Formation professionnelle
Formation réglementaire pratique aux gestes expérimentaux sur souris et rats
- Formation professionnelle
Rats : 95
Pour 75 à 95 % d'entre eux, ce sont des animaux dits de réforme, déjà présents dans l'établissement et n'ayant pas le génotype attendu par les projets qui les ont fait naître. 1 810 souris et 95 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à la fin de chaque session. Chaque animal vigile subit trois gestes au maximum, une administration, un prélèvement sanguin et un nouvel essai si le premier a échoué, dont un gavage classé douloureux de façon modérée. Le porteur admet que la maîtrise des gestes par des expérimentateurs néophytes est imparfaite et peut générer plus de stress et de douleur, et indique que les planches anatomiques, le puzzle 3D et la peluche utilisés en démonstration ne remplacent pas l'animal vigile.
Objectifs
Les personnels de la recherche amenés à concevoir ou à réaliser des procédures expérimentales impliquant des animaux utilisés à des fins scientifiques ont l’obligation réglementaire d’acquérir une formation spécifique en experimentation animale. Cette formation initiale à l’expérimentation animale vise à délivrer les connaissances réglementaires requises concernant l’expérimentation animale (niveau applicateur). Au cours de cette formation pratique réalisée sur souris et/ou rats, les participants se familiariseront aux gestes techniques réalisés sur animaux vigiles tels que la manipulation et la contention, le sexage, le prélèvement sanguin et l’administration de molécules par différentes voies. La formation du personnel est indispensable pour maîtriser les gestes techniques, éviter la souffrance animale, limiter le risque d'erreur dans les procédures et limiter le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, une bonne maîtrise des gestes techniques participe au respect de la règle des 3R. (reduction, raffinement et remplacement)
Bénéfices attendus
Chaque participant recevra ainsi une formation pratique prenant en compte le respect du bien-être animal et la règle des 3R. La qualité de ces formations contribue ainsi à court terme à la maitrise des gestes techniques permettant d’obtenir à moyen terme des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles tout en réduisant au maximum le stress et la souffrance des animaux et leur nombre.
Procédures
3 injections = 15s par injection douleur légère; 1 administration orale par gavage = 1 min douleur modérée; 1 prélèvement = 15s douleur légère. Un même animal vigile aura une combinaison maximale de 3 gestes (une administration et un prélèvement et un nouvel essai si l'un des gestes était non concluant)
Impact sur les animaux
La préhension et la contention des animaux peut induire un stress chez les animaux. Les administrations réalisées sur animaux vigiles peuvent induire un stress et une douleur de courte durée. Le prélèvement sanguin réalisé sur animal vigile peut induire un stress et une douleur légère de courte durée. S’agissant d’expérimentateurs néophytes, la maitrise des gestes techniques est imparfaite et peut générer plus de stress et de douleur qu’effectués par des expérimentateurs compétents et expérimentés.
Devenir
A chaque session de formation, l’intégralité des animaux seront mis à mort car il s'agit d'animaux issu d'élevage, n'ayant pas initialement le bon génotype d'intérêt.
Remplacement
Nous avons mis au point diverses méthodes au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage des gestes de contention ou de techniques d’administration ou de prélèvements en situation réelle, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et nécessitent l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
De notre expérience, 75 à 95% des animaux nécessaires à cette formation sont couverts par des animaux de réforme de l'établissement utilisateur accueillant cette formation (réutilisation des animaux n'ayant subi aucune autre procédure > classe légère). Seuls 5 à 25% maximum des animaux nécessaires à cette formation nécessiteront une provenance d’un fournisseur. Trois sessions par an de cette formation réglementaire seront réalisées.
Raffinement
Pour la séance de travaux pratiques, les animaux seront amenés dans leur cage d’hébergement dans la salle de travaux pratiques quelques heures avant le début de la séance pour habituation. Le stress des animaux sera réduit au maximum en commençant cette session pratique par une approche douce d’habituation aux animaux par des techniques de préhension douce permettant aux participants de maîtriser leur propre appréhension. Les participants seront en situation réelle sensibilisés à la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal. Les gestes techniques d’administration et de prélèvement ne seront réalisés par le participant que lorsqu’il maitrisera parfaitement la contention, celle-ci étant validée par l’encadrant. Le nombre de gestes techniques réalisé sur chaque animal est limité et chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration et d’un prélèvement sanguin. L’encadrant veille tout au long de la séance de formation pratique au respect du bien-être animal et sensibilise en continu les participants au raffinement des techniques.
Choix des espèces
La formation étant spécialisée sur les rongeurs et les lagomorphes, des rongeurs (souris ou rats) mâles et femelles âgés de 8 semaines et plus seront utilisées dans ce projet.
Formation à la chirurgie de mise en place d’implants télémétriques factices et fonctionnels, à leur calibration et à la vérification de leur fonctionnement dans le cadre de l’installation d’une plateforme de télémétrie rongeurs
- Formation professionnelle
L'objet du projet est l'acquisition d'un geste chirurgical par un service qui veut ensuite le proposer en prestation aux équipes de recherche, et 40 souris y sont utilisées, toutes tuées. Quinze d'entre elles, prises parmi des productions surnuméraires et des reproducteurs réformés, sont opérées sous anesthésie pour la pose d'implants factices et tuées avant tout réveil. Les vingt-cinq autres reçoivent un implant fonctionnel lors d'une chirurgie de moins de quarante-cinq minutes, puis subissent trois tests métaboliques précédés chacun de cinq heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tuées pour que la pose soit vérifiée par autopsie. Le porteur présente la télémétrie implantée comme un gain pour le bien-être des animaux non-humains puisqu'elle évite les prélèvements sanguins répétés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle technologie au sein de notre établissement. La technique sera apprise via une formation dispensée par le fournisseur de la technologie installée pour la pose d’implants télémétriques chez les rongeurs. Cette formation de 2 jours devra impérativement être complétée par un renforcement de l’apprentissage sur site de manière à être pleinement opérationnel et maitriser les gestes techniques complexes que nécessite cette approche technologique. Le but, maîtriser le geste au sein du service et pouvoir le mettre à disposition des usagers en tant que service d’accompagnement. Une étude pilote pour la validation de la chirurgie d’implantation, la maîtrise du geste et la réalisation de tests métaboliques permettront de s’assurer que l’ensemble des tests réalisés par la suite pourront être assuré par le service. La télémétrie interne implantable donne la possibilité de réaliser des études longitudinales sur animal conscient et non contraint, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisé, leur stress tout en participant au raffienement de leur bien-être. Il s’agit pour notre service de proposer une approche collaborative et de préstations aux équipes de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de proposer un service d’accompagnement aux utilisateurs sur le long terme. La mise en place de cette nouvelle technologie au sein du service favorisera l’amélioration du bien-être animal en réduisant le stress des animaux lié aux manipulations. En effet, elle permettra de collecter des données physiologiques, d'activité et de glycémie sur animal non contraint, libre de ses mouvements, maintenu dans sa cage et sans avoir à réaliser les prélèvements sanguins itératifs habituellement utilisés. Dans le cas de l’implant au glucose, les données seront collectées en continu par l’intermédiaire du capteur sur une durée de 6 semaines. Seul 1 prélèvement de sang à la queue réalisé 2 fois (à 2 et 4 semaines après la chirurgie) sur la période d'enregistrement est nécessaire afin d'assurer la recalibration du système. Ainsi, ce dispositif pourra être utilisé sur des modèles animaux (diabète, obésité ect.) qui seront utiles à la santé humaine. De plus une grande diversité d'implants télémétriques étant disponible, nous pourrons transposer la techniques à l'enregistrement d'un ensemble d'autres paramètres physiologiques (ECG, EMG, pression artérielle,...).
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une chirurgie permettant la pose d'un implant permettant l'enregistrement de paramètres physiologiques en temps réel. Immédiatement après la chirurgie les animaux seront remis dans leur cage d'origine sans aucun changement et il nous sera alors possible d'acquérir en temps réel sans la moindre contrainte supplémentaire pour l'animal, des données physiologiques nécessitant habituellement des interventions directes et plus ou moins lourdes pour l'animal selon les paramètres mesurés. La chirurgie pour la mise en place de l'implant sera réalisée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique totale en pré, per et post-opération et durera moins de 45 minutes. Tous les animaux du projet seront soumis à cette procédure chirurgicale. Afin d'acquérir les gestes très précis et complexes que nécessite ce type d'expérimentation, un premier lot d'animaux sera implanté avec des implants factices (15 animaux au maximum) puis un fois le geste parfaitement maitrisé, un second lot dit "fonctionnel" comprenant 25 animaux maximum sera utilisé et implanté avec des implants fonctionnels. Ce lot sera séparé en sous-groupes de 5 animaux qui seront soumis à un test métabolique à 3 temps différents durant les 6 semaines d'activité de l'implant télémétrique. Pour ces tests métaboliques, une injection sera réalisée puis des prélèvements de sang (2 µL chacun) au bout de la queue seront pratiqués pour un volume total de moins de 30 µL par expérimentation. Ces prélèvements de sang permettront, par utilisation d'un lecteur de glycémie externe, de déterminer le taux de sucre sanguin et de le comparer à la valeur fournie par l'implant télémétrique. Les différents gestes réalisés en dehors de la pose de l'implant télémtrique auront des durées très courtes. Les injections par voie intrapéritonéales ou per os nécessiteront une contention d'environ 15 secondes durant laquelle l'injection sera réalisée sur une durée de moins de 5 secondes. Les prélèvements sanguins au bout de la queue se feront sur des animaux maintenus sur le fond de leur cage par la base de la queue pendant moins de 10 secondes juste pour limiter leur déplacement. Cette "préhension" permettra le prélèvement de la goutte de sang pour la mesure de la glycémie, ce prélèvement durera moins de 5 secondes. Enfin pour l'injection intraveineuse de glucose, celle-ci se fera sur animal sédaté à l'isoflurane afin de limiter le stress. La sédation durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour la pose d’un implant de télémétrie. Les animaux peuvent alors ressentir de potentielles douleurs qui seront prises en charge par une couverture analgésique complète pré, per et jusqu’à 48h en post-opératoire. Pour valider la technologie et la fiabilité des dispositifs une fois implantés, les animaux seront soumis à un test métabolique en condition vigile dans le but de comparer les mesures obtenues par le capteur implanté à la réalité physiologique. Le test métabolique sera répété 3 fois durant les 6 semaines d’enregistrement du capteur. Pour ces tests, les animaux seront mis a jeun pendant 5 heures avant chaque test physiologique qui durera 3h. Une potentielle perte de poids consécutive à la mise à jeun peut être observée et sera surveillée de près. Afin de limiter cette possible difficulté, deux semaines de repos seront laissées entre chaque expérimentation. Le suivi de la glycémie sera réalisé durant ces tests par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue. Une potentielle douleur peut être ressentie lors du premier prélèvement, celle-ci sera couverte par un traitement analgésique réalisé 15 minutes avant l’acte. De plus, une asepsie de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement et après le dernier afin de limiter le risque d’infection Enfin, pour limiter le stress que pourrait induire la contention nécessaire (moins de15 secondes) aux différentes injections, une habituation des animaux à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation sera réalisée plusieurs semaines avant le début des procédures. Les injections en elles-mêmes ne généreront pas une douleur supérieure à celle causée par la piqure d’une aiguille.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de valider la pose de l’implant par autopsie.
Remplacement
L’utilisation de cadavres issus d'autres projets en fin de procédure permettra d’étudier en détail l’anatomie, offrant ainsi un environnement sécurisé pour se familiariser avec les repères physiologiques et anatomiques sans risque pour les animaux et les manipulateurs. Toutefois, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour valider la maîtrise des gestes et la technologie, mais aussi pour assurer un personnel qualifié et compétent permettant ainsi de veiller au bien-être des animaux. De plus, un projet collaboratif visant à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2 et nécessitant cette technologie est déjà planifié, il est donc important de réaliser ces gestes en amont sur animaux vivants et ainsi se confronter aux conditions physiologiques associées à cette méthode. Aussi, la formation spécifique dispensée par la société ayant installé le dispositif réduira le nombre d’animaux nécessaire sur site, puisque ce projet constituera un renforcement de la qualification du personnel.
Réduction
Dans un premier temps l'emploi d'animaux morts issus d'autres projets et la formation spécifique dispensée en amont de la réalisation de ce projet nous permettront de rédurire le nombre d'animaux nécessaires à la mise en place de notre plateforme. Dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons divisé les animaux en deux lots dont le premier sera constitué d’animaux implantés avec un dispositif factice. Le nombre maximal sera de 15 animaux et seront issus de reproductions surnuméraires, d’ancien(-nes) reproducteurs(-trices) ou d’animaux présentants des critères non adaptés. Pour le second lot, des mesures métaboliques seront pratiquées sur les animaux implantés, avec maximum de 35 animaux. Dans les deux cas, si un nombre moins important d’animaux nous permettait de valider la technologie, le projet sera considéré comme terminé. Ce nombre n'a pas été déterminé par approche statistique dans la mesure où il s'agit de l'acquisition d'un geste.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront optimisées afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle. Les animaux seront maintenus, au minimum, 3 par cage et maximum 5 pour éviter tout isolement social ou surpopulation. Tous les animaux bénéficieront d’un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum hormis durant les 9h de mise a jeun avant et pendant les tests métaboliques au cours desquelles seul l'accès à l'eau sera maintenu. Cette mise a jeun sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines sur 6 semaines donc 3 fois au total. Un suivi quotidien sera assuré, avant, pendant et après les manipulations, par le personnel soigneur et les responsables du projet. Lors de la réalisation des procédures, une surveillance clinique sera assurée par les manipulateurs. Si des signes de souffrance ou de stress, définis selon des critères préalablement établis, étaient constatés, le suivi des animaux serait renforcé. Parmi ceci, plusieurs signes indicatifs seront observés : comportement de l’animal (absence de toilettage, vocalisations, stéréotypies, léchage, automutilation, prostration, létargie, isolement …), apparence générale (état du poil, position des oreilles, gonflement des yeux, position des moustaches), variation du poids, plaies ou cicatrisation difficile. En cas d'apparition d'un de ces signes une prise ne charge médicamenteuse sera faite par utilisation d'anti-inflammatoires et d'analgésiques adaptés. La procédure de chirurgie, susceptible d’entraîner une douleur, sera réalisée sous anesthésie, avec une prise en charge de la douleur avant pendant et après la procédure par utilisation d'analgésiques spécifiques à chacun des gestes. Pour favoriser la récupération des animaux 2 semaines de repos minimum leur seront laissées entre chaque expérimentation. La prise en charge d’une potentielle douleur et/ou infection lors du prélèvement de gouttes de sang au niveau caudal sera assurée par une injection d’analgésiques 15 minutes avant et l’application d'un antiseptique et antimycosique avant et après le prélèvement. Pour limiter le stress lié à la contention durant les expérimentations une habituation à la salle d’expérimentation et à l’expérimentateur sera systématiquement réalisée en amont.
Choix des espèces
Les équipes utilisatrices du service de ressources biologique utilisent principalement des souris pour leurs études. L’objectif de ce projet étant de développer une plateforme de télémétrie rongeurs, dans la continuité d’une formation pratique dispensée sur modèle rongeur par un prestataire externe, le modèle souris sera alors utilisé et préféré au modèle rat. Les souris seront utilisées à des stades adultes, à partir de 8 semaines, toutefois l’âge des animaux n’impactera que peu le projet et il pourra ainsi être étendu de quelques semaines en fonction des animaux disponibles. Le sexe des animaux n'ayant pas d’incidence sur les procédures prévues, les animaux utilisés proviendront de fins de procédure d'élevage, de productions surnuméraires ou à critères non-adaptés, garantissant ainsi une sélection sans critère de sexe des animaux pour ce projet.
Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments après administration intrathécale
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 2200
2 650 rats et souris vont être utilisés, dont 2 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour examen des organes. Une chirurgie de trente minutes leur pose un cathéter dans l'espace qui entoure la moelle épinière, puis les composés y sont injectés jusqu'à trois fois par semaine pendant deux semaines, avec jusqu'à neuf prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et un jeûne de seize heures avant la mise à mort chez le rat. Le porteur estime qu'un quart des animaux, ceux qui reçoivent la dose forte, présenteront des signes modérés et exceptionnellement sévères, parmi lesquels stéréotypies, agressivité, tremblements et perte de plus de 20 % du poids. L'objet du projet est d'écarter tôt les molécules toxiques pour éviter des études réglementaires qu'il décrit comme coûteuses "d'un point de vue éthique, en animaux, et économique".
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les effets liés à l’administration par voie intrathécale d ‘une molécule d’intérêt. L'injection intrathécale est une injection dans l'espace sous-arachnoïdien. L'espace sous-arachnoïdien constitue le canal rachidien et contient le liquide cérébrospinal (LCS). Cela permet d'administrer le médicament dans le LCS. L'administration peut se faire à l'aide d'une aiguille à ponction lombaire ou avec un catheter implanté au cours d'une intervention chirurgicale Ces effets pourront être reliés à la concentration du candidat médicament administré grâce à des données d’exposition générées • de déterminer, dans le cas de toxicité, des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en analysant les échantillons biologiques obtenus dans le Projet, à l'aide de méthodes d’analyses ex vivo de biologie moléculaire, génomique, protéomique ou métabolomique.
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement d’un candidat-médicament les effets de toxicité du composé- test afin d’arrêter son développement avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet contribue à mettre sur le marché des médicaments sûrs et sécurisés chez l'homme pour des maladies dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits à ce jour dans le domaine du système nerveux. Pour cibler une indication du système nerveux central, certaines molécules ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique lorsqu’elles sont administrées par voie systémique dû, entre autres, à leur taille moléculaire et leur charge ionique négative. Elles doivent alors être administrées localement par voie intrathécale dans le liquide cérébrospinal. Cette voie d’administration est aussi celle utilisées chez l’homme et permet une distribution ciblée de la molécule dans le système nerveux central, ce qui est crucial pour traiter des maladies neurologiques.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Pose d’un cathéter intrathécal par chirurgie : durée 30 minutes. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : durée quelque secondes sur animaux anesthésiés si administration transcutanée et sur animaux vigiles si animaux porteurs d’un cathéter. Unique ou répétée max 4 fois à un intervalle d’une semaine si administration transcutanée ou 3 fois maximum par semaine pendant 2 semaines avec cathéter. • Anesthésie et analgésie pour des administrations intrathécale : durée de 5 minutes, maximum 4 fois à un intervalle d’une semaine. • Prélèvements de sang : o en microsampling : Durée 60 secondes sur animal vigile. Maximum 9 fois sur 24h. oprélèvement terminal en fin d'étude sous aneesthésie profonde : Durée 1 minute sous anesthésie générale. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, matériel de nidification et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Durée de l’hébergement individuel maximal de 24h. • Préhension douce lors des observations générales et neurologiques : durée 1 minute sur animal vigile, 6 fois maximum par jour. • Test de coordination motrice : 6 sessions d’une durée de 5 minute maximum sur animal vigile, avec une récupération de 15 minutes entre chaque session. •Mise à jeun d‘une durée maximale de 16h chez le rat préalablement à la procédure terminale de l’étude en vu des prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à des possibles doses toxiques ou de doses maximales tolérées de composés à tester peuvent provoquer des effets indésirables. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux peuvent manifester des signes cliniques légers à modérés généralement et exceptionnellement sévères si la produit s’avère toxique :changements de comportements comme l’apparition de stéréotypie et/ou d’agressivité, barbering, hypomotilité, négligence du toilettage, posture analgésique, baisse de la prise alimentaire ou hydrique, dégradation de l’état général comme l’apparition d’une prostration, modifications de la fréquence respiratoire, manifestation de signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des contractions, selles diarrhéiques ou perte majeure du poids corporel (
Devenir
Pour l’ensemble des 3 procédure décrites ci-dessus, les animaux sont tous mis à mort en fin de procédure. Pour les besoins de l’évaluation de la tolérance des composés testés, les organes doivent être observés et des analyses tissulaires réalisées qui nécessitent la mise à mort des animaux en fin d'étude.
Remplacement
De nombreux tests in silico (simulations effectuées utilisant des modèles numériques) ou in vitro de toxicité ont déjà été mis en œuvre pour remplacer le recours aux animaux. Les tests actuellement disponibles ne permettent pas encore de répondre à tous les besoins pour écarter la toxicité des molécules en cours de développement. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques d'un animal qui puissent développer des effets secondaires ou toxiques après administration unique ou répétée d'un composé test.
Réduction
Les molécules d’intérêt auront préalablement fait l’objet de test sur des batteries de test in silico et in vitro permettant de ne sélectionner que les candidat médicament les plus prometteurs afin de réduire au maximum la phase vivo du développement. Pour les molécules qui sont développées en phase vivo, le nombre d'animaux est déterminé pour répondre à la question scientifique tout en réduisant au maximum celui-ci. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la toxicologie et des publications scientifiques. Le nombre minimal par cohorte est réduit au minimum scientifique de 3 pour sélectionner de candidate en phase pré-clinique et cela pourra aller à 8 animaux maximum pour répondre scientifiquement à l’objectif de l’étude si des analyses supplémentaires sont à prévoir ou une variabilité forte est attendu sur le modèle. Les recommandations de l’agence européenne des médicaments demandent également à réduire autant que possible le nombre d’animaux, notamment en évitant d’ajouter des groupes contrôles ou véhicule quand cela est possible, notamment lorsqu’il existe des données déjà publiées ou historiques. Le nombre d’études sur les 5 prochaines années pour ce projet a été déterminé à partir des données historiques et de l‘évolution de la recherche sur certaines modalités utilisées dans le système nerveau centrale. Au total ce projet pourrait utiliser 2650 animaux sur 5 ans. Les données expérimentales sont analysées avec des tests statistiques adaptés. Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, lors d’administration de fortes doses, un ou deux animaux de la cohorte sont traités afin d’évaluer la tolérance au produit à fortes doses. En cas de signes cliniques majeurs sur ces animaux, le reste de la cohorte ne sera pas traité aux fortes doses. Par ailleurs, les fortes doses lors d’études type Dose Répétée ou Dose Maximale Tolérée après des administrations répétées ou une seule administration, seront administrées, autant que possible, lorsque la certitude d’absence d’effets secondaires sera observée sur les doses inférieures.
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention vigiles sont limitées et la durée est inférieur à 5 minutes. L'hébergement individuel est nécessaire après chirurgie pour suivi (maximum 24h). L'hébergement individuel peut survenir pour des raisons vétérinaires. Dans tous les cas, des contacts olfactifs, auditifs et visuels entre congénères seront maintenus ; de plus, un surenrichissement (plus de quantité de litière, tunnel, matériel de nidation) dans le micro-environnement est prévu. Les observations des animaux sont renforcées tout au long de cette période d'hébergement individuel. Lors d'une procédure, l'observation quotidienne des animaux par le personnel dûment formé permet de détecter toute anomalie. Des critères d’alarme et/ou d’interruption ainsi qu’un arbre décisionnel d’arrêt ayant été définis et diffusés à tous les intervenants, l’apparition de trois signes cliniques notables ou d’un signe clinique sévère font l’objet d’une évaluation par le responsable de la mise en œuvre du projet en collaboration avec le vétérinaire clinicien. Les animaux sont manipulés avec des méthodes douces de contention type soft handling pour toutes les manipulations du projet.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux juvéniles (de 3 semaines d’âge minimale) pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué ou si la population finale humaine pour laquelle la molécule va être utilisée est une population juvénile.
Diplôme Universitaire de Microchirurgie: apprentissage de microsutures vasculaires et nerveuses chez le rat
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Un diplôme universitaire de microchirurgie mobilise 1 380 rats adultes, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque étudiant reçoit un animal par séance et pratique sur lui deux interventions, une suture de l'aorte abdominale et une suture du nerf sciatique, la séance durant trois heures anesthésie et mise à mort comprises. L'objet déclaré est l'apprentissage du geste et du stress opératoire par des étudiants chirurgiens ou vétérinaires. Le porteur indique que les étudiants s'exercent d'abord sur des nouilles japonaises puis sur des pattes de poulet, avant d'affirmer que la pratique sur le vivant est "indispensable" avant le passage à l'homme.
Objectifs
L’objectif de la formation est de permettre l’apprentissage de la microchirurgie en condition opératoire avant l’application chez l’homme. Le but étant d’apprendre à des étudiants chirurgiens ou vétérinaires en formation à réaliser des sutures vasculaires (entre deux bouts d'un vaisseau) et des sutures nerveuses (fragments de nerfs sciatiques). L'apprentissage se déroulera sous forme de travaux pratiques (TP).
Bénéfices attendus
Les étudiants inscrits à ce diplome apprennent des techniques de Microchirurgie qui sont essentielles pour leurs cursus de futurs Chrirugiens
Procédures
Les animaux auront deux interventions chirurgicales, une sur l'aorte abdominale et la deuxième, sur le nerf sciatique. La durée des travaux pratiques sur chaque animal est de 3 heures (anesthésie, rasage, installation du poste de travail, intervention de l’animal, euthanasie, et rangement du poste de travail).
Impact sur les animaux
lIl n'y a pas de réveil de l'animal, ni de test statistique de prévu.
Devenir
Les animaux de ces travaux pratiques ne peuvent être réveillés, ils seront euthanasiés en fin de ces séances.
Remplacement
Après un entrainement technique : au maniement du microscope, des instruments chirurgicaux et de premières sutures sur des nouilles japonaises ainsi que sur des pattes de poulet, la réalisation d’actes techniques sur le vivant est indispensable à la maitrise du geste chirurgical et du stress opératoire (saignement par exemple) avant le passage à l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pendant l’année scolaire, la première séance consistera en une vidéo commentée de l’enseignant chirurgien référent qui expliquera notamment les gestes à acquérir pour suturer un vaisseau, un nerf ainsi que de montrer les techniques permettant l’absence de tout germe infectieux. Des nouilles japonaises seront utilisées les deux premières séances des travaux pratiques ; puis des pattes de poulet les séances d’après. Enfin, toujours dans un objectif de réduction, lors de chaque séance, l’étudiant se verra attribuer un seul animal sur lequel sera réalisé l’anastomose vasculaire et nerveuse.
Raffinement
Le jour de la séance, une prémédication se fera 45 minutes avant l’acte chirurgical, afin d'assurer une couverture antalgique. Une analgésie locale sera également réalisée sur la partie abdominale de l’animal ainsi que sur la cuisse.
Choix des espèces
Le rat est un bon modèle pour l’entrainement chirurgical puisque la taille de l’aorte (artère) est très proche des vaisseaux à suturer chez l’homme. Pour cela, des rats adultes de 300g sont nécessaires pour une taille suffisante des organes à suturer.
Culture d’hépatocytes primaires murins : Formation des agents et application expérimentale
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
200 souris vont être utilisées, anesthésiées puis ouvertes au niveau de l'abdomen et tuées avant tout réveil. Une injection intrapéritonéale précède l'endormissement, la paroi abdominale est ouverte et la veine cave perfusée pour récupérer les hépatocytes. Vingt souris sont utilisées pour former le personnel de l'animalerie au geste, les autres sont tuées pour prélever des cellules, à raison de trois par mois pendant cinq ans. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme l'expérimentation animale grâce aux organes sur puce, tout en affirmant que la souris est le "seul modèle utilisable" puisque les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir et varient d'un donneur à l'autre.
Objectifs
Dans l’idée de reconstituer in vitro des organes-sur-puce, nous aurons besoin de cellules provenant de foie de souris (hépatocytes primaires) car les lignées cellulaires de cellules du foie existantes reproduisent mal les caractéristiques de ces cellules primaires. Nous avons donc besoin de pouvoir obtenir des hépatocytes de la souris. Le but du projet est de former le personnel de l’animalerie pour installer la technique de récupération de ces hépatocytes primaires de souris pour ensuite les utiliser pour nos besoins expérimentaux pour le développement de multiorganes-sur-puces in vitro reproduisant les interactions inter organes dans le corps entier et permettra par la suite de réduire l’expérimentation animale pour l’étude des communications inter-organes car les cellules d’une souris permettent de construire plusieurs organes-sur-puces.
Bénéfices attendus
Deux bénéfices sont attendus : Installation de la technique d’isolement des hépatocytes de souris . Développement d’un multiorgane-sur-puce pour la diabétologie
Procédures
Aucune expérimentation ne se fera sur animal vigile, les nuisances pour les animaux dans ce projet seront les injections intrapéritonéales qui seront suivie d’une chirurgie sans réveil, le temps d’endormissement sera de 5 à 10 min (vérifié par pincement de la patte, et réadministration d’anesthésique si réaction), l’ouverture de la paroi abdominale jusqu’à la perfusion de la veine cave durera 1 à 2 min maximum, au moment de la section de la veine porte, la souris ne sera plus vivante : arrêt de la circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Aucune nuisances ou effets indésirables ne sont attendus du vivant de l’animal qui sera hébergé dans des conditions habituelles à 5 animaux par cage, la procédure effectuée sur ces animaux sera sans réveil (après analgésie et anesthésie profonde).
Devenir
Procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Les lignées cellulaires de foie reproduisent mal les caractéristiques fonctionnelles des cellules natives. Les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir, ont une très grande variabilité inter-donneurs, et ne permettent pas d’investiguer des modèles transgéniques. Les souris sont donc le seul modèle utilisable dans ce projet. Nous aurons un besoin régulier en cellules de foie natives de souris (3 par mois maximum), les cultures ayant une durée de vie autour de 4 jours.
Réduction
S’agissant ici d’une procédure pour formation de personnel dans le but d’obtenir ensuite des cellules de foie primaires sur 5 ans, le nombre minimum de souris pour permettre aux agents de se former a été estimé à 20 (comprenant le nombre de souris utilisées par le formateur ainsi que les nouveaux-formés). Le reste des animaux servira à nous fournir ensuite en cellules (3 fois par mois maximum) pour nos besoins expérimentaux sur la durée du projet. Ce projet permettra in fine d'utiliser moins d'animaux en expérimentation car une souris peut fournir assez de cellules de foie pour environ 5 organes-sur-puces. Les organes-sur-puce comme ceux développés dans ce projet permettront, à terme, de répondre à un plus grand nombre de questions scientifique du fait de l'environnement contrôlé de la culture primaire en évitant les facteurs confondants et les compensations qui existent in vivo. Bien évidemment, nous utiliserons strictement le nombre d’animaux nécessaire dans un souci de « réduction » et le développement du modèle 4-organes-sur-puce pourrait prendre moins de 5 ans et utiliser moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront regroupés à 5 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi par des dômes, tunnel, morceau de bois, maison rouge, coton de nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Lors de l’utilisation des animaux pour récupérer les cellules du foie, une solution d’analgésique leur sera administrée 30min avant l’anesthésie. La profondeur de l’anesthésie sera mesurée par vérification des paramètres et constantes de suivi de la narcose chez le rongeur.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle animal car c’est un mammifère relativement proche phylogénétiquement et physiologiquement de l’Homme qui permet l’accès à un maximum de modèles transgénique par la suite lorsque le multiorgane-sur-puce sera mis au point. Les cellules primaires de foie seront récupérées sur souris C57BL/6J mâles et femelles de 6 à 15 semaines.
Utilisation d’animaux à des fins de formation, de raffinement en vu de futurs protocoles ou d’amélioration de pratiques zootechniques (MODIFICATION)
- Formation professionnelle
Rats : 40
Cochons d'Inde : 50
Hamsters dorés : 400
Gerbilles de Mongolie : 10
Lapins : 20
Chats : 40
Chiens : 25
Cochons : 100
Chèvres : 30
Moutons : 50
Bovins : 50
Poules : 400
Dindes : 100
Autres oiseaux : 100
La formation du personnel aux gestes techniques mobilise ici 1 915 animaux de quinze espèces, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger : 500 souris, 400 hamsters dorés, 400 poules, 100 porcs, 100 dindes, 50 bovins, 50 moutons, 50 cochons d'Inde, 40 chats, 40 rats, 30 chèvres, 25 chiens, 20 lapins, 10 gerbilles et 100 autres oiseaux. L'objectif déclaré tient autant à l'apprentissage qu'à la fiabilité des études permettant de commercialiser des vaccins et des médicaments vétérinaires. Les stagiaires s'exercent à la contention, aux administrations et aux prélèvements sur des animaux vigiles, l'acte étant le plus souvent pratiqué juste avant une mise à mort de fin de procédure, et le porteur écrit qu'il est "parfois indispensable" de recourir à des animaux quand la formation ne peut être acquise autrement. 130 individus, dont cinq chats et cinq chiens, sont réutilisés d'une formation à l'autre, puis tués dans la majorité des cas.
Objectifs
MODIFICATION : Le projet a pour objectif de former le personnel sur les actes techniques pratiqués sur toutes les espèces de l’établissement utilisateur, raffiner les futurs protocoles ou améliorer les pratiques zootechniques. Concernant la formation du personnel, celle-ci s’effectuent sous tutorat lors des procédures expérimentales. L’acte est pratiqué juste avant une euthanasie de fin de procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet proviennent de procédures expérimentales de gravité « Léger » ou « Modéré ». Dans le cas de formation sur jeunes animaux, les animaux seront commandés spécifiquement pour ce projet et ceux-ci pourront être réutilisés ou placés. Concernant le raffinement de futurs protocoles ou amélioration des pratiques zootechniques, les animaux utilisés sont des animaux surnuméraires ou des animaux qui ont déjà effectué une procédure expérimentale (léger ou modéré) après avoir étudié toutes les possibilités d’utilisations ou de placement.
Bénéfices attendus
L’objectif étant de former du personnel compétent pour utiliser les modèles animaux à des fins scientifiques et garantir la fiabilité des études qui premettent de commercialiser des vaccins et des produits pharmaceutiques vétérinaires.
Procédures
Toutes les formations s’effectuent sous tutorat. Les actes de formation peuvent porter sur la contention de l’animal, des apprentissages d’administrations ou de prélèvements. En fonction des actes l’animal peut être vigile ou anesthésié. Tous ces actes s’effectuent en quelques minutes et en respect de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une légère augmentation de stress due aux actes techniques et aux manipulations.
Devenir
Dans la majorité des cas les animaux sont euthanasiés après leur réutilisation en formation. Dans quelques cas, les animaux peuvent être utilisés plusieurs fois en formation.
Remplacement
La formation du personnel est assurée par du tutorat lors de procédures expérimentales ou sur des modèles n’utilisant pas l’animal (silicone, informatique, tissus…). Néanmoins, il est parfois indispensable d’avoir recours à des animaux lorsque cet objectif ne peut être atteint par d’autres approches.
Réduction
Il n’y a pas de justification à augmenter les effectifs d’animaux pour la formation, le nombre sera donc réduit au plus juste. Les animaux utilisés pour la formation sont des animaux qui ont déjà été utilisés dans la grande majorité des cas.
Raffinement
L’utilisation d’animaux pour des formations spécifiques ne sont mises en œuvre que lorsque la formation souhaitée ne peut être acquise autrement. La période de formation est toujours supervisée par un tuteur. L'acte de formation est pratiqué sur animal vigile une fois que l'acte est maitrisé sur cadavre ou animal anesthésié, ceci permet au tuteur d'évaluer la maitrise de l'opérateur en condition d'étude. A ce niveau l'acte ne requiert aucune anesthésie ou analgésie. Les points limites mis en place sont des points limites généraux liés à l'espèce. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux utilisés pour la formation sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
La formation doit se faire sur l’espèce concernée Le stade de développement des animaux utilisés pour ce projet, sera identique à celui des animaux utilisés dans les procédures expérimentales
Enseignement pratique de la chirurgie cœlioscopique en gynécologie sur modèle porcin
- Formation professionnelle
Former des internes et des chirurgiens en exercice à la cœlioscopie gynécologique, sur un modèle vivant plutôt que sur des patientes. 20 cochons vont être utilisés dans une procédure unique de chirurgie sous anesthésie générale profonde, tués avant tout réveil. L'intervention peut durer jusqu'à sept heures, plusieurs apprentissages étant enchaînés le même jour sur le même animal par plusieurs chirurgiens en formation, avec les risques d'hémorragie, d'hypotension, d'hypothermie et d'hypoventilation que le porteur énumère. Il justifie le recours au porc par une anatomie thoracique, abdominale et pelvienne proche de celle d'une femme adulte, et cite l'objectif éthique de la Haute Autorité de santé, "jamais la première fois sur le patient".
Objectifs
A l’heure où les recommandations de bonnes pratiques nous interdisent, à juste titre, l’enseignement initial de la chirurgie sur les patients, nous organisons des travaux pratiques en chirurgie et pratiques interventionnelles pour les jeunes chirurgiens en proposant un apprentissage intégré. L’objectif est de faciliter l’acquisition des techniques et des gestes opératoires à la fois par voie abdominale ouverte (laparotomie) et par coelioscopie (ou laparoscopie), répondant parfaitement aux besoins de simulations nécessaires à une formation pratique initiale et continue. La formation s’effectue de façon progressive et intégrée au sein 1) du laboratoire de simulation, 2) du laboratoire d’anatomie, 3) du laboratoire de chirurgie ouverte et de laparoscopie sur porcs.
Bénéfices attendus
Ces sessions de formation répondent au rapport aux objectifs de la mission de la Haute Autorité de Santé sur l’état de l’art (national et international) en matière de pratiques de simulation dans le domaine de la santé : « La formation par les méthodes de simulation en santé doit être intégrée dans tous les programmes d'enseignement des professionnels de santé à toutes les étapes de leur cursus (initial et continu). Un objectif éthique devrait être prioritaire : « jamais la première fois sur le patient ». Ces sessions permettent la formation initiale des internes et continue des chirurgiens praticiens sur un modèle permettant un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine.
Procédures
Procédure unique de chirurgie sous anesthésie générale profonde et analgésie- Durée maximale 7 heures
Impact sur les animaux
Procédure chirurgicale, sous anesthésie générale longue (7h maximum) pouvant causer un stress et de la douleur et soumettant l’animal aux risques chirurgicaux et anesthésiques classiques (hémorragie, hypotension, hypothermie, hypoventilation).
Devenir
L’ensemble des procédures chirurgicales réalisées lors de cet enseignement ne permettant pas un réveil et un maintien en vie dans de bonnes conditions, aussi l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde.
Remplacement
Préalablement à l’accès à la formation chirurgicale sur modèle porcin, différentes phases de l’apprentissage sont développées en amont aux laboratoires de simulation et d’anatomie.
Réduction
Le nombre maximum estimé d’animaux (porcs) nécessaire à cet enseignement est de 20 animaux pendant 5 ans. De façon à réduire le maximum d’animaux nécessaires les différentes procédures d’apprentissage sont réalisées le même jour sur un même animal par plusieurs chirurgiens en formation.
Raffinement
Avant la procédure, les animaux peuvent être hébergés par 2 ou 3 par box, au sein d’une même pièce, selon leur taille, le sexe et leur comportement, permettant une communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire. Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale et des procédures suivantes. De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures de ce projet seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale et un traitement analgésique sera donné de façon adaptée à chaque procédure. Un suivi des points limites strict et spécifiques au projet est réalisé tout au long de la procédure.
Choix des espèces
L’anatomie du porc au niveau thoracique, abdominal et pelvien, ainsi que sa physiologie sont très proches de celles de l’homme, et de ce fait représente un très bon modèle vivant d’apprentissage et d’entrainement des diverses procédures chirurgicales avant d’approfondir l’apprentissage en chirurgie humaine. Jeunes porcs adultes, 4-6 mois, 80-100kg, similitude anatomique et physiologique avec un être humain féminin adulte au niveau thoracique, abdominal et pelvien.
Labyrinthe en T – Rat juvéniles
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Le test consiste à faire choisir des ratons entre une petite récompense immédiate et une plus grosse récompense qui suppose d'attendre, pour le compte de donneurs d'ordre qui font évaluer leurs candidats médicaments contre le TDAH. 2 000 rats juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Dès leur arrivée, ils sont privés d'enrichissement dans des cages blanches translucides et soumis à une restriction alimentaire intermittente commencée deux jours après le sevrage, avec des jeûnes pouvant atteindre vingt-quatre heures, puis reçoivent jusqu'à deux injections par jour. Cette privation est qualifiée d'"indispensable" pour maintenir le niveau d'impulsivité qui fait la validité du modèle, et le porteur rappelle que le projet précédent a mené un médicament jusqu'au marché européen, non remboursé en France faute de service médical rendu suffisant.
Objectifs
Le trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH) est un syndrome dont le diagnostic nécessite d'avoir trois composantes principales qui doivent persister pendant au moins six mois consécutifs: l'inattention, l'hyperactivité et l'impulsivité. La prévalence de ce trouble chez l’enfant de 6 à 12 ans est entre 3 et 6% en France. C’est un trouble du neurodéveloppement multifactoriel causé par de nombreux facteurs génétiques et environnementaux intriqués, intervenant tôt dans le développement du cerveau. La probabilité de transmettre ce trouble à sa descendance est de 75%. La thérapie cognitivo-comportementale (approche psychologique aidant les personnes à modifier leurs schémas de pensée pour améliorer leur comportement et leurs émotions) est particulièrement recommandée chez l’enfant atteint de TDAH mais elle n’est pas suffisante. Le traitement du TDAH nécessite une approche médicamenteuse en complément. Les seuls médicaments indiqués aujourd’hui dans le traitement du TDAH sont les psychostimulants apparentés aux amphétamines ou un inhibiteur sélectif de la noradrénaline utilisé en deuxième intention. Les psychostimulants procurent paradoxalement un effet d’apaisement chez l’enfant atteint de TDAH. L’efficacité de ces traitements médicamenteux est réelle chez certains patients mais néanmoins très perfectibles pour d’autres patients ne répondant pas à celui-ci. De plus, ces composés présentent des effets secondaires chez certains patients, notamment sur le plan du métabolisme, sur le plan cardiaque ou d’ordre psychiatrique. La recherche, encore aujourd’hui, de nouveaux traitements plus efficaces et présentant moins d’effets secondaires est donc une nécessité. Le modèle utilisé dans ce projet, le test du labyrinthe en T chez le rat juvénile, est un modèle qui représente le pendant impulsivité (inaptitude à attendre) chez l’enfant dans le TDAH. Ce modèle possède une bonne validité prédictive puisque les effets des médicaments possédant une autorisation de mise sur le marché pour le TDAH ont déjà été démontrés. Cela fait donc de ce modèle un bon modèle pour tester de nouveaux candidats médicaments. Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments, ayant montré une efficacité potentielle in vitro au préalable, dans un modèle représentatif du symptôme d’impulsivité observé dans le TDAH et qui a largement démontré sa validité, chez le rat.
Bénéfices attendus
Le précédent projet a permis de mettre en évidence des effets positifs d’un médicament qui a poursuivi son développement jusqu’à la mise sur le marché en Europe mais n’est pas remboursé en France car le servi médical rendu a été jugé insuffisant par la haute autorité de santé. A la fin de ce projet, nous espérons que certains candidats médicaments testés démontrent un effet significatif sur l’impulsivité des rats juvéniles comparé à l’administration d’un placébo par une augmentation du pourcentage de forte récompense choisie par les ratons dans notre modèle pour permettre de continuer le développement de potentiels futurs médicaments ayant moins d’effets secondaires et plus d’efficacité sur les patients résistants aux traitements actuels.
Procédures
Les animaux seront stabulés dans des cages opaques translucides (35 jours maximum). Ils seront soumis à un régime alimentaire particulier (18 jours maximum) comprenant des phases de jeun (maximum 24h), de restriction alimentaire et d’accès à l’alimentation ad libitum, en parallèle d’un test comportemental qui implique un choix entre une forte et une faible récompense alimentaire. Le but du projet étant de tester l’efficacité de candidats médicaments, les animaux seront injectés avec ces candidats médicaments, leur placébo ou des références positives de façon répétée (maximum 2 fois par jours sur toute la durée du test, durée d'une administration : moins d’une minute). Un prélèvement de sang pourra être réalisé sous anesthésie générale en fin d'étude et sur tous les ratons inclus dans une étude (5 minutes maximum). Lors de la journée d’habituation, les essais seront de 5 minutes environ et pourront de façon exceptionnelle aller jusqu’à 20 min maximum. Pour le reste du test, les animaux réaliseront 15 essais maximum par jour pour une durée totale maximale de 20 min.
Impact sur les animaux
Afin d’obtenir un niveau d’impulsivité nécessaire à la validité du modèle, les animaux dès leur arrivée dans nos locaux ne disposent pas d’enrichissement dans les cages et sont placés dans des cages blanches translucides laissant passer la lumière jusqu’à la fin de l’étude (à l’âge d’environ 7 semaines). Ils sont également soumis à une restriction alimentaire intermittente débutant deux jours après le sevrage et poursuivie jusqu’à la fin de la procédure de l'étude pour une durée maximum de 3 semaines. Cette restriction alimentaire est indispensable pour maintenir un niveau suffisant de motivation pour la nourriture, mais également un niveau d’impulsivité nécessaire à la validité du modèle. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents modes d’administration. Une administration d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. Un stress peut également être présent lors des premières manipulations des animaux dans la procédure comportementale. Des prélèvements de sang seront réalisés si besoin à la fin de l’étude sur animaux anesthésiés.
Devenir
Les animaux en fin d’étude seront mis à mort pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organes post-mortem.
Remplacement
Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : l’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie, la découverte de composés modulant la cible thérapeutique, l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité, leur validation fonctionnelle in vitro (ex : cultures de neurones) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à ces étapes et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permettent de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimaux pour notre projet. L’étude comportementale réalisée dans ce projet consiste à évaluer l’impulsivité chez le rat. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière certaine. Etant donné les nombreuses données internes et la variabilité probable des réponses aux candidats médicaments, 12 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d'assurer une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable. De plus et afin de réduire au maximum les animaux utilisés dans ce projet, nous demandons à notre fournisseur d’effectuer des adoptions en interne pour nous fournir des mamans avec uniquement des ratons mâles.
Raffinement
Les animaux arrivent à 9 jours d’âge avec leur mère pour qu’ils puissent avoir une période d’habituation d’au minimum 12 jours avant leur sevrage et 14 jours avant le début de la procédure. Au sevrage, les ratons de la même fratrie sont regroupés par 4 dans une même cage autant que faire se peut. A partir du début de la restriction alimentaire, les animaux sont pesés quotidiennement (hormis les jours où ils ont un accès à la nourriture ad libitum) pour maintenir une restriction suffisante mais éviter qu’elle soit trop importante, et leur état sanitaire est évalué quotidiennement. Les granulés sont coupés en petits morceaux et un quart est mis au fond de la cage pour faciliter l'accès à la nourriture lors de la restriction. Des points limites spécifiques au projet ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. Le rongeur est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le rat possède des circuits dopaminergiques, noradrénergiques et fronto-striés comparables à ceux des humains qui sont largement connus pour être centraux dans le TDAH (contrôle attentionnel, impulsivité, motivation). Dans notre modèle, les rats ont montré une aptitude à l’apprentissage et à l’impulsivité plus importante que les souris ce qui permet de diminuer la durée du test. Le but de ce projet est le développement de nouveaux candidats médicaments dans le traitement du TDAH chez l’enfant. Les animaux utilisés seront donc des animaux jeunes (juste après le sevrage). L’étude débutera dans la semaine qui suit le sevrage des animaux.
Réalisation des travaux pratiques de formations réglementaires en expérimentation animale sur rongeurs
- Formation professionnelle
Tuées à la fin de la séance pour servir à l'apprentissage de gestes post mortem, 1 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, dont 900 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent, en état de veille, jusqu'à deux administrations et un prélèvement sanguin, tentatives infructueuses comprises. Les autres subissent une ovariectomie qui peut occuper deux heures et demie de l'induction de l'anesthésie au réveil complet, les nuisances attendues venant surtout de gestes mal exécutés par les apprenants, avec risque de lésions, d'hématomes, d'infection, de détresse cardio-respiratoire et d'hypothermie. Le porteur précise que ces souris sont des animaux de surplus d'élevage déjà voués à la mort, et que peluches, papier, pièces de boucherie et cadavres de rongeurs servent aux premiers gestes, l'usage d'animaux vivants étant imposé par le ministère pour la partie pratique.
Objectifs
L’objectif du projet est la réalisation des travaux pratiques de formations réglementaires en expérimentation animale, conformément aux attendus législatifs. En effet, la réglementation (Directive européenne 2010/63/UE et Arrêté français du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques) impose à toutes les personnes travaillant avec des animaux utilisés à des fins scientifiques une obligation de formation spécifique : - Une formation initiale destinée aux soigneurs/applicateurs/concepteurs, selon la fonction occupée, dans l’année suivant leur prise de poste - Une formation complémentaire à la chirurgie, dans le cas de la pratique d’actes chirurgicaux Ces formations impliquent une partie d’enseignement pratique, sur rongeurs, permettant aux participants d’apprendre à mettre en oeuvre différents gestes de base, encadrés par des formateurs expérimentés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.
Procédures
Au cours des séances de travaux pratiques (d’une durée totale de 4h), les animaux peuvent être soumis soit à quelques techniques d’administration de substances et de prélèvement sanguin réalisées sur animal vigile (formations initiales), soit à une chirurgie réalisée sur animal anesthésié avec analgésie (formation chirurgie). Pour les formations initiales, chaque animal pourra faire l’objet au maximum de 2 administrations et d’un prélèvement sanguin (3 gestes invasifs maximum par animal). Chaque administration/prélèvement sanguin dure au maximum 5 minutes, en comptabilisant la durée des éventuelles tentatives infructueuses, soit 15 minutes maximum pour les 3 gestes par animal. Pour la formation chirurgie, chaque animal pourra faire l’objet d’une unique procédure chirurgicale de stérilisation (ovariectomie), sous anesthésie et avec une analgésie appropriée. Chaque procédure chirurgicale dure au maximum 2h30, du début de l’anesthésie au réveil complet.
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles pour les animaux sont principalement le stress ou la douleur pouvant être causés par des gestes incorrectement réalisées par les apprenants. Il y a également un risque de lésions tissulaires, d'hématomes et d'infection pour les gestes invasifs, ainsi que de détresse cardio-respiratoire et hypothermie lors de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des travaux pratiques pour l’apprentissage complémentaire de gestes techniques post-mortem.
Remplacement
Diverses méthodes sont mises en œuvre au cours des formations pour remplacer l’animal. Ainsi, pour les formations initiales, la méthode d’identification par poinçon auriculaire est enseignée sur des morceaux de papier, et des peluches sont utilisées pour les démonstrations et premiers gestes de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. Pour la formation complémentaire à la chirurgie, des substituts synthétiques ou des pièces de boucherie ainsi que des cadavres de rongeurs sont utilisés pour les premiers gestes de suture et chirurgie. Néanmoins, l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants et vascularisés ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables. Le ministère impose d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour la partie pratique de l’enseignement dans les formations en expérimentation animale. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas totalement envisageable pour ces travaux pratiques.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser 1800 animaux maximum au total sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé à partir d’une estimation du nombre maximum de formations annuelles : 3 sessions de formations initiales et 3 sessions de formation chirurgie, avec un maximum de 30 participants par session. A chaque session, 2 animaux par participant seront utilisés, afin de permettre l’ensemble des apprentissages pratiques. Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus de l’élevage de l’établissement, destinés à l’euthanasie. Si de tels animaux venaient à ne pas être disponibles dans l’établissement, des animaux de réforme d’élevage seront commandés auprès de fournisseurs agréés. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes aux standards réglementaires, avec un enrichissement adapté, eau et alimentation à volonté, et conditions environnementales contrôlées. En termes de raffinement pour les formations initiales, nous limitons au maximum le stress des animaux en amenant les animaux dans la salle au moins 1h avant le début de la séance et en commençant les travaux pratiques par une approche douce : en présentant, un à un, leur main dans la cage des animaux, les stagiaires prennent le temps nécessaire pour maîtriser leur propre appréhension et habituer les animaux à leur présence. Pour la préhension de l’animal, les méthodes utilisées sont parmi les moins stressantes pour l’animal. Les gestes techniques (administration et prélèvement sanguin) ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Le produit utilisé pour les administrations/injections est du sérum physiologique stérile avec un volume limité. Le volume de sang prélevé est également limité, de même que le nombre de gestes techniques appliqués à chaque animal : chaque animal fait l’objet au maximum de 2 administrations et d’un prélèvement sanguin. Pour la formation à la chirurgie, les souris sont anesthésiées et reçoivent, afin de limiter toute douleur per-opératoire et de raffiner au mieux la technique, un analgésique morphinique dès l’induction de l’anesthésie. Sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale. Pour éviter toute hypothermie, des tapis chauffants sont utilisés et les techniques enseignées visent à la manipulation atraumatique et aseptique des tissus. L’ensemble de la chirurgie est réalisé de façon aseptique, avec des instruments, des consommables et des gants stériles, après désinfection du site opératoire. Enfin, les encadrants veillent tout au long des séances de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, ils sensibilisent en continu les stagiaires au raffinement des techniques et sont particulièrement attentifs à tout signe de douleur. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant appliquera les points limites.
Choix des espèces
Les animaux utilisés pour ces formations sont des souris, car les formations initiales sont spécifiquement destinées aux personnes travaillant avec le groupe d’espèce « rongeurs et lagomorphes » et la souris est l'espèce la plus utilisée à des fins scientifiques. Pour la chirurgie, la formation n’est pas spécifique d’un groupe d’espèce, mais les souris étant les animaux les plus utilisés en recherche, l’enseignement les cible plus particulièrement. Les lignées utilisées sont non transgéniques.Les animaux sont préférentiellement des animaux de réforme de l’établissement (surplus d’élevage voués à l’euthanasie). L’achat d’animaux n’est réalisé qu’en seconde intention en cas de non-disponibilité d’animaux de réforme. Les animaux sont au stade adulte, entre 2 mois et 1 an. Ils ont ainsi les particularités anatomiques représentatives de l’espèce.
Formation réglementaire pratique aux bases fondamentales de la chirurgie chez les rongeurs : en utilisant l’ovariectomie comme modèle chirurgical
- Formation professionnelle
Rats : 84
Tués à l'issue de l'opération parce que la chirurgie d'entraînement retire des organes, 756 souris et 84 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections en état de veille, puis subit une ovariectomie sous anesthésie pouvant durer 45 minutes, avec un risque d'hémorragie que le porteur qualifie de très rare. L'opération ne produit aucune connaissance : elle sert à faire apprendre l'asepsie, l'anesthésie, l'analgésie et les sutures sur un animal vivant, un animal par stagiaire. Le porteur rappelle que ces gestes relèvent d'une obligation réglementaire de formation, jusqu'à quatre sessions par an et 40 participants par session.
Objectifs
Les personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales sur des animaux dans le cadre de projets scientifiques, ont l’obligation réglementaire de suivre un enseignement théorique et pratique à la chirurgie expérimentale. Le projet concerne les travaux pratiques d’une formation aux bases de la chirurgie expérimentale à destination de ces personnes. Chaque session de formation totale dure 22h. Au cours de celle-ci, les participants sont préalablement sensibilisés à tous les aspects théoriques à l’occasion de cours et travaux dirigés. La formation pratique vise en particulier, sur un exemple pratique de chirurgie réalisée chez le rongeur, 1/ à leur dispenser les moyens de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux lors de procédures chirurgicales, 2/ à acquérir la maitrise des gestes nécessaires au bon déroulement d’une intervention chirurgicale réalisée dans le respect du bien-être animal. Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux).
Bénéfices attendus
Chaque participant recevra ainsi une formation pratique pour mener à bien une intervention chirurgicale prenant en compte le respect du bien-être animal. La qualité de ces formations contribue ainsi à court terme à la maitrise des gestes chirurgicaux permettant d’obtenir à moyen terme des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Souris et/ou rates : Deux injections (anesthésiques et analgésiques) de 10 secondes, une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie d’une durée maximale de 45 minutes.
Impact sur les animaux
Chaque animal recevra en vigile deux injections de 10 secondes. Ces gestes peuvent induire un stress/et ou une douleur légère de très courte durée chez les animaux. Il subira ensuite une intervention chirurgicale (ovariectomie) réalisée sous anesthésie chimique, d’une durée totale de 45 minutes au maximum pouvant générer une douleur modérée pendant l’opération. L’animal peut être victime d’une hémorragie en cas d’une hémostase insuffisante (très rare).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure chirurgicale car la chirurgie réalisée en entraînement implique l’exérèse d’organes.
Remplacement
Si l’apprentissage des gestes chirurgicaux peut démarrer sur des modèles inertes, la bonne maitrise des gestes associés à une procédure chirurgicale en conditions réelles (surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal) nécessite cependant dans l’état actuel des connaissances un entrainement pratique sur modèle animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés, et grâce à l’entrainement préalable que les participants recevront en amont, un seul animal par participant permettra la réalisation d’une chirurgie complète (rat ou souris). En effet, le passage à la chirurgie pratique ne sera pas réalisé tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé, diminuant ainsi le risque d’échecs et l’utilisation d’animaux supplémentaires. Au maximum, 4 sessions de cette formation réglementaire seront réalisées par an dans cet établissement et le nombre de stagiaires par session de formation est limité à 40 participants, participant également ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont gardés en groupes sociaux de plusieurs individus dans un environnement enrichi dans une salle d’hébergement à part et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment afin de réduire au maximum le stress des animaux. Un analgésique est administré 30 min avant le début de la procédure chirurgicale en quantité suffisante pour limiter toute douleur per- opératoire, sa durée d’action couvrant la totalité de la procédure chirurgicale. L’intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale conformément aux bonnes pratiques de narcose, myorelaxation et analgésie. Pendant la procédure chirurgicale, des points limites précoces et adaptés permettront de détecter tout signe de souffrance des animaux et de prendre les mesures correctives adéquates. Pendant la phase de réveil de 30 min, l’animal est placé sur un tapis chauffant dans une cage et sous surveillance renforcée permettant de détecter précocément tout signe de souffrance
Choix des espèces
Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche, ces travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est fait en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation, et des besoins pédagogiques exprimés par les participants. Les rongeurs utilisés sont des jeunes adultes âgés de 8 à 12 semaines, présentant une maturité anatomique et physiologique adaptée à l’apprentissage des gestes chirurgicaux. Ce choix permet d’obtenir des conditions opératoires représentatives tout en respectant le bien-être animal et les principes des 3R
Mise en place d’un modèle expérimental sur les chauves-souris à des fins de formation et de recherche
- Formation professionnelle
Chauves-souris frugivores du genre Pteropus, réservoirs naturels de virus émergents, 15 individus sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune mise à mort n'est comptée, les 15 étant déclarées réutilisables, et le porteur indique que la plupart seront gardées en vie après avis du vétérinaire et de la structure de bien-être animal. Chaque séance comprend deux à huit répétitions du même geste sur la même chauve-souris, injections sous-cutanées, intramusculaires ou intraveineuses, pose de cathéter et prises de sang, sous anesthésie générale d'au plus une heure ou sous anesthésie locale sur animal vigile, avec sept à quinze jours de repos entre deux séances. La finalité déclarée est la formation du personnel de l'établissement, et le porteur affirme qu'aucune alternative ne reproduit les conditions réelles de manipulation d'une chauve-souris.
Objectifs
Notre laboratoire est impliqué dans un projet global d'étude des maladies émergentes tropicales d'origine virale dont plusieurs ont pour réservoir des chauve-souris frugivores du genre Pteropus. Notre rôle est de maintenir en laboratoire, dans les meilleures conditions, des spécimens de ces espèces, et de réaliser des suivis cliniques ainsi que des prélèvements de sang sous anesthésie. La connaissance de la biologie, de l'élevage et des constantes normales de ces espèces est fondamentale pour la suite du projet. Nous devons donc, dans un premier temps, au contact d'un vétérinaire expert, former toute une équipe à l'élevage, à la manipulation et aux procédures de bases de notre laboratoire, déjà très performante dans le travail avec d'autres espèces animales. Les prélèvements réalisés au cours de cette phase d'apprentissage seront analysés et contribueront à l'amélioration des connaissances de base en hématologie et biochimie de ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place l’hébergement et les procédures expérimentales sur les chauves-souris, récemment ajoutées à l’agrément de l’établissement. Il a pour but de former le personnel aux gestes techniques de base (manipulation, anesthésie, prélèvements, contention, etc.) et de favoriser la familiarisation avec cette nouvelle espèce. Ces formations contribueront à améliorer la qualité des futures études avec une meilleure maîtrise des techniques et une réduction du stress et de la douleur pour les animaux. Elles permettront également d’assurer des conditions de travail sécurisées pour le personnel et de renforcer les compétences internes de la plateforme. À terme, ce projet doit permettre de disposer d’un modèle expérimental fiable et d’un personnel formé, conditions necessaires pour la mise en œuvre des futures études en virologie.
Procédures
Trois essais de gestes techniques différents pourront être réalisés : une administration sous-cutanée, une administration intramusculaire ou intraveineuse (ou la pose d’un cathéter). Ces actes pourront être effectués sous anesthésie générale ou sur animal vigile après application d’une anesthésie locale. Le nombre de ponctions sera limité à deux par site au maximum, afin de réduire toute gêne ou irritation locale. La durée totale d’anesthésie ne dépassera pas une heure, incluant la phase de réveil et la surveillance post-anesthésique. La durée totale ne dépassera pas 5 à 10 minutes pour les gestes effectués sans anesthésie — les manipulations seront progressives et leur durée augmentera graduellement, sans toutefois excéder 10 minutes. Sous anesthésie, la durée maximale sera d’une heure. Un minimum de 7 jours de repos sera appliqué entre les sessions.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont limitées. Elles concernent principalement le stress lié à la manipulation et à la familiarisation avec un nouvel environnement. Certaines formations pratiques pourront entraîner un stress transitoire ou un léger inconfort, notamment lors de la contention, de l’anesthésie ou de la réalisation de prélèvements sanguins.
Devenir
Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives et n’entraînent ni douleur significative ni altération durable de l’intégrité ou du bien-être de l’animal. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est rendue nécessaire pour cette phase de formation et d’acquisition des gestes techniques. Aucune alternative ne permet actuellement de reproduire les conditions réelles de manipulation, d’anesthésie ou de prélèvements sur des chauves-souris, dont la morphologie et le comportement diffèrent des autres espèces déjà étudiées. Des supports théoriques et audiovisuels (présentations, vidéos, photos) seront utilisés en amont pour limiter le nombre d’animaux impliqués et préparer au mieux le personnel avant toute manipulation pratique. Lorsque cela est possible, des modèles inertes (matériel de simulation, animaux décédés issus d’autres protocoles) pourront être utilisés pour les démonstrations initiales. Les séances pratiques sur animaux vivants seront donc réduites au strict nécessaire, et réalisées uniquement dans le cadre de la formation du personnel devant intervenir ultérieurement sur cette espèce.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour assurer la formation pratique du personnel et la mise au point des procédures expérimentales. Chaque séance de formation sera organisée de manière à maximiser l’apprentissage tout en réduisant le nombre d’animaux manipulés, en regroupant plusieurs apprentissages sur les mêmes individus lorsque cela est compatible avec leur bien-être. Les animaux ne seront utilisés qu’une seule fois par jour, avec des périodes de repos suffisantes entre les séances.
Raffinement
Les techniques utilisées sont les mêmes que celles que nous mettons en oeuvre pour nos projets. Trois principales mesures de raffinement sont utilisées. La première est la limitation du nombre d’actes par animal et par séances. Deux à huit répétitions de geste par animal et par séance (comme la prise de sang par exemple). Les volumes administrés ou prélevés sont minimes (< 1 ml). Largement inférieurs aux recommandations d’usage en recherche, puisque ce qui compte est que le geste soit bien réalisé. L’autre est un enregistrement précis des utilisations et réutilisations de chaque animal en respectant un temps de repos de 7 jours entre deux séances sans anesthésie et 15 jours entre deux séances avec anesthésie. Toute blessure au cours de la séance est prise en charge et prolonge le temps de repos de l’animal. De plus, les conditions hébergement des animaux seront adaptées à l'espèce, ainsi que leurs soins quotidiens. Seuls les animaux en bonne santé participent à ces séances de formation. Les séances sont interrompues si les animaux montrent un signe de mal-être ou de stress trop important. Des critères d'arrêt anticipé, très précoce sont mis en place pour éviter dee solliciter un animal qui n'est pas en parfaite santé et de les soigner au moindre signe de mal-être. Un programme de conditionnement avec des friandises adaptées sera mis en place. Enfin, la troisième mesure de raffinement repose sur la formation du personnel, qui sera assurée par le vétérinaire désigné, déjà formé dans la gestion et les soins des chauves-souris.
Choix des espèces
Chauves souris constituent des modèles d’intérêt majeur en virologie, en raison de leur rôle reconnu comme réservoirs naturels de nombreux virus, et de leur tolérance particulière aux infections virales. Les animaux utilisés seront des chauves-souris adultes.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du cancer de foie pédiatrique grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une injection sous pression de plasmides dans la veine de la queue déclenche la formation de tumeurs du foie chez 890 souris, dont 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Les animaux reçoivent ensuite des anticancéreux à l'état vigile, jusqu'à une fois par jour pendant quinze à trente jours, avec une séance d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie gazeuse. L'objet est d'identifier les gènes qui déclenchent le cancer du foie pédiatrique et de tester jusqu'à dix candidats-médicaments en cinq ans. Le porteur écrit qu'aucun signe de souffrance n'est détecté chez ces souris passé la demi-heure qui suit l'injection, alors que 600 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) et notamment le cancer pédiatrique (hépatoblastome) sont des pathologies complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance aux traitements. A ce jour le seul traitement pour l’hépatoblastome est la chimiothérapie avec une efficacité limitée et des effets secondaires et une toxicité non-négligeable. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du cancer du foie pédiatrique. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en cancer du foie, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en exprimant dans les cellules du foie les différents gènes d’intérêt. Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs pédiatriques dans un foie sain et d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques pédiatriques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population pédiatrique atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire la mortalité et morbidité de ce cancer. Nous prévoyons de faire un maximum de 2 études de nouveaux candidats par an, soit 10 nouveaux candidats médicaments sur 5 ans.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides (qui véhiculent nos gènes d’intérêt) dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées en état vigile, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine) pour une durée approximative d’entre 15 et 30 jours. Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique d’injection est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. Les nuisances attendues sont : 1) Nuisance globale de l'expérience d'injection qui n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Au-delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial du développement de la tumeur, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux ; 2) l’administration d’agents médicamenteux pourrait entraîner une douleur légère pendant quelques secondes au moment de l’injection. ; 3) Formation et évolution des tumeurs pourrait entrainer des malaises pour la souris, d’où l’importance d’un suivi quotidien avec une grille de score qui tient compte des différents signes de souffrance pour y remédier; 4) Injection du réactif pour imagerie, peut induire une doleur légère temporaire au cours de l’administration ; 5) Anesthésie volatile pour les techniques d'imagerie. Un petit groupe de souris sera concerné para les nuisances liées à la biopsie pour le génotypage : douleur temporelle de quelques secondes pendant le prélèvement sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Dans cette étude, quand possible nous utiliserons l’imagerie in vivo (échographe) similaires aux appareils utilisés chez les patients, mais adaptés à la taille de notre modèle rongeurs. Ces imageries nous permettent de suivre l’évolution des animaux, en particulier la croissance tumorale, sur plusieurs semaines et de réaliser plusieurs types de mesures, ce qui nous permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats utilisables. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé au maximum tout assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé qu'un effectif maximum de 10 animaux par groupe serait suffisant pour les expérimentations d’efficacité et 6 animaux par groupe pour les expériences de toxicité. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. De plus, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses post-mortem sur les tissus récupérés (foie, tumeurs, poumons, rate, sang, moelle osseuse). En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Nous envisageons de mutualiser des groupes contrôles pour les différents tests, lorsque ce sera possible. Par exemple : 1) le groupe "plasmide contrôle" dans le cas où le même vecteur est injecté, 2) dans le cas d'injection
Raffinement
L'état de santé des souris sera quotidiennement surveillé ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de garantir le bien-être chez l’animal. La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie au cours du temps par imagerie non invasive. En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés. Tout signe et/ou comportement anormal sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent l’animal sera sorti du protocole. Les conditions d’hébergement classiques seront enrichies en alternance par afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches utilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade jeune (moins de 2 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus pédiatriques, pour récapituler le contexte de l’hépatoblastome.