optimale. Les œufs sont finalement obtenus par fécondation in vivo lors de l'accouplement naturel (amplexus). Au moment de la prise, la tête dans la paume de la main de l'utilisateur, l’injection est effectuée dans les sacs lymphatiques dorsaux, c'est-à-dire l'espace entre la peau et le plan musculaire sous-jacent, qui est divisé en compartiments séparés par des parois conjonctives (septa), remplis de liquide lymphatique et en communication avec le système circulatoire lymphatique. Cette disposition anatomique favorise l’injection et la diffusion des hormones dans l’ensemble du corps de l’animal. Afin d’éviter le reflux, on pique l’aiguille dans le haut de la cuissen et on maintien appuyé au lieu d’injection pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. - les autres interventions sont réalisées sur les têtards manipulés délicatement à l'aide d'épuisettes et après traitement à la Tricaine méthane sulfonate (ponction cardiaque réalisée sous binoculaire pour les procédures qui requièrent l'analyse de leur sang).

Impact sur les animaux

Il s'agit ici d'une évaluation du risque des nanoparticules et nanocomposites. L'analyse des biomarqueurs étudiés chez ces animaux exposés pourra renseigner notamment des nuisances et des effets indésirables. Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées au maximum sur les individus issus d'une même ponte et pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun autant que possible. De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’expositions des larves de Xénope par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards éventuellement. Les concentrations environnementales auxquelles nous travaillerons étant qualifiées de faibles, aucune toxicité aiguë particulière n'est réellement attendue.

Devenir

Les adultes réintègrent leurs aquariums. Les têtards sont euthanasiées par surdose anesthésique tel que préconisé par la réglementation dans les méthodes de mise à mort.

Remplacement

Pour remplacer l'utilisation de têtards et en l'absence d'autres méthodes alternatives, le test réglementaire de détermination de la toxicité par la détermination de l'immobilisation chez les daphnies sera utilisé pour déduire la gamme de concentration à étudier ultérieurement chez les têtards. L'expérimentation chez les têtards sera alors réalisée à la concentration la plus forte n'entraînant pas de signes d'intoxication chez les daphnies exposées au préalable.

Réduction

Les xénopes adultes reproducteurs utilisés proviennent d'un élevage interne (pas d'apport supplémentaire extérieur) et les têtards issus des pontes seront utilisés dans plusieurs procédures expérimentales. Le nombre d'animaux utilisé est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères. La distribution des données et les résultats ne peuvent pas être connus avant d'effectuer les expérimentations. Les tests statistiques utilisés seront choisis parmi ceux adaptés à la distribution des données obtenues. Au cours des expositions des têtards, les lots de têtards témoins seront mutualisés autant que possible (en fonction de la disponibilité des matériaux à étudier) et seules les concentrations sans toxicité aiguë obtenues seront mises en œuvre grâce aux résultats des essais sur daphnies qui permettent donc également une réduction du nombre de têtards de xénope.

Raffinement

Les conditions d'élevage et d'exposition sont strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement (stade adulte et larvaire) pour minimiser le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs, renouvellement des milieux d'exposition des têtards pour éviter toute accumulation de déchets azotés toxiques ou une désoxygénation trop importante). L'observation des têtards sera pratiquée quotidiennement et la décision d'arrêter l'exposition pourra être prise si un comportement révélant un stress ou une souffrance importante est observé (ex : nage en « tonneaux », absence de mouvement prolongé, prise alimentaire trop faible, lésions externes, etc.). Enfin, le bien-être des têtards en exposition est aussi maintenu par la continuité des conditions d'élevage : contrôle de la température et de la photopériode, nourrissage... En plus des différentes méthodes énoncées ci-dessus, il est à noter que l'exposition des têtards s'effectuera dans un local bien séparé des zones d'élevage. Ces locaux sont thermostatés et leur accès est restreint afin d'éviter tout stress inutile aux animaux. Outre les conditions d'élevage et d'exposition détaillées plus haut, la technique de mise à mort utilisée permettra aussi de limiter au maximum la souffrance. En effet, l'immersion des individus dans la solution anesthésique permet leur mise à mort rapide (moins de 5 minutes).

Choix des espèces

Les amphibiens sont de bons modèles dans le cadre des études écotoxicologiques et leur pertinence d'utilisation a été démontrée depuis plusieurs années au laboratoire. Les stades œufs et larvaires sont particulièrement sensibles, ce qui en fait de bon indicateurs de la qualité des milieux. Ce sont des animaux sédentaires qui sont de bon indicateurs des conditions locales. Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d'éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement embryonnaire puis larvaire rapide et l'alimentation des têtards est facile. In fine, les expérimentations entreprises dans le présent projet seront effectuées dans un but final de protection de la faune des écosystèmes aquatiques. La toxicité de nanoparticules de carbone et nanocomposites est ici évaluée chez le crapaud (xénope Xenopus laevis) comme modèle biologique représentatif des écosystèmes aquatiques et dont la pertinence d'utilisation est reconnue depuis plusieurs années. Les reproducteurs Xénope seront au stade adulte (sexuellement matures : nécessaire pour la reproduction). Les têtards utilisés dans ce projet sont utilisés à des stades précis de leur développement embryonnaire car ces stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, car directement exposés à l'environnement aquatique, ainsi un nombre réduit d'animaux par rapport aux adultes est nécessaire pour détecter un éventuel effet délétère et permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Ces stades de développement sont facilement repérables car ils correspondent à l'apparition du bourgeon de la patte postérieure du têtard : l'anesthésie n'est donc pas nécessaire pour déterminer le stade de développement (raffinement).

330 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis relâchés sauf incident. Le porteur décrit un marquage acoustique par chirurgie sous anesthésie pour les anguilles et les lamproies, avec ouverture de la paroi musculaire et suture, et une insertion gastrique pour les aloses, afin de suivre le franchissement d'une zone estuarienne aménagée de la Loire. Il indique que ces deux procédures peuvent causer des mortalités directes ou indirectes, les poissons étant remis à l'eau après réveil. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode substitutive ni modélisation ne permet de prédire ces comportements individuels.

Objectifs

La Loire a fait l’objet au cours des 19e et 20e siècles de nombreux aménagements pour exploiter ses ressources et améliorer sa navigabilité. Ceux-ci ont entrainé l’enfoncement du lit du fleuve, avec des conséquences dommageables sur le fonctionnement et la morphologie du fleuve lui-même et des impacts multiples sur les milieux naturels et la biodiversité. Il est essentiel que la Loire retrouve son équilibre. C’est l’objectif du programme de rééquilibrage du lit de la Loire, inscrit dans le Contrat pour la Loire et ses annexes (CLA). L’objectif du CLA est de restaurer l’équilibre du fleuve tout en préservant ses différents usages. Dans le cadre du CLA, il est notamment demandé d’étudier l’impact qu’auront les futurs aménagements sur les compartiments biologiques. Dans ces compartiments, les poissons migrateurs amphihalins, qui réalisent une migration entre milieux marins et milieux continentaux à des stades précis et sensibles de leurs stades de vie, sont particulièrement vulnérables et sensibles aux modifications de l’estuaire. Le présent projet a pour objectif d’étudier le comportement actuel des poissons migrateurs amphihalins sur la future zone des travaux. Pour cela, des émetteurs acoustiques seront placés dans des individus de 3 espèces de migrateurs amphihalins : les grandes aloses Alosa alosa, les lamproies marines Petromyzon marinus et les anguilles européennes Anguilla anguilla. Ces émetteurs seront placés sous anesthésie générale, par chirurgie (gravité modérée) pour les anguilles et les lamproies, et par insertion gastrique (gravité légère) pour les aloses. Ces individus marqués seront ensuite suivis le long du site d’étude grâce à des récepteurs placés régulièrement dans la rivière. Ce projet servira de référence et d’état initial. Il sera aussi une base de travail pour déterminer si les futurs aménagements amélioreront, ou au contraire perturberont, le franchissement de la zone par les migrateurs amphihalins. Une seconde étude sera réalisée afin de connaitre l’impact des travaux.

Bénéfices attendus

Il est attendu des données sur la franchissabilité de la zone d’étude par trois espèces migratrices amphihalines. Plus précisément : - impact des ouvrages actuels sur le franchissement : échappement (proportion d’individus franchissant la zone), blocage (temps supplémentaire induit par les ouvrages) ; - technique de franchissement : choix du chenal (droite ou gauche), utilisation des chenaux (latérale ou centrale), cinétique (franchissement continu ou par étape) ; - impact du super-prédateur Silurus glanis sur les populations d’amphihalins (nombre d’individus marqués qui seront prédatés sur la zone d’étude, obtenus grâce à des marques acoustiques capable de réagir à la digestion, donc à une prédation). Toutes ces données seront utilisées afin de rendre compatible les futurs aménagements avec la migration des migrateurs amphihalins, notamment en termes de position, d’orientation et de dimensions des futurs dispositifs d’aide au franchissement. La présence ou non de prédation des amphihalins par le silure sur la zone sera aussi prise en compte, car un dispositif de franchissement peut augmenter cette pression en attirant justement les silures sur cette zone.

Procédures

Les anguilles et les lamproies seront marquées chirurgicalement sous anesthésie générale. L'acte d'insertion de la marque acoustique dans la cavité péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seul la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les aloses seront marquées par insertion gastrique, avec anesthésie. Un tube de 9 mm de diamètre est introduit dans la bouche jusqu'à l'entrée de l'estomac, et la marque acoustique est ensuite déposée dans l’estomac. La longueur du tube est calculé au préalable sur plusieurs individus morts de tailles variées achetés dans le commerce afin de tomber exactement sur l’estomac. Cet acte dure moins de 15 secondes par individu. L'individu peut ensuite être remis à l'eau rapidement.

Impact sur les animaux

Au niveau individuel, cette étude nécessite un marquage (chirurgical pour lamproie et anguille, gastrique pour les aloses). Ces deux procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. Aucun autre effet du marquage n’est à signaler.

Devenir

Tous les animaux seront remis à l'eau dès la fin du marquage sauf euthanasie éthiques en cas d’incident (cf points limites).

Remplacement

Cette étude vise à comprendre le franchissement d’une zone anthropisée et prochainement modifiée par les migrateurs amphihalins. Il n‘existe aucune méthode substitutive, notamment en modélisation, car il est impossible de prédire des comportements individuels, chaque zone étant très spécifique. Il est donc impératif de documenter ce franchissement de manière expérimentale.

Réduction

Le nombre d’individus marqués sur chaque lot est un minimum nécessaire permettant d’effectuer une analyse statistique fiable. De tests de puissance préalables ont été effectués : ces tests permettent d'estimer la taille de l'échantillon nécessaire pour confirmer ou infirmer les hypothèse de manière significative. La taille des lots est celui préconisé par les tests de puissance.

Raffinement

Au niveau des prélèvements par la pêcherie, plusieurs précautions seront prises pour limiter le stress ou les dommages physiques sur les animaux. Le protocole de pêche seront adaptés pour être non traumatisants. Les marquages se feront toujours sous anesthésie générale avec ventilation mécanique des branchies : un tuyau relié à une pompe envoie de l’eau avec anesthésiant (concentration égale au bac d’endormissement) directement dans la bouche des poissons durant toute la durée de l’opération. La taille des marques (9 mm de diamètre, poids < 4 g) est choisie bien en dessous des critères normalement appliqués. Après l’implantation, les poissons sont gardés en bassin de réveil et surveillés individuellement au moins 30 min. Ce temps ne dépasse jamais plus d’une heure au maximum. Aucune remise à l’eau ne sera faite avant que l’animal ait recouvré tous ses réflexes et sa mobilité. Il est observé la reprise de l’équilibre, la reprise d’une activité de nage et la reprise de reflexe d’évitement, notamment à la préhension manuelle. Les poissons seront remis à l’eau le plus rapidement possible (le plus souvent dans l’heure suivant leurs sorties du vivier). Aucune sortie de l’eau sans anesthésie ne sera effectuée de manière prolongée (supérieure à quelques secondes). Lors des sorties de l’eau pour chirurgie, les poissons resteront en permanence en milieu humide (dos dans l’eau, eau qui ruisselle par la bouche). Les opérations se déroulent toujours sur les berges de la rivière.

Choix des espèces

La question des pouvoirs publics porte sur les espèces migratrices amphihalines. Nous avons sélectionné trois de ces espèces : la lamproie marine Petromyzon marinus (encore relativement abondante en estuaire, très robuste), l'anguille européenne Anguilla anguilla (avec des pêcheries actives et très robustes) et la grande alose (pêcheries actives en estuaire, possibilité de marquage en gastrique). Les autre espèces n'ont pas été retenues en raison d'effectifs trop faible (esturgeon, saumon,...) ou d'impossibilité technique (mulets porc, flets...). Les trois espèces seront prélevées pendant leur migration ontogénique : il s’agit donc d’adultes pré-reproducteurs. Par définition, les migrateurs amphihalins traversent cette zone à ce stade : c'est donc le stade d'intéret pour les pouvoirs publics.

9 460 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes reçoivent des injections hormonales pour se reproduire puis retournent en aquarium et servent à nouveau, tandis que les larves et les œufs exposés sont tués par surdose d'anesthésique, pour évaluer l'écotoxicité d'effluents de station d'épuration. Le porteur indique recourir d'abord à un test sur daphnies pour réduire le nombre de vertébrés. Il présente le xénope comme un indicateur pertinent de la qualité des milieux.

Objectifs

De nombreux composés chimiques sont retrouvés en entrée de stations d'épuration de part les activités humaines et notre société de consommation. Les traitements actuels sont peu efficaces pour traiter ce genre de composés et une majorité d'entre eux (les micropolluants) sont retouvés dans l'environnement. Le présent projet est issu de 2 projets de recherche différents qui s'intéressent aux traitements des effluents d'origine humaine (station d'épuration, eaux résiduelles urbaines, effluents hospitaliers, etc.) dont l'objectif est de mettre en évidence l'absence d'écotoxicité des matrices (effluents, lixiviats de boues) traitées par les procédés de traitement mis en oeuvre et cela avant leur rejet dans le milieu naturel et de définir une stratégie de traitement d'effluents optimale qui fournit un effluent final adapté à la réutilisation, en se conformant à une qualité d'eau chimique et biologique sécûre. Les 2 projets ont été évalués par des organismes scientifiques français et européens et des financeurs publics. Les expérimentations porteront d'une part sur l'évaluation de l'effet de cocktails de micropolluants à des concentrations faibles couramment retrouvées dans l'environnement. D'autre part, les expérimentations auront pour but d'évaluer l'efficacité et l'innocuité de traitements innovants des eaux usées issues de stations d'épuration.

Bénéfices attendus

L'enjeu environnemental est important, avec à la clef un possible changement/amélioration des pratiques de traitement des eaux usées à l'issue des connaissances scientifiques qui seront acquises. Les bénéfices attendus sont donc des impacts sur la société et l'économie, en incitant l'industrie de l'eau et les gestionnaires à protéger l'environnement des rejets d'effluents contenant des contaminants tout en prenant en compte le concept sociétal du"One Health" (une seule santé).

Procédures

Les adultes xénopes s'accouplent naturellement après l’injection hormonale dans les sacs lymphatiques dorsaux (prise en main : tête dans paume de la main de l'utilisateur). L’injection est effectuée dans l’espace entre la peau et le plan musculaire sous-jacent, divisé en compartiments séparés par des parois conjonctives, rempli de liquide lymphatique et en communication avec le système lymphatique. Cette disposition anatomique favorise l’injection et la diffusion des hormones dans l’ensemble du corps de l’animal. Pour éviter un reflux, on pique l’aiguille dans le haut de la cuisse à travers le septum et on maintient appuyé au lieu d’injection pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Les 20 adultes ne seront jamais mis à mort mais réintégrés à l’élevage. Les autres interventions sont réalisées sur les têtards après traitement au Tricaine Méthane Sulfonate. Ils seront exposés à différents types de mélanges en micropolluants organiques ou à des effluents traités pendant des durées variables (4-12-21 jours) et différents aspects biologiques seront étudiés : cassures de l'ADN, métamorphose, croissance, De plus, pour se rapprocher le plus possible du milieu naturel, des expérimentations seront menées en étudiant les effets au niveau de chaînes alimentaires recréées en laboratoire. Pour l'ensemble des procédures 9440 têtards seront utilisées. Le nombre total d'animaux impliqués sera donc égal à 9460 en considérant les têtards et les adultes. Du point de vue du raffinement, les conditions d'élevage et d'exposition seront strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement pour réduire le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs). Afin de réduire le nombre d'animaux, une même ponte sera mutualisée pour plusieurs essais et procédures permettant de réduire considérablement le nombre de reproducteurs. De même, les expérimentations seront regroupées au maximum (les contröle seront mises en commun pour réduire le nombre de têtards). De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’exposition des larves par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards. Un même têtard sera utilisé pour mesurer de nombreux biomarqueurs évitant de multiplier le nombre de têtards avec le nombre de biomarqueurs. Enfin une anesthésie stricte est utilisée à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les bénéfices attendus sont donc les impacts sur la société et l'économie, en incitant l'industrie de l'eau à protéger l'environnement des rejets d'effluents contenant des contaminants tout en prenant en compte le concept sociétal du"One Health" (une seule santé). On fait une évaluation écotoxicologique des effets des contaminants potentiels qu'on peut retrouver dans un effluent après traitement en comparaison avec avant traitement. L'analyse des biomarqueurs utilisés chez ces animaux exposés pourra renseigner notamment des nuisances et des effets indésirables. Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées au maximum sur les individus issus d'une même ponte et pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun autant que possible. De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’expositions des larves de Xénope par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards.

Devenir

Les adultes réintègrent leurs aquariums. L'ensemble des larves et oeufs exposés sera euthanasié selon la méthode de mise à mort recommandée : surdose de l'anesthésique Tricaine methanesulfonate à 0,2 g/L (solution tamponnée au bicarbonate de sodium : pH 7.0).

Remplacement

Un test réglementaire de détermination de l'immobilisation chez les invertébrés daphnies (OCDE TG202) sera utilisé chaque fois que la toxicité aiguë d'un effluent ou d'un cocktail sera recherchée. Par conséquent, les gammes de concentration étudiés chez les xénopes seront établies en fonction des résultats de toxicité aiguë enregistrés chez la daphnie. Nous utilisons le test Daphnie, pour réduire le nombre de vertébrés utilisés et en l'absence de méthodes alternatives permettant d'étudier la toxicité de cocktails de polluants.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux : - Les reproducteurs utilisés proviennent d'un élevage interne et les larves issues des pontes seront utilisées dans les différentes procédures ==> Pas d'importations supplémentaires de nouveaux géniteurs: réduction du nombre d'animaux utilisés. - Le nombre d'animaux utilisé dans chaque procédure est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères et les embryons ou larves témoins négatifs sont mutualisées autant que possible en fonction de la disponibilité des matrices à étudiers

Raffinement

Raffinement -Les reproducteurs qui sont injectés en vue de la reproduction servent au maximum 3 fois par an ==> période de récupération de 4 mois. Leur manipulation est douce et est réalisée par du personnel expérimenté. Par exemple, l'injection de gonadotropines sera réalisée uniquement par deux membres du projet qui sont parmi les plus expérimentés (25 ans d'expérience). Autre exemple, l'animal est saisi dans l'aquarium en mettant délicatement sa tête dans la paume de la main et la partie abdominale est légèrement massée avec le pouce (ces gestes exercent une action calmante sur l'animal). L'injection se réalise en immobilisant l'individu dans la main. Les solutions hormonales sont sorties du réfrigérateur puis mises à température ambiante pour ne pas être douloureuse à l'injection. -Dans le but de réduire le stress des reproducteurs, les conditions d'élevage et d'exposition seront strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement pour réduire le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs).

Choix des espèces

Les amphibiens sont de bons modèles dans le cadre d'études écotoxicologiques et leur pertinence d'utilisation a été démontrée depuis plusieurs années : - Les stades larvaires sont particulièrement sensibles, ce qui en fait de bon indicateurs de la qualité des milieux. - Ce sont des animaux sédentaires qui sont de bon indicateurs des conditions locales. ==> Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d'éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement larvaire rapide et l'alimentation des larves est facile. Les reproducteurs de X. laevis seront utilisés au stade adulte (sexuellement mâtures : nécessaire pour la reproduction). Les larves de xénope utilisées dans ce projet sont agées de 2 à 3 semaines. Elles sont utilisées à ces stades de développement précis pour différentes raisons. Les stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, ainsi un nombre réduit d'animaux par rapport aux adultes est nécessaire pour détecter un éventuel effet délétère (réduction). Ces stades sont facilement repérables car ils correspondent à l'apparition du bourgeon de la pâte postérieure et l'anesthésie n'est donc pas nécessaire pour déterminer ce stade de développement (raffinement).