Tests réglementaires

Un tube gastro-œsophagien introduit trois fois pour prélever du suc gastrique, avant le test puis à trente et soixante minutes, et une administration de pentagastrine pour faire sécréter l'estomac : 40 chiens adultes sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous sont gardés en vie. L'opération est répétée après au moins quatre jours de repos, pour vérifier que les mesures de pH sont reproductibles. Il s'agit de repérer les individus qui répondent à la pentagastrine, afin de les inclure dans de futures études de pharmacocinétique où l'absorption dépend du pH de l'estomac. Cet avenant augmente l'effectif "suite à une demande accrue d'études", et le porteur écrit qu'il n'y a pas eu d'approche statistique pour fixer ce nombre de 40 chiens.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir identifier des animaux qui répondent à la pentagastrine. La pentagastrine a pour effet d'entrainer la sécrétion gastrique. Cela permettra donc de vérifier l'acidité du pH gastrique chez les chiens et de limiter les variations inter individuelles également. Le pH gastrique a un rôle majeur au niveau de l'absorption des principes actifs dans les études de pharmacocinétiques. Ce projet est un avenant au projet autorisé dont l'objectif est d'augmenter le nombre d'animaux suite à une demande accrue d'études.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir vérifier que les animaux répondent bien à l'injection de pentagastrine. Cela permettra de vérifier l'acidité de l'estomac avant l'administration d'un élément d'essai. Ce projet permettra de s'assurer que les animaux sélectionnés pour de prochaines études seront dans de bonnes conditions pour pouvoir évaluer des paramètres physico chimiques des éléments testés dans le but de générer de nouveaux médicaments.

Procédures

Dans ce projet, il y aura des prélèvements de suc gastrique pour mesurer le pH du contenu de l'estomac. Pour cela, le suc gastrique sera prélevé via l'utilisation d'un tube gastro oesophagial. Il y aura 3 prélèvements ( avant le début du test puis à 30 et 60 min). La durée d'un prélèvement est de l'ordre de la minute. Les animaux auront aussi une administration d'une solution de pentagastrine. Le volume administré sera de 0.08 mL/kg. La durée de l'administration: inférieure à la minute. Ces mesures de pH seront réalisées deux fois pour vérifier que les résultats sont bien reproductibles. Une période de repos d'au minimum 4 jours sera respectée entre les 2 périodes.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques réalisés dans ce projet seront: - gavage ( voie orale): cela peut engendrer du stress lié à la contention - administration intramusculaire: cela peut également engendrer du stress lié à la contention, et peut être une gêne musculaire juste aprés administration.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

La réponse à la pentagastrine est individu dépendante. Il est necessaire dans ce projet de sélectionner les animaux qui répondront favorablement à l'effet de la pentagastrine en vu de réaliser de prochaines études pour lesquelles les éléments d'essai seront dépendant du pH gastrique. Les approches in vitro permettent de mimer la dissolution d'un élément test à un certain pH mais cela ne permet pas de voir les phases absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination. Il est donc indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble.

Réduction

Des groupes de 3 à 6 animaux par élément d'essai testé seront généralement prévus. Ce projet est un avenant au projet autorisé dont l'objectif est d'augmenter le nombre d'animaux suite à une demande accrue d'études. Sur une durée de 5 ans nous prévoyons de valider la réponse à la pentagastine sur 40 animaux soit environ 16 animaux tous les 2 ans . Six animaux sont nécessaire pour la réalisation d'une étude soit 12 animaux sont necessaire pour assurer un roulement entre les animaux avec une periode de repos suffisante d'au minimum 7 jours. Il n'y a pas eu d'approche statistique. C'est le nombre d'animaux minimal requis pour avoir un nombre animaux suffisant pour être inclus dans de futures études.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation et durant le test , les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Un suivi quotidien sera mis en place pour l'observation générale des animaux. Le jour du test les animaux seront observés plusieurs fois par jour. Si de la douleur est ressenti au cours du test, possibilité d'utiliser des analgésiques. Cette décision sera prise par le vétérinaire désigné. De l'enrichissement ( exemple: balle, corde, cachette, fond musical ) sera présent autant que possible dans les hébergements. Dans ce projet les points limites sont: - Des vomissements qui seraient liés à la technique de gavage ou qui suivrait l'injection de pentagastrine - Des douleurs au moment de l'administration de la solution de pentagastrine - Des douleurs au moment de la réalisation des gavages pour le prélèvement de suc gastrique Si les vomissements sont trés fréquents et important, si la douleur est également bien présente alors cela sera considéré comme un critère d'arrêt.

Choix des espèces

Espèce de choix pour valider ce type de réponse. Le chien est une espèce facile à manipuler. Données bibliographiques disponibles sur cette espèce. Espèce qui sera demandée dans les futures études. Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet.

Environ 10 % des animaux n'ayant pas suivi la procédure entière seront gardés en vie et réutilisés ailleurs, tous les autres seront tués pour analyse des yeux. 1 600 souris, 1 600 rats et 1 600 lapins vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, pour installer une rétinopathie diabétique par injection de produits de glycation. Selon les cas, l'injection se fait dans l'abdomen, dans la veine ou directement dans l'œil, avec jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des examens ophtalmologiques hebdomadaires sous anesthésie légère. Le porteur écrit que les maladies de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'être humain et transpose cette conclusion à l'animal, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité.

Objectifs

La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. L'objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de rétinopathie diabétique afin de tester des traitements potentiels qui pourraient améliorer la pris en charge de cette pathologie. Une étape clé dans l’installation de cette maladie et la détérioration des parois des capillaires sanguins de la rétine. Les capillaires sanguins perdent leur étanchéité ce qui induit une augmentation de la perméabilité vasculaire et une rupture de la barrière hématorétinienne, des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine et altèrent son fonctionnement neuronal. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine essentielle pour la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. L'excès de sucre dans le sang (l’hyperglicémie) génère des produits dérivés appelés les produits avancés de glycation : les AGEs. Ces AGEs sont impliqués dans le développement des complications du diabète. Une stratégie pour reproduire l’atteinte vasculaire de la rétinopathie diabétique consiste en l’injection de AGEs exogènes chez les rongeurs et le lapin. Selon les protocoles disponibles dans les publications scientifiques, l’injection peut se faire par différentes voies : injection intra veineuse, intra vitréenne, intrapéritonéale. Dans un premier temps nous souhaitons induire le modèle par injection intrapéritonéale de AGEs chez les rongeurs, en cas d'échec, s'il n'y a pas eu d'induction et que les signes cliniques ne sont pas présents, les injections intraveineuses seront envisagées ou encore l'injection intravitréenne (à l'intérieur de l'œil) chez les 3 espèces. Les durées des études peuvent être différentes selon le mode d'administration : 1 à 2 semaines pour les injections quotidiennes intrapéritonéales et intraveineuses et quelques heures à quelques jours pour les injections uniques intravitréennes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements agissants sur la composante vasculaire de la rétinopathie ou neuroprotecteurs de la rétine chez les diabétiques.

Procédures

Le déclenchement du modèle est dû à une injection par piqûre intrapéritonéale, ou intraveineuse ou une injection intravitréenne, un seul mode d'induction par animal. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine sur maximum deux semaines. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt (durée de moins d'une minute pour le prélèvement). De manière générale, les études auront une durée variable qui pourra aller d'1 jour à deux semaines.

Impact sur les animaux

Les maladies vasculaires ou neurodégénératives de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux intéractions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animaux en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Réformés de la compétition ou de l'élevage et destinés à la boucherie, 100 chevaux vont être hyperimmunisés contre des agents infectieux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit des injections d'antigènes toutes les trois à quatre semaines pendant environ douze mois, puis est saigné trois fois par semaine, jusqu'à 1 % de son poids vif par prélèvement, sur dix à douze mois. Quand leur hématocrite descend sous un seuil fixé avec le vétérinaire, leurs globules rouges leur sont réinjectés pour que les saignées continuent. Soixante-dix sont annoncés comme réutilisés et trente comme replacés, ceux qui ne peuvent l'être étant mis à mort, et le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace aujourd'hui cette production à l'échelle "industrielle".

Objectifs

Le nombre croissant de maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, la mondialisation et la propagation rapide des épidémies, l'absence de traitements et/ou de vaccinations satisfaisants, le développement des menaces liées au bioterrorisme et l'augmentation de la résistance aux antimicrobiens ont conduit à une augmentation significative des risques de menaces biologiques. Le développement, l'accès et le déploiement rapides de contre-mesures médicales adéquates sont essentiels pour anticiper de telles urgences de santé publique, et constituent des enjeux nationaux et internationaux critiques pour la mise à disposition de thérapeutiques efficaces. Le projet vise à développer et à produire des traitements contre des maladies infectieuses émergentes (par exemple COVID-19, grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF)). L’objectif de ce projet est de produire, à partir de chevaux hyperimmunisés, des plasmas qui sont ensuite utilisés pour la fabrication pharmaceutique d’anticorps polyclonaux purifiés. Les anticorps de ce projet seront induits contre différents types d’antigènes spécifiques (protéines virales et/ou toxines (bactériennes, animales ou végétales) et/ou bactériennes).

Bénéfices attendus

Les fragments d’anticorps hautement purifiés (fragments F(ab’)2 apportent une solution thérapeutique sûre à des problématiques majeures de santé publique pour lesquelles il n’existe pas d’autre solution. Le projet vise plus particulièrement à développer des produits destinés au domaine de la bio-défense au sens large, mais aussi des thérapeutiques pour le traitement des maladies infectieuses émergentes. Ce projet nécessitera l’utilisation de 100 chevaux sur 5 ans. Ces chevaux permettront globalement de produire des plasmas qui donneront in fine l’équivalent de 135000 à 215000 traitements individuels contre les risques bio-défense et les maladies infectieuses. La production de plasma par cheval étant assez importante, une partie de ces plasmas sera utilisée pour la mise au point de développement de nouvelles thérapies (développement pré-clinique et clinique avec essais chez l'Homme). Une autre partie constituera une banque de plasmas pour répondre à des besoins de stocks stratégiques.

Procédures

Deux ensembles de gestes techniques sont effectués chez tous les chevaux du projet. Tous les gestes techniques sont réalisés sur le cheval vigile : → Gestes associés à la technique d’hyperimmunisation: des injections de petits volumes sont effectuées par voie intra-dermique ou sous-cutanée et intra-musculaire toutes les 3 à 4 semaines en moyenne pendant environ 12 mois. La durée de l’injection est de 2 à 10 secondes par animal. → Gestes associés aux prélèvements de sang pour la production des plasmas: • des prélèvements de sang (1% du poids vif maximum) par voie veineuse (à la veine jugulaire) d’une durée de 10 minutes par animal sont réalisés 3 fois par semaines toutes les 3 à 4 semaines sur une période moyenne de 10 à 12 mois une fois que le titre d’anticorps spécifique a atteint le plateau maximum. • Si l’hématocrite du cheval prélevé a atteint un seuil bas prédéfini avec le vétérinaire désigné, il y a ré-administration des globules rouges par voie intraveineuse d’une durée de 20 minutes par animal (technique de « plasmaphérèse ») au maximum 3 fois par semaines toutes les 3 à 4 semaines sur une période moyenne de 10 à 12 mois.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d’effet indésirable attendu associé aux administrations des antigènes car les chevaux utilisés pour le projet suivent un parcours d’habituation avant d’être intégrés dans une procédure d’hyperimmunisation. Une nuisance potentielle attendue, mais rare en pratique, est la baisse d’hématocrite consécutive à la répétition dans le temps des prélèvements sanguins de volumes importants, qui ne dépassent cependant pas les normes réglementaires pour le bien-être animal (1% du poids au maximum).

Devenir

En fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être replacés après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

Compte tenu de la variabilité biologique (plusieurs types ou plusieurs variants) des cibles, il est essentiel que les thérapeutiques développées dans le cadre de ce projet aient des efficacités de neutralisation indépendantes des types ou des variants. Cet objectif ne peut être atteint que par la production d’anticorps polyclonaux spécifiques provenant de plusieurs chevaux (synergie d’une réponse polyclonale naturelle avec le mélange de différentes réponses polyclonales individuelles = « polyclonalité polyvalente »). La production en grand volume d’anticorps polyclonaux pour de tels produits pharmaceutiques n’est possible que par l’hyperimmunisation d’animaux de grande taille : bovins ou chevaux. Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue pour remplacer industriellement la production d’anticorps polyclonaux avec des titres élevés. Un mélange de plusieurs monoclonaux ne peut remplacer aujourd’hui la « polyclonalité polyvalente » recherchée car cela supposerait la production simultanée de plusieurs dizaines d’anticorps monoclonaux différents.

Réduction

Ce projet inclut plusieurs éléments visant à réduire le nombre de chevaux nécessaires pour chaque cible thérapeutique du projet : • Utilisation d’adjuvants commerciaux permettant une présentation plus efficace de l’antigène et favorisant la mémoire immunitaire, se traduisant par des titres spécifiques élevés. • Utilisation d’un calendrier d’injections optimisant le niveau moyen des titres d’anticorps spécifiques et maintenant le plateau de production d’anticorps le plus longtemps possible • Impact des titres élevés d’anticorps permettant d’augmenter le rendement de purification et donc de réduire indirectement le nombre de chevaux nécessaires à la production des lots de produit thérapeutique. • Le nombre de chevaux utilisés pour un projet est calculé au plus juste selon l’avancée du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Pour chaque nouvelle indication du projet : 2 à 4 animaux seront immunisés afin de tester et déterminer l’efficacité de l’immunisation. Après cette étape pilote, le volume de plasma nécessaire pour la production des lots thérapeutiques sera calculé précisément. Ce volume permettra de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble du développement de chaque produit du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés dans des box en groupes sociaux de maximum 12 chevaux fixes dans le temps présentant une aire paillée et une aire d’exercice ouvertes sur l’extérieur. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire qui assure par ailleurs un suivi régulier. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Les contacts répétés avec l’homme contribuent à l’enrichissement. De multiples essais d’accessoires variés n’ont pas été concluants. Ce projet met en œuvre des procédures maîtrisées qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines. Une amélioration notable par rapport aux projets autorisés précédemment depuis 2017 est l’utilisation d’adjuvants très bien tolérés chez le cheval. Des procédures optimisées sont en place pour l’habituation des chevaux aux injections et aux prélèvements de sang pour réduire le stress lors des opérations de production. Des points limites sont définis.

Choix des espèces

Le cheval est une espèce animale qui produit en général des titres élevés d’anticorps et qui permet, compte tenu de sa grande taille, de récolter une quantité importante de plasma (respectant pour chaque prélèvement un maximum de 1% du poids vif). Il présente très peu de risques zoonotiques, ce qui limite fortement les problématiques de biosécurité virale dans les plasmas. Les chevaux utilisés pour ce projet sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’anticorps spécifiques est optimale. Ce sont des animaux de réforme (capacité compétition, infertilité…) destinés initialement à la boucherie.

Le cheval étant l'espèce visée par le vaccin en développement, sept chevaux adultes appartenant à l'établissement vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent trois injections sous-cutanées dans l'encolure sur quatre mois, puis subissent vingt-trois examens cliniques et échographiques et dix-sept prises de sang à la jugulaire étalées sur un an, sans sédation, tenus par un simple licol. Le produit, un vaccin ciblant l'interleukine-6 pour prévenir l'arthrose, a déjà été testé sur des souris et des lapins, et vient de passer un essai de phase I chez l'être humain sans effet indésirable rapporté, ce que le porteur juge insuffisant au motif que le cheval est une espèce "particulièrement réactive". Aucun des sept n'est tué : ils restent la propriété de l'établissement, vivent au pré avec leurs congénères et sont comptés comme réutilisables.

Objectifs

L’arthrose est une affection dominante chez le cheval. C’est en effet la principale cause de boiterie, et de baisse de performance ou d’arrêt de carrière des chevaux de course et de sport. D’autre part, chez le cheval on estime que 50 % des sujets de plus de 15 ans présentent des lésions d’arthrose. Cette affection a donc un impact majeur sur le bien-être des animaux. Actuellement la prise en charge de l’arthrose chez le cheval se fait principalement par des soins locaux par injections intraarticulaires (à base de stéroïdes, de thérapie biologiques ou cellulaires), et/ou par l’administration d’antiinflammatoires non stéroïdiens (AINS) par voie systémique. Une des limites de la thérapie locale est la difficulté de mise en place de ce traitement sur un cheval avec des lésions multiples. De plus l’emploi réitérés des antiinflammatoires stéroïdiens par voie intra-articulaire est reconnu comme favorisant la dégénérescence cartilagineuse. Quant aux thérapies biologiques ou cellulaires, leur coût, limite leur utilisation à un nombre réduit d’articulations. Enfin concernant l’emploi des AINS, leur administration au long cours n'est pas possible du fait des effets secondaires observés (ulcères gastriques, risque d’insuffisance rénale) et leur action est uniquement symptomatique. Les moyens permettant une prise en charge des lésions d’arthrose particulièrement lorsqu’elles sont multiples et sur le long cours restent donc limités. Dans ce contexte une société a adapté son vaccin ciblant l’IL-6 chez l’homme pour élaborer un produit spécifique au cheval. Le conjugué équin ainsi obtenu a été testé sur des souris et des lapins et une production d’anticorps anti-IL-6 équine (eIL-6) a été observée. Les résultats avec le conjugué équin étant très satisfaisants chez la souris et le lapin, les objectifs de ce projet sont dans un premier temps de confirmer sa tolérance chez le cheval, d’évaluer son immunogénicité sur cette espèce et de déterminer la dose optimale de conjugué à injecter. A plus long terme, l’objectif est de pouvoir obtenir une alternative thérapeutique pour la prise en charge de l’arthrose au long cours chez le cheval avec le développement d’un vaccin.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à terme est le développement d’une nouvelle thérapie, sous la forme d’un vaccin, pour lutter contre l’arthrose chez le cheval. Cette étude constitue une première étape de ce développement qui va permettre de valider la bonne tolérance et fonctionnalité de ce vaccin en évaluant la réponse immunitaire des chevaux injectés en contrôlant la production d’anticorps anti-IL 6 leur permettant de développer une action anti-inflammatoire propre. Cet effet anti-inflammatoire sera alors évalué pour la prise en charge de l’inflammation chronique du phénomène arthrosique grâce à un essai clinique versus placebo sur un effectif de chevaux atteints d’arthrose. Actuellement les thérapies les plus communément utilisées sont des injections intra-articulaires, soit à base de stéroïdes ou de thérapie biologique (à base de sérum autologue, ou chimique comme le gel polyacrylamide) ou cellulaire (à base de cellules souches mésenchymateuses). La limite des stéroïdes est qu’ils ne peuvent être utilisés de façon réitérée au risque d’avoir un effet délétère sur le cartilage articulaire. Quant aux thérapies biologiques leur coût, et la nécessité de répéter les injections ne permet pas de traiter à long terme un cheval avec plusieurs articulations affectées, ce qui est fréquent notamment sur les sujets âgés, pour lesquels l’arthrose touche 50% d’entre eux. Par ailleurs les traitements systémiques les plus utilisés reste les antiinflammatoires non stéroïdiens qui présentent des effets secondaires notables lors d’administration prolongée (ulcères gastriques risque d’insuffisance rénale). Dans ce contexte le vaccin évalué, représenterait une excellente alternative thérapeutique pour une prise en charge de l’arthrose au long cours chez le cheval.

Procédures

- Des vaccins (piqure sous cutanée) seront réalisés à trois reprises sur les chevaux dans l'encolure : le premier jour, un mois plus tard et quatre mois plus tard. Chaque injection dure 1 à 2 secondes sur animal vigile, non sédaté et sans contention autre qu’un licol, celles-ci étant bien tolérées chez le cheval. - Des examens cliniques généraux (examen physique et dynamique, appétit, transit intestinal, auscultation cardiaque, respiratoire et prise de température) et des examens échographiques de chaque côté de l’encolure au niveau des sites d’injection seront réalisés à 23 reprises sur chaque cheval de l’étude durant sa durée (1 an). Il s'agit plus précisemment des jours J-10, 1, 3, 7, 14, 21, 28, 29, 31, 35, 42, 49, 56, 84, 112, 113, 115, 119, 126, 133, 140, 168 et 336. Chaque examen dure environ 10 minutes, il est réalisé sur animal vigile, non sédaté et sans contention autre qu’un licol. - Des prises de sang à la veine jugulaire de 10 mL à 30mL seront réalisées aux jours J-10, 1, 7, 28, 29, 35, 42, 56, 70, 112, 113 et 119, 126, 140, 154, 168 et 336 soit un total de 17 prélèvements pour réaliser les analyses sanguines sur le même prélèvement. Elles seront réalisées sur animaux vigiles non sédatés, ces actes étant très bien tolérés par les chevaux. Ces prélèvements sont très rapides, moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Lors d’essais de cette immunothérapie ciblant l’interleukine-6, réalisés sur d'autres espèces animales et l’Homme, aucun effet indésirable grave n’a été observé. Cependant, une induration au point d’injection du conjugué a été observée chez certains patients de façon transitoire. Par ailleurs, les contentions, et piqures cutanées dues à l’administration des doses de vaccin d’une part et les ponctions veineuses d’autre part, entrainent un stress d’une durée maximale de 15 minutes par jour de manipulation, comprenant la réalisation de l’examen clinique général, de l’échographie et d’une injection sous-cutanée et/ou prélèvement sanguin (le stress débute à l’entrée du cheval en salle d’examen et se termine lors de sa sortie). Néanmoins, ce stress est limité par le fait que les chevaux sont toujours manipulés par 2 et qu’ils sont habitués au personnel soignant, à la manipulation et à la réalisation d’échographies. Une brève douleur d’une seconde est ressentie au moment du passage de la peau par l’aiguille lors des administrations de vaccins et ponctions veineuses.

Devenir

Les 7 chevaux du protocole resteront dans l’Etablissement Utilisateur dont ils sont la propriété. Ils vivront au pré avec leurs congénères.

Remplacement

Nous souhaitons développer un vaccin qui, à terme, pourrait prévenir et limiter la progression de l’arthrose inflammatoire chez le cheval. Le modèle animal choisi ici constitue donc l’espèce cible de la thérapie. L’immunogénicité du vaccin et la capacité neutralisante des anticorps ont déjà été testés chez la souris et le lapin. La tolérance aux injections et la surveillance de survenue d’éventuels effets secondaires ont quant à eux déjà été évalués dans plusieurs espèces. De plus, la tolérance de la thérapie étudiée ici est déjà en cours de validation dans l’espèce humaine grâce à un essai clinique de phase I qui vient de se terminer et pour lequel aucun effet indésirable n’a été rapporté. Cependant, les résultats obtenus pourraient ne pas être transposables au cheval, puisqu’il existe des spécificités d’espèce et le cheval est une espèce particulièrement réactive. Il est donc nécessaire de réaliser une étude pilote pour obtenir une preuve de concept de la bonne tolérance et de l’immunogénicité de la thérapie dans l’espèce cible du produit à évaluer, avant d’envisager un essai clinique contrôlé et en aveugle sur des cas spontanés de chevaux souffrant d’arthrose.

Réduction

Le nombre de 3 chevaux par dose (10 μg et 50 μg), a été jugé être le nombre minimal pour lequel cette étude pilote permettra de conclure à une bonne tolérance et à une production systématique et suffisante d’anticorps, sans être due au hasard ou à l’individu, compte tenu des résultats déjà acquis dans les autres espèces dont l’homme. Aucune conclusion statistique ne sera réalisée dans cette étude pilote dont l’objectif est, en cas de résultats favorables pour chacun des 3 chevaux (absence d’effets indésirables aux injections et production d’un niveau satisfaisant d’anticorps) de poursuivre par le lancement d’un essai clinique. Il est important de noter que des doses plus élevées ont été testées dans d'autres espèces et n'ont montré aucun signe de toxicité. Par conséquent, nous nous attendons à une bonne tolérance, même à la dose "forte" (50 μg) de notre produit, sur les chevaux testés. Ainsi, en confirmant que les chevaux pilotes de la présente étude réagissent de la même manière que les autres espèces testées avec l’immunothérapie dont l'homme, la dose minimale (10 μg) sera selectionnée pour réaliser une étude d’efficacité de terrain contrôlée et en aveugle sur un effectif de chevaux dont le nombre sera évalué statistiquement. Cependant, si une tendance vers une différence de production d’anticorps était observée entre les deux lots, la dose la plus efficace en termes de génération d'anticorps neutralisants devra être validée dans une étude dédiée.

Raffinement

Les chevaux seront hébergés dans leur environnement naturel (pature avec abris) et en groupe avec leurs congénères. Les actes pratiqués sont tous de classe légère, et pour limiter le stress lors des examens et prélèvements sanguins, ils seront toujours manipulés par 2. Les chevaux appartenant à l'établissement utilisateur, ils sont habitués au personnel soignant, à la manipulation et à la réalisation d’échographies. Par ailleurs, en cas de réaction inflammatoire au niveau des stites d’injection des vaccins entrainant une douleur ou une raideur de l’encolure, des anti-inflammatoires seront adminisrtés et du froid sera appliqué localement. Aucune nouvelle injection de vaccin ne sera réalisée sur le cheval.

Choix des espèces

Le vaccin que nous souhaiterions tester a été développé à des fins de traitement chez des chevaux arthrosiques. Après deux études pilotes réalisées dans d'autres espèces, nous souhaiterions tester l’immunogénicité de notre vaccin chez le cheval. Il est donc nécessaire pour ce projet d’avoir recours au cheval. En effet les résultats obtenus sur d’autres espèces ne pourraient être transposables directement à l’espèce cible, puisqu’il existe des spécificités d’espèce sur le système immunitaire. Il est donc nécessaire dans le cadre de cette étude de travailler avec l’espèce cible du produit à évaluer. Les chevaux utilisés sont des adultes (≥ 3 ans). Le traitement étudié étant destiné à être utilisé chez l’adulte il est préférable pour cette étude de choisir des animaux de l’âge cible. Par ailleurs, pour la facilité des manipulations il est souhaitable d’avoir des chevaux débourrés donc adultes.

Pour installer dans l'établissement un modèle de décollement de la rétine, 1 600 lapins, 1 600 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le décollement est provoqué par une injection sous la rétine, suivie d'examens oculaires hebdomadaires, d'instillations quotidiennes, d'injections dans l'œil une à deux fois par semaine et de prises de sang. Le porteur affirme que le décollement de rétine n'est pas douloureux chez l'être humain et transpose ce constat aux autres animaux, tout en indiquant que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Les animaux qui suivent la procédure entière sont tués pour analyse des tissus, les autres, environ 10 %, sont gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure.

Objectifs

La rétine est un tissu photo sensible nécessaire à la vision. Elle tapisse l’intérieur de l’œil, reçoit les informations lumineuses, les transforme en signaux nerveux et les transmet au cerveau. Certains troubles de la vision peuvent être dus à un décollement de rétine. Les causes du décollement rétinien peuvent être variées (myopie, opérations de la cataracte, diabète, tumeurs de l’œil, forte inflammation, vieillissement des structures de l’œil, un coup porté à l’œil, ou encore hérédité…). Le mécanisme impliqué est le plus souvent une accumulation de liquide sous la rétine, qui pénètre par des trous ou des déchirures de la rétine. Lors de ce décollement la rétine est séparée physiquement de son support, si cette séparation persiste les cellules de la rétine meurent, la zone décollée ne fonctionne plus. Sans traitement par l’ophtalmologiste le décollement s’étend, pouvant ainsi entrainer des lésions irréversibles de la rétine et même la cécité. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle de décollement rétinien chez les rongeurs et le lapin, afin de tester des traitements qui vont permettre la survie de la rétine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine dans les cas de décollement rétiniens.

Procédures

Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection sous rétinienne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour. Les injections peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les maladies neurodégénératives de la rétine et les décollements ne sont pas douloureux chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animal en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.