Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Evaluation d’un élément d’essai dans une étude pré-clinique de pharmacocinétique, de pharmacodynamie ou de toxicité
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 120
Chiens : 240
Furets : 180
Cochons : 120
Les protocoles suivent ici la commande d'un donneur d'ordre, chaque étude fixant l'espèce, les doses et la durée selon le candidat médicament à enregistrer. 1 800 souris, 1 800 rats, 240 chiens, 180 furets, 120 cobayes, 120 lapins et 120 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des administrations une à trois fois par jour pendant un à 91 jours, subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins le premier jour pour les non-rongeurs, et parfois une chirurgie de quinze à soixante minutes pour implanter un cathéter ou une micro-pompe. Les animaux ayant reçu une substance toxique ou atteint les points limites sont tués, les autres réutilisés, et c'est le vétérinaire qui décide si un chien ou un furet peut être replacé, selon le nombre et la sévérité des procédures qu'il a déjà subies.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas ou le moins possible d’effets délétères sur l’animal. L’intérêt sociétale est majeur puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique, de manière à déterminer les temps de pré-traitement, la durée de vie, les doses présentant le plus d'efficacité et le moins d'effets secondaires... Mais aussi à évaluer leur distribution dans, et/ou leur potentielle toxicité sur différents organes. Ils sont donc nécessaires pour 1/réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale en ciblant au mieux les doses et temps de pré-traitement pour les études d'efficacité par exemple dans des modèles de pathologie, et 2/apporter des données pré-cliniques préalables aux études cliniques et à la mise sur le marché des médicaments.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations d'éléments d'essai par diverses voies, de manière unique (de l'ordre de 1 à 60 secondes) ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale. A l'administration d'un élément d'essai peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides biologiques, de manière unique (de l'ordre de quelques secondes à plusieurs minutes par prélèvement) ou répétée à diverses fréquences (1 à 8 fois par jour, sur une durée de 1 jour à plusieurs mois). Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Dans le cas d'administrations répétées ou par perfusion, ou de prélèvements sanguins répétés, d'une chirurgie (implantation de cathéter veineux ou autre dispositif de type micro-pompe ou système d'accès vasculaire, ou prélèvement de tissus d'intérêt) peut être pratiquée sur les animaux, quelques jours avant le début des administrations ou des prélèvements, ou en fin d'étude. Ce type de procédure chirugicale dure entre 15 et 60 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Quelques nuisances peuvent être causées par certaines procédures: par exemple, un stress provoqué par les administrations, des prélèvements divers ou à l'isolement (le cas échéant), une potentielle douleur post-opératoire (après chirurgie d'implantation de cathéter veineux ou autre dispositif) ou une gêne causée par le volume occupé par un dispositif implanté en sous-cutané.
Devenir
Pour les 7 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu un élément d'essai toxique (atteinte des points limites) ou une substance dont les effets à long terme sont potentiellement néfastes, sont euthanasiés. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux qui ont reçu un traitement dont les effets à long terme sont connus pour être non-néfastes. La réutilisation des animaux (toute espèce) est soumise à l’approbation du vétérinaire, celle-ci est privilégiée pour contribuer à la réduction du nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale. La décision de replacer un chien ou un furet est prise par le vétérinaire, en fonction du nombre et de la sévérité des procédures subies par l'animal, et éventuellement de son age.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, la biologie clinique, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes, ou l'étude vise à évaluer la distribution d'une substance pharmacologique dans l'organisme vivant, dans son intégralité. Selon les espèces, le métabolisme est différent. Selon le stade d’avancement du projet ou selon le type de composé, il peut être nécessaire d’effectuer ces études sur les espèces suivantes : rats, souris, cobayes, lapins, chiens, furets, porcs. Ces techniques nécessitent l’utilisation d'animaux de laboratoire et ne peuvent être efficacement remplacées par des méthodes alternatives.
Réduction
Ce projet s'intègre dans un objectif de Réduction du nombre d'animaux utilisé en expérimentation animale. En effet, il permet de sélectionner dans des groupes réduits, les doses et les temps de pré-traitement les plus efficaces (et d'éliminer les doses sub-efficaces et/ou présentant trop d'effets délétères) avant les études pré-cliniques d'efficacité ou de sécurité, permettant, ainsi, de réduire de manière importante le nombre d'animaux utilisé dans d'autres modèles d'études précliniques (modèle de pathologie, tests comportementaux et/ou physiologiques...). Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire. Le nombre d'animaux utilisé pour chaque étude est réduit au strict minimum, de manière à permettre une interprétation correcte et objective des résultats, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux sera déterminé en fonction des procédures secondaires qui seront ensuite réalisées sur les animaux ou selon les lignes directrices de l’OCDE dans le cas des études de toxicité. Ce projet, d’une durée de 3 ans, couvrirait un maximum de 36 études chez le rat, 18 chez la souris, 6 chez le cobaye, 9 chez le furet, 6 chez le lapin, 12 chez le chien et 6 chez le porc, en considérant qu’une étude correspond à une procédure expérimentale. De plus, la formation du personnel technique permettra de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé (limitation du nombre d’animaux surnuméraires et de l'euthanasie prématurée des animaux).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, l'état d'hydratation, les tremblements, la respiration, etc...), ainsi qu'en une limitation de l'effectif au strict nécessaire. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Enfin, lorsque nécessaire (e.g. en cas de prélèvements sanguins importants), une réhydratation des animaux est prévue.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur (Réf. ICH M3(R2)). Le choix de l’espèce est propre à chaque étude et justifié par le donneur d’ordre, en fonction de la substance à tester, de son mécanisme d’action, de l’éventuelle disponibilité de données préliminaires issues de tests de pharmacocinétique ou d’innocuité, préalablement réalisés, ce peut être aussi en fonction des similitudes avec l’homme concernant des voies métaboliques précises ou un système physiologique cible. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 420). Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis l'âge de sevrage jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 409).
Etude de bioéquivalence de produits vétérinaires chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Le développement de médicaments vétérinaires génériques passe ici par 200 chiens, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et remis ensuite à disposition pour d'autres protocoles. Chaque étude leur impose 12 à 30 prélèvements sanguins, avec jusqu'à 14 en 24 heures, des administrations réglées sur la posologie du fabricant, et 3 à 6 prélèvements d'urine par ponction de la vessie sous échographie, l'animal n'étant qu'anesthésié localement. Les chiens sont mis à jeun jusqu'à seize heures avant l'administration pour standardiser l'absorption. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour ce type de test et présente le passage par l'espèce cible comme une "étape obligatoire" pour la mise sur le marché du générique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouvelles formulations vétérinaires chez le chien et de comparer cette cinétique à des produits déjà commercialisés dans le cadre de développement de génériques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de médicaments vétérinaires génériques permettant de pallier à la rupture de stock de certains produits.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la cinétique (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement d’urine par cystocentèse échoguidée sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la cinétique.
Impact sur les animaux
Aucune réaction sévère n’est attendue, le principe actif étant déjà commercialisé, les éventuels effets secondaires sont déjà connus. Les nuisances attendues liées aux prélèvements des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.
Devenir
A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du générique doit être comparée avec celle du produit de référence afin d’être commercialisé avec le même champs d’action. L’étude sur l’espèce cible est donc une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché du générique vétérinaire.
Réduction
Le nombre d'animaux sera justifié par le Donneur d’Ordre dans le protocole de chaque étude. Il sera basé sur le nombre nécessaire pour avoir la plus grande amplitude de variabilité et/ou de différence dans les moyennes des résultats. Lorsque le risque d’exclusion d’animaux est élevé (perte de produit à l’administration ou vomissement), des animaux supplémentaires pourront être inclus afin de maintenir une puissance statistique appropriée et ne pas avoir à renouveler l’étude. Le nombre d’animaux sera minimisé grâce au cross-over mis en place après un temps de repos suffisant. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude pourra être réduit par la conduite d’étude exploratoire préliminaire permettant d’évaluer la variabilité des résultats inter-individus, et donc d’ajuster au mieux le nombre d’animaux à inclure pour obtenir des résultats interprétables. Ce projet incluant 200 animaux permettra de réaliser 1 à 2 études par an.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à de l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les conditions d’alimentation des animaux seront standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront le bien-être des animaux en fonction de la voie d’administration. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du générique doit être comparé à celle du médicament de référence pour le bon développement du nouveau générique. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens d'âge correspondant à celui indiqué pour le traitement.
Régénération de tissu adipeux à l’aide de matrices en polymères et d’hydrogels résorbables
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
Cochons : 84
Deux heures d'anesthésie par mini-porc pour l'implantation, puis un suivi par IRM à un, trois, six et neuf mois et à un an : 840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des matrices en polymères et des hydrogels leur sont implantés sous la peau ou dans une chambre d'ingénierie tissulaire, avec un prélèvement sanguin pendant la chirurgie, pour mettre au point une reconstruction du sein et de l'hypoderme destinée à remplacer implants en silicone et transferts de graisse. Le porteur annonce des risques de rejet, d'inflammation locale et de toxicité, et prévoit l'explantation ou la mise à mort selon la gravité de l'état de l'animal. Le choix des espèces tient à la ressemblance de leur peau avec la peau humaine et à leur taille, qui permet de tester plusieurs conditions sur un même individu.
Objectifs
Actuellement, les solutions cliniques pour la reconstruction des couches profondes de la peau et du sein à l'aide de tissu adipeux présentent des limitations significatives. Les procédures de transfert de graisse autologue peuvent entraîner des complications au site donneur et ne garantissent pas des résultats prévisibles. L'introduction de corps étrangers comme les implants mammaires en silicone comporte des risques potentiels pour la santé et nécessite une surveillance à long terme. Les approches de reconstruction cutanée après une atteinte profonde se concentrent sur l'utilisation de greffes de peau, négligeant l'hypoderme et limitant ainsi la reconstruction complète. Ce projet vise à développer une approche novatrice et biocompatible pour la régénération du tissu adipeux. Cette solution repose sur l'utilisation synergique d’une matrice en polymères et d'hydrogels cellularisés, offrant ainsi une alternative esthétique et fonctionnelle prometteuse pour les patient(e)s. Le premier objectif est d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels utilisés dans cette approche. Il est essentiel de s'assurer que ces matériaux ne provoquent pas de réactions indésirables et qu'ils favorisent la régénération du tissu adipeux. Utilisant un modèle animal, nous chercherons à comprendre les interactions complexes entre les adipocytes, l'hydrogel, la matrice polymère, et l'organisme hôte. Cette étape est cruciale pour optimiser la compatibilité et l'intégration des matériaux dans le corps. Nous évaluerons également la possibilité d'utiliser des cellules souches humaines dans la combinaison hydrogel/matrice, en utilisant un modèle de souris immunodéprimées. Cette approche permettra de simuler au mieux les conditions humaines et d'évaluer l'efficacité de la régénération tissulaire. Afin d’étudier l’influence des matériaux sur un modèle de rongeur qui permet de tester des matériaux de taille moyenne, le rat sera employé pour une première comparaison des différentes combinaisons. Une fois la meilleure combinaison hydrogel/matrice sélectionnée, nous réaliserons des tests sur le porc, un modèle animal plus proche de l'homme en termes de physiologie et de composition cutanée. Cette étape sera cruciale pour valider l'efficacité clinique. Ce projet est porteur d'un potentiel majeur pour l'innovation en chirurgie plastique et reconstructrice, et il pourrait révolutionner les pratiques à l'échelle mondiale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à déterminer les combinaisons optimales d'hydrogels et de matrices pour la régénération du tissu adipeux, avec des implications majeures à la fois sur le plan clinique et scientifique. Il offre la possibilité d'améliorer considérablement les options de reconstruction mammaire et cutanée actuellement disponibles, en limitant les inconvénients des méthodes traditionnelles et en garantissant une meilleure biocompatibilité et performance.
Procédures
Ce projet se déroule en plusieurs étapes. Après une période d'acclimatation d'au moins une semaine, tous les animaux (840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs) seront anesthésiés par inhalation (15 minutes pour les rongeurs et 1 heure pour les mini-porcs). Pour les rats, le pelage sera tondu dans les zones d'implantation (10 secondes). Pour tous les animaux, les zones d'implantation seront désinfectées à l'aide d'un désinfectant (10 secondes). Pour la procédure ayant pour but d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels, une injection en sous-cutanée sera effectuée (10 min, 130 souris et 130 rats). Pour obtenir un tissu adipeux vascularisé reconstruit, une combinaison de chambres d'ingénierie tissulaire (pour la reconstruction du sein, 250 souris, 250 rats, 80 porcs) ou de matrices 3D (pour la reconstruction de l'hypoderme, 250 souris, 250 rats, 24 porcs) sera associée à des hydrogels cellules ou à de la graisse (durée totale de l'anesthésie : 30 minutes par rongeur ou 2 heures par mini-porc). Pendant la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué. Afin d’avoir un applicatif clinique, il est nécessaire d’évaluer si la cryopréservation des construits permet d’obtenir la même performance que des construits préparés extemporanément, de ce fait 150 souris et 130 rats seront implantées avec des construits ayant bénéficié de différentes méthodes de cryopréservation. Toutefois, la procédure appliquée à ces animaux est identique à celles expliquées précédemment. Pour les souris et les rats, un essai de survie cellulaire in vivo sera suivi longitudinalement par bioluminescence. À cette fin, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse (10 minutes). Pour les rats et les porcs (utilisant une chambre d'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du sein), le suivi longitudinal de la croissance du lambeau sera effectué par IRM à 1, 3, 6, 9 mois et 1 an après l'implantation. Pour cela, les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée de la procédure : 30 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être constatés sont une irritation ou une inflammation locale à proximité du matériau, des risques de rejet ou de toxicité locale et systémique. Afin de limiter les risques, de nombreuses expériences in vitro ont été effectuées, ne montrant pas de signe de toxicité. De plus, des mesures sont mises en place et les animaux feront l’objet d’une vigilance quotidienne et rigoureuse pour détecter tout signe de souffrance ou d’approchement de point limite. Un contrôle du site opératoire sera réalisé lors de chaque visite quotidienne. La prise pondérale sera évaluée deux fois par semaine. Un traitement antidouleur sera administré, et si nécessaire, des mesures telles que l'explantation ou la mise à mort de l'animal seront envisagées en fonction de la gravité de son état.
Devenir
Du fait de notre protocole, nos animaux ne peuvent pas être replacés. Il est nécessaire de mettre à mort nos animaux pour réaliser nos prélèvements histologiques.
Remplacement
Nous avons employé une variété de techniques in vitro pour évaluer l'impact de nos polymères sur le destin des cellules, y compris leur survie et leur différenciation ainsi que sur l'angiogenèse en utilisant la membrane chorioallantoïque de poulet comme modèle. Toutefois, afin de déterminer pleinement les performances de nos biomatériaux en matière de régénération tissulaire, il est impératif de procéder à des essais in vivo. Ces expériences permettront de prendre en compte la complexité d'un système physiologique réel, incluant notamment les réponses inflammatoires, la formation de tissu cicatriciel, et les processus naturels de guérison. Les études in vivo nous fourniront ainsi des données cruciales pour optimiser notre technique avant de franchir l'étape des études cliniques.
Réduction
Une étude pilote sera réalisée dans un premier temps afin de vérifier que les conditions expérimentales choisies sont adéquates. Les études in vitro précédemment réalisées ont démontré l’efficacité des différents polymères résorbables quant à leur influence sur la survie et la prolifération cellulaire ainsi que sur la différenciation adipocytaire. Elles ont permis une sélection des polymères permettant le maintien des adipocytes et favorisant la néovascularisation. Elles ont également pu donner une idée du temps de résorption des polymères dans un liquide physiologique reconstitué à 37°C. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, ce qui permettra de limiter le nombre de répétition en fonction des résultats des groupes précédents. En fonction des résultats, les tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage pour les souris et en hébergement unique pour les rats et les mini-pigs. Cet environnement est enrichi (balle pour le mini-pig par exemple) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids…), un traitement analgésique sera envisagé. Des points limites adaptés pour chaque procédure seront définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable). La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Le porc et le rat sont des espèces appropriées pour étudier les processus de régénération de la peau car les structures anatomiques et physiologiques de leurs peaux sont celles qui ressemblent le plus à celle des humains. Le rat est un animal que nous avons fréquemment utilisé dans nos études précédentes et dont le modèle est maitrisé. De plus, notre équipe maîtrise maintenant la levée des lambeaux chez ces espèces pour nos modèles de régénération du sein. La taille du porc et du rat nous permet de tester plusieurs conditions sur un seul animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre intérêt s’est porté sur les souris standards, immunodéprimées utilisées dans une étude de reconstruction de la peau humaine et humanisées qui permettent d’évaluer le comportement de cellules/tissus humains en présence de nos biomatériaux. Les souris sont âgées de 8 semaines et pesant 20 à 23 grammes afin que les souris aient atteint leur maturité sexuelle. Utiliser des souris matures permet d'avoir une taille adéquate pour réaliser l'implantation. Les rats adultes sont agêes de 15 semaines minimum afin d'avoir une réserve de graisse sous-cutanée suffisante pour réaliser les implantations et permettre de tester plusieurs conditions expérimentales sur un même animal. Pour les porcs, nous utiliserons deux types d'animaux : des porcs 45 à 55kg pour la reconstruction de la peau afin d’éviter d’avoir un hypoderme trop épais (car la zone à reconstruire serait trop importante et peu représentative d’un hypoderme humain) et des porcs de 70 kg pour la reconstruction du sein afin que la taille de l’animal soit compatible avec l’implantation de chambre équivalente à celle que l’on pourrait implanter chez l’humain.
Production d’anticorps polyclonaux sur souris
- Production de routine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".
Objectifs
Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.
Bénéfices attendus
De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.
Procédures
- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes
Impact sur les animaux
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.
Remplacement
La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.
Réduction
Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.
Raffinement
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.
Compréhension des mécanismes immunitaires associés à des nanoparticules d’ARNm en fonction de leur voie d’administration chez la souris naïve
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2 055 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vaccin à ARNm par voie intranasale, par voie oro-trachéale avec introduction d'un cathéter dans la trachée, ou par voie intramusculaire, puis quatre séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et quatre prélèvements de sang au sinus submandibulaire, en contention et vigiles. Un lot pilote de 30 souris sert uniquement à entraîner les intervenants à ce geste de prélèvement. Aucune maladie n'est induite, les souris sont tuées pour prélever poumons, nez, rate, ganglions et sang, et le porteur inscrit ces travaux dans une "production souveraine" de vaccins et l'ambition française de se placer "à l'avant-garde" des biothérapies.
Objectifs
Les récents succès des vaccins à base d’ARN messager (ARNm) contre le SARS-Cov2 ont validé le potentiel thérapeutique de cette classe de médicament. Le projet RNAvac a pour objectif de produire une nouvelle génération de vaccins ARNm en développant des technologies innovantes afin de lever les limitations des vaccins à ARNm démontrées par leur courte durée de protection induite nécessitant de fréquents rappels et leur inefficacité à bloquer les infections au site d’entrée du virus chez les personnes vaccinées. Il vise à étendre leur utilisation pour le traitement d’autres pathologies, comme le cancer. Pour relever ce défi, un consortium de 11 laboratoires académiques s’est structuré pour accélérer la production de vaccins innovants afin de les déployer pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers muqueux dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. L’ambition est d’accélérer la production française de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires (virus NIPAH, West Nile …), d’épidémies récurrentes (grippe…), et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. Plus spécifiquement, ce projet vise à décrire et comparer les réponses immunitaires induites par différents vaccins à ARNm en fonction de leur voir d’administration, soit intra-pulmonaire, soit intra-nasale chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Ce projet fait partit d’un consortium de grande envergure qui vise à développer de nouvelles générations de vaccins ARN messager pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. Les éléments de rupture qui seront apportés par le projet sont : une approche de formulation originale de vaccins avec des ARNm bioproduits plus efficaces et moins couteux, une stratégie innovante de stabilisation d’ARNm, l’administration par voie mucosale de vaccins ARNm et le double ciblage ARN/antigène vers les cellules dendritiques pour favoriser la réponse immunitaire mémoire post-vaccinale. Le consortium s’appuie sur plusieurs infrastructures nationales et un réseau de start-ups et d’entreprises, des centres hospitaliers universitaires, qui vont faciliter le transfert technologique pour l’industrialisation et vers le patient. L’ambition long-terme est d’accélérer la production souveraine de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires, d’épidémies récurrentes et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. En conclusion, ce projet s’inscrit pleinement dans l’ambition de la France de se positionner à l’avant-garde des technologies de biothérapie et de bioproduction à base d’ARNm.
Procédures
1a_Administration des ARNm par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes 1b_Administration des ARNm par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min 1c_Administration des ARNm par voie intramusculaire : en contention, animal vigil, 1 fois, 1min 30secondes 2_Mesure de la bioluminescence/fluorescence émise par les nanoparticules d’ARNm: sous anesthésie générale, 1 fois/semaine (total = 4) , 5min 3_Prélèvement de sang : en contention, animal vigil, 1 fois/semaine (total = 4), 2min
Impact sur les animaux
Aucune pathologie modèle ne sera testée chez l’animal. Il s’agit ici d’évaluer l’immunogénicité de différentes formulations d’ARNm en fonction de leur voie d’administration. Des données préliminaires in vitro obtenues dans les laboratoires collaborateurs vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les différentes formulations d’ARNm, à celles présentant la plus faible toxicité minimisant ainsi les nuisances. Les nuisances associées aux administrations des formulation d’ARNm comprendront : le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus par la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée au prélèvement submandibullaire.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux aARNm en fonction de leur voie d'administration. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, nez, sang total, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Ce projet est la suite de résultats obtenus sur des modèles in vitro dans des équipes collaboratrices. Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux réponses immunitaires mucosales et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modalités d’administration de biothérapies (intranasale, intratrachéale ou intramusculaire) sont très bien décrites chez la souris et sont maitrisées par notre équipe. L’utilisation de la souris permettra de mimer les phénomènes immunitaires observés chez l’Homme. Les outils transgéniques, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans l’immunogénicité à long terme induit par les ARNm sont disponibles chez la souris. Enfin, l’étude de la mécanistique immunitaire induit par les ARNm délivrés par voie pulmonaire est possible chez la souris grâce à des outils appropriés disponibles au laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, …). Les modèles murins et les différentes modalités d’administration sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Des données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses et des temps d’analyses. L’utilisation d’imagerie non-invasive (via l’utilisation de formulations d’ANRm fluorescent/luminescent) permettra un suivi longitudinal des animaux, limitant leur nombre. 1 lot pilote de 30 animaux a été inclus afin d'entraîner les intervenant à la maîtrise du geste de prélèvement de sang par ponctions au niveau du sinus submandibulaire. Ceci permettra d’augmenter le robustesse de ce geste et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée à l’observation, au cours des expérimentations envisagées, des points suivants: (1) une perte de poids de l'animal, et/ou (2) détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal et altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir ou de boire, poil hirsutes) et/ou (3) symptômes évidents. Ces symptômes, incluant des éléments physiques, physiologiques et comportementaux permettront d'établir un score clinique permettant de déterminer objectivement la poursuite ou non de l'expérimentation sur l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes et (2) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines formulations augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études chez l’animal sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux ARNm. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec gestes techniques procédures.
Efficacité antibactérienne de l’eau enrichie en oxygène sur le portage asymptomatique de Campylobacter jejuni chez le poulet de chair
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Pour tester si de l'eau enrichie en oxygène réduit le portage de Campylobacter jejuni chez le poulet de chair, 144 oiseaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit, vigile et sous contention, un gavage unique de moins de cinq minutes pour l'inoculation, puis est élevé en isolateur jusqu'à trente-cinq jours. Tous sont tués pour prélever les cæca et compter les bactéries, à raison de douze animaux par point de la cinétique. Aucun traitement de soulagement n'est prévu, au motif qu'il fausserait les résultats, et l'association de plumes ébouriffées, de prostration et d'anorexie pendant vingt-quatre heures déclenche la mise à mort par électronarcose puis élongation cervicale.
Objectifs
Le développement des résistances bactériennes aux antibiotiques est une problématique de santé publique mondiale. Elle est la capacité d'un microorganisme à résister aux effets des antibiotiques. Les bactéries disposent de nombreux mécanismes de résistance contre des molécules toxiques auxquelles elles sont naturellement confrontées dans leur environnement. Le cas le plus fréquent est une adaptation, qui naît de mutations génétiques aléatoires, ou qui fait suite à des échanges de gènes de résistances entre des bactéries. Si une bactérie est porteuse de plusieurs gènes de résistance pour différents antibiotiques, elle est dite « multirésistante ». Parmi les pathologies avicoles bactériennes, la campylobactériose, maladie zoonotique, est un problème de santé publique mondial, important en Europe, aux États-Unis, en Australie et en Nouvelle-Zélande. Il s'agit d'une maladie d'origine alimentaire principalement due à la contamination de la viande de poulet par Campylobacter spp qui peut être transférée des animaux à l'homme par la consommation et la manipulation de la viande. Les espèces Campylobacter les plus importantes sont C. jejuni et C. coli qui peuvent induire divers signes cliniques tels que diarrhée, douleurs abdominales, fièvre, maux de tête, nausées et vomissements chez l’homme. Dans certains cas, des complications post-infectieuses sont observées, comme le syndrome de Guillain-Barré, une faiblesse musculaire à déclenchement rapide causée par le système immunitaire endommageant le système nerveux périphérique. Par conséquent, le portage asymptomatique de Campylobacter spp chez les volailles est une préoccupation majeure.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l’efficacité des traitements alternatifs tels que l’eau enrichie en oxygène par rapport aux antibiotiques utilisés dans les élevages avicoles. Les entrants étant diminués, ce travail aura un impact économique et sanitaire pour les éleveurs et contribuera à la réduction de l’utilisation des antibioques mis en place par le gouvernement. A long terme, un impact sur la Santé publique sera obtenu en reduisant le nombre de contaminations humaines et limitant d’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans le monde vétérinaire, transmissible à l’homme.
Procédures
Inoculation par gavage par voie orale des poulets vigiles contentionnés, 1 fois et moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Juste lors de gavage de l’inoculum qui peut engendrer un léger stress lors de la contention.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pour prélever les caeca pour la quantification bactérienne et de mesurer l'effet du traitement sur la portage de Campylobacter.
Remplacement
Il n'existe aucune méthode alternative pour développer un portage asymptomatique chez le poulet.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature, les premières données expérimentales obtenues sur le modèle infectieux et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Le nombre de poussins par lot et par dose de produit (n=44) sont suffisantes pour montrer statistiquement l’efficacité du traitement contre Campylobacter jejuni (avec des effectifs similaires comme décrit dans la littérature) et qui montre une diminution significative de 60% sur la colonisation caecale dans le modèle Salmonella après vaccination et autres traitements (mesure de l’effet vaccination sur l’excrétion des salmonelles)). 12 poussins ou poulets seront donc euthanasiés par point de la cinétique. L'évaluation statistique des différences entre les groupes expérimentaux sera déterminée par une analyse de variance.
Raffinement
Aucune médication de soulagement ne peut être utilisée sans mettre en péril les résultats de l’étude. Il y a des possibilités d’interactions médicamenteuses entre les analgésiants et les nouvelles molécules. Les animaux sont hébergés en isolateur. La densité des animaux est surveillée en fonction de leur prise de poids et qu'elle ne dépasse pas celle prévue dans la règlementation. Il y aura un enrichissement social (vie en groupe et visite bi-journalière des animaliers) et des structures d'enrichissement (des perchoirs, tapis au sol sur une partie de l’isolateur et des objets suspendus afin qu’ils puissent être au plus proche de leur environnement naturel). Aucune symptôlogie ou mal-être n’est attendu pendant l’étude. Points limites : Les animaux seront euthanasiés si leur état clinique ne laisse aucun doute sur leur souffrance et/ou une issue fatale. En particulier, l’association de trois signes cliniques majeurs tels que : plumes ébouriffées, prostration, anorexie pendant au plus 24h, conduira de fait à l’euthanasie des animaux. Les animaux atteignant le point limite expérimental seront euthanasiés par électronarcose suivi d'une élongation cervicale en fonction de l'âge des animaux ou par injection par injection de barbituriques par le sinus occipital.
Choix des espèces
Selon l’OCDE, la viande de volaille est la plus consommée en quantité dans le monde. Selon la littérature scientifique, il apparait que la combinaison Campylobacter-poulet est celle qui est à l’origine du plus grand nombre de cas d’infections chez l’Homme. Le poulet est le vecteur principal de la zoonose (de la campylobactériose) chez l’Homme et donc l’espèce la plus pertinente. Il n'est pas possible de comprendre le portage asymptomatique de Campylobacter sur des modèles in vitro. Œufs fécondés, stade poussin de 1 jour, puis poulet. Les œufs embryonnés sont fournis par le couvoir, puis mis en incubationen interne afin de préserver le statut sanitaire des animaux et éviter toutes contaminations environnementales. Les poussins de 1 jour seront mise en place en isolateur avec un environnement enrichi, puis élevés pendant 35 jours.
Recherche des substances pyrogènes dans le cadre réglementaire de la libération de lots de vaccins sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour vérifier qu'un lot de vaccin ne contient pas de substance provoquant de la fièvre avant sa mise sur le marché, 80 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque essai commence par l'introduction d'une sonde thermique par voie rectale, puis une injection du produit dans la veine de l'oreille. Un produit est testé sur trois lapins, avec jusqu'à trois séries supplémentaires de trois animaux en cas de résultat intermédiaire, pour environ seize tests prévus. Le porteur indique que l'objectif européen est le remplacement complet des lapins en 2026, et précise que les animaux dont la température monte de plus de 1,2 °C sont mis à mort, les autres étant gardés jusqu'à trois mois pour être réutilisés dans d'autres contrôles.
Objectifs
L'essai des pyrogènes est un essai de sécurité requis pour la libération de lots sur le marché de certains vaccins. Il permet de s'assurer que les lots mis à disposition des patients ne contiennent pas de substances susceptibles d'induire de la fièvre et de nuire à leur santé.
Bénéfices attendus
La conformité des résultats de l'essai est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins concernés, c'est à dire avant la mise à disposition des patients.
Procédures
Les lapins sont soumis aux interventions suivantes: -introduction d'une sonde de température enduite de vaseline par voie rectale: mise en place de 10 à 30 s. - injection dans la veine de l'oreille: une administration par lapin et par essai: durée entre 30s et 2 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont l'inconfort lié à la contention, au port de la sonde rectale et à la vaccination par voie intraveineuse. La vaccination peut causer une légère douleur transitoire. En cas de produit non conforme contenant des substances pyrogènes, une augmentation transitoire de la température corporelle peut se produire.
Devenir
Les lapins n'ayant pas présentée une élévation de température supérieure à plus de 1,2°C sont gardés en vie en fin de test pour pouvoir éventuellement être réutilisé dans les 3 mois suivants pour le contrôle d'un ou ou plusieurs autres produits (fonction des réceptions des échantillons et des délais de libération de lots). Les lapins arrivés depuis environ 3 mois et ceux pour lesquels la réponse indiviuelle lors d'un essais est supérieure à 1,2°C sont mis à mort.
Remplacement
Progressivement des méthodes alternatives à l'essai des pyrogènes sont validées pour les différents types de vaccin chez les fabricants et en parallèle dans nos laboratoires. L'objectif européen est le remplacement complet de l'utilisation des lapins en 2026.
Réduction
Le nombre d'animaux par lot est réglementairement fixé. Le test d'un produit se fait sur 3 lapins. En cas de résultat intermédiaire (supérieur à la limite de conformité mais inférieur à la limite de non conformité) un à 3 retests peuvent être effectués à chaque fois sur un lot de 3 lapins différents pour un total de 12 animaux. Environ 16 tests sont prévus pour la durée du projet.
Raffinement
Les lapins sont habitués très progressivement à la contention (période d'environ 3 semaines entre la réception dans nos locaux et l'utilisation en essai): mise en place d'abord d'une collerette dans la cage puis habituation progressive aux boites de contention.
Choix des espèces
L'’essai des pyrogènes doit être réalisé sur des lapins adultes de plus de 1,5 kg. Nous commandons les lapins à 10 semaines environ, donc adultes ce qui correspond à des lapins d’un poids d’environ 2 kg. Des lapins plus jeunes, donc plus vifs, s’habitueraient moins bien à la contention. Des lapins trop âgés ne tiendraient pas dans les boîtes de contention et seraient trop gênés par la collerette.
Test pilote d’évaluation des effets secondaires potentiels d’un candidat médicament chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 300
Cochons d'Inde : 180
Caler la dose, la formulation et la voie d'administration avant les études de plus grande ampleur : 300 souris, 300 rats et 180 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à deux administrations par 24 heures pendant quatre semaines, jusqu'à huit prélèvements sanguins par jour, et pour certains une chirurgie de 20 à 45 minutes pour implanter cathéters ou mini-pompe, suivie d'un hébergement isolé pendant toute l'étude. Le porteur mentionne aussi la privation de nourriture et l'isolement en cage de mise à jeun, et reconnaît qu'aucune analyse statistique ne sera conduite sur ces tests pilotes. 650 animaux seront tués, les 130 autres pouvant être réutilisés dans d'autres projets, la formation par exemple, s'ils n'ont pas montré d'effets marqués.
Objectifs
Lors des premières étapes du développement de nouveaux médicaments, des tests préliminaires sur de petits groupes d'animaux vigiles sont souvent nécessaires pour établir des paramètres clés tels que la dose, la formulation et la voie d'administration. Ces essais préliminaires servent à évaluer l'impact de ces changements de paramètres sur le rongeur vigile (rats, souris, cobayes) par des études de peu d'animaux, avec une surveillance accrue des effets secondaires. L'objectif est de s'assurer que les changements apportés dans ces paramètres n'entraînent pas de réactions indésirables majeures. Ces essais initiaux permettent de réduire les risques d’effets secondaires lors des études ultérieures de plus grande envergure qui suivront, et s'assurer qu'elles aient un impact conforme à celui envisagé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes sur le profil du candidat médicament et d’évaluer les éventuels effets secondaires locaux et généraux sur un petit groupe d'animaux avant de pouvoir passer aux premières administrations chez un plus grand nombre d'animaux. Ceci est donc une étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Selon leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques sur l’espèce utilisée (Rongeurs) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Lors de ce projet, les animaux seront soumis à une ou des administrations de produit, avec moins de 3 minutes par administration (2 administrations/ 24h maximum, sur 4 semaines maximum). Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal (environ 2 minutes par prélèvements). Ces expériences (administration et prélèvements de sang) pourront être réalisées sur animal vigile ou anesthésié, en respectant un volume maximal de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. Les fréquences des prélevements sont en fonction du volume et mode de prélèvement, sans dépasser 8 prélèvements par 24h. Un prélèvement sanguin ou de tissu terminal sous anesthésie pourra être éventuellement réalisé (durée entre 4 et 6 minutes). Chirurgie d'implantation de cathéters et/ou de minipompe (pour prélèvements et/ou administration). Cette chirurgie durera environ 20-45min.
Impact sur les animaux
Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint : pour l'administration du composé à tester et pour d'éventuels prélèvements de sang, éventuellement pour induire une anesthésie. Ces contentions peuvent donc engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations et lors des prélèvements sanguins. La chirurgie d'implantation de cathéters et de minipompes chez le rat et le cobaye peut induire des douleurs post-chirurgicales. Post-chirurgie d'implantation de cathéters, les animaux seront hébergés individuellement sur la durée de l'étude pour récupérer. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée. De plus, les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'isolement en cage de mise à jeun. Les effets potentiellement indésirables font l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la suite d’effets marqués des produits testés. Tous les animaux implantés avec des cathéters ou avec une mini-pompe seront euthanasiés. Ce sera également le cas pour les animaux avec prélèvements terminaux (tissus et prélèvements sanguins). Les animaux non-implantés (cathéters et/ou mini-pompe) ou les animaux n'ayant pas subi de prélèvements terminaux pourront être réutilisés si ils n'ont pas présenté d'effets marqués après traitement . Leur réutilisation pour d'autres projets (ex : formation) sera possible si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets systémiques ou locaux d’une nouvelle molécule sur l'homme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou des effets secondaires d'un candidat médicament.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Aucune analyse statistique ne sera réalisée sur les résultats d’expérimentation des tests pilotes, car le nombre d'animaux utilisés par groupe est faible et l'objectif de ces tests est principalement de détecter des effets indésirables sur une petite échelle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, du poids et des signes cliniques • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire , • La mise en groupe des animaux , • Un raffinement spécifique à ce projet sera réalisé par la mise en application d’ une grille de cotation spécifique à l'espèce permettant d'objectiver la douleur et la contrainte subie par l'animal.
Choix des espèces
Ce projet pratique sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le rongeur est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets potentiels d'un candidat médicament, notamment par sa facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Réalisation d’une étude de toxicologie réglementaire d’une xénogreffe de tissus épidermiques humains chez le rat nude
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une biopsie de peau, la greffe d'un feuillet d'épiderme humain sous anesthésie, puis six semaines d'isolement en cage individuelle parce que les rats rongent l'implant de leurs congénères. 136 rats nude, dépourvus de défenses immunitaires, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tués et autopsiés, 16 n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique étant réutilisés dans d'autres projets. L'étude est une toxicologie réglementaire, prérequis administratif aux essais cliniques d'un implant cutané destiné aux ulcères de la peau. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable important, tout en prévoyant la mise à mort des animaux en cas de nécrose cutanée, de rejet du greffon ou de douleur sévère, et rapporte l'effectif à des lignes directrices internationales dont il ne dit pas ce qu'elles exigent.
Objectifs
Réaliser une étude de toxicologie réglementaire, chez le rat immunodéficient, d’une greffe de tissu humain avant administration à l’Homme pour traiter les ulcères de la peau, c'est à dire évaluer la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de la greffe de cellules souches pluripotentes humaines.
Bénéfices attendus
L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est le prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III. C’est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet donc de démontrer l’absence de risque du modèle de d’implant avant de le réaliser chez l’Homme. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines) Elle permettra de collecter des données sur la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles permettant d’obtenir toutes ses données. Il permet de récolter des données réglementaires pour la préparation des essais cliniques. En effet, ces études permettent d’augmenter les chances de tester cliniquement un produit dépourvu d’effets toxiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie et analgésie adaptées : une biopsie de la peau est effectuée et d’un greffon de cellules épidermique humain est mise en place sur la zone biopsiée La durée de la chirurgie est d’environ 30 min. Un suivi post opératoire bi quotidien est ensuite réalisé avec administration d’un analgésique pendant 3 jours (doses pouvant être augmenté si nécessaire). Des prélèvements sanguins seront effectués sur l’ensemble des animaux pendant la durée de l’étude (au maximum 26 semaines) : jusqu’à 4 prélèvements, sous anesthésie légère.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu d’effets indésirables importants lié à l’implant de tissu épidermique chez l’animal en raison d’une procédure d’anesthésie/analgésie mise en place par un vétérinaire, d’une chirurgie de courte durée (environ 30 minutes) effectué par un personnel compétant et un suivi post-opératoire et quotidienne pendant l’ensemble de la durée de la procédure. L’utilisation d’animaux immunodéficients réduits le risque d’inflammation importante et le risque de rejet de l’implant de tissues épidermiques. De plus, les prélèvements sanguins effectués au cours de la procédure sont des gestes peu invasifs et peu douloureux d’autant plus lorsqu’ils sont effectués par du personnel expérimenté selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Cependant, en cas de signes d’infections, de rejet du greffon, ou d’effets toxiques importants liés à l’implant (perte de poids importante, inflammation sévère, nécrose cutanée, douleur sévère) l’animal sera euthanasié afin de procéder à un examen anatomopathologique dans le cadre de l’étude de toxicité réglementaire, selon les recommandations l’ICH/EMA.
Devenir
Les animaux n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique (non invasif) pourront être réutilisés dans d'autres projets. Les animaux ayant subi la chirurgie sont euthanasiés et autopsiés, comme définit par les lignes directrices ICH/EMA encadrant le déroulement des études de toxicologie règlementaire.
Remplacement
L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA, prérequise aux essais cliniques de phase I, II et III. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines). Les études de toxicologie règlementaire doivent être effectuées sur des modèles animaux selon les guidelines ICH/EMA, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser par groupe est fixé par les lignes directrices ICH/EMA. Il est considéré comme le minimum acceptable des études réglementaires afin de permettre une interprétation scientifique des données et d’évaluation précise des possibles effets toxiques.
Raffinement
Afin de réduire les nuissances liés à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera biquotidienne, et inclus l’administration d’analgésie injectable (si nécessaire) et par voie orale (dans l’eau de boisson) systématiquement durant 2 à 3 jours. Un hébergement individuel est requis pendant 6 semaines pour éviter tout risque de destruction de l’implant qui a été observé lors des études préliminaires avec hébergement collectif : les rats rongent systématiquement l’implant du congénère lors des 1ères semaines post-opératoires. L’hébergement sera enrichie (object en bois spécifiques pour les rongeurs de différentes formes et tailles, en plus des enrichissements déjà prévus pour une hébergement collectif - tunnel, matériaux de nidification, bois à ronger - et une litière de cellulose favorisant le confort des rats nude) pour maintenir le bien être de l’animal sous supervision de la SBEA. Les animaux seront isolés dès la semaine d'acclimatation, afin d'éviter tout risque de blessures cutanées liées à un jeu ou une bagarre et réduire l'impact de l'isolement au réveil de la chirurgie. Les prélèvements de sang seront réalisés sous sédation par inhalation d’isoflurane, afin de limiter le stress induit par la contention manuelle ou des lésions vasculaires lorsqu’un animal est agité. Enfin, pour réduire les nuissances liés à la greffe et la chirurgie (principalement l'inflammation et le rejet du greffon), une souche de rat immunodéprimé est utilisée. Comme cette souche peut être plus sensibles aux agents pathogènes, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages type III H permettant à l'animal de se redresser (dimension 374x214x185 prévue intialement pour 2 à 4 rats) sous couvercle filtrant , puis en groupe dans des portoirs ventilés. Les salles d'hébergements et de test utilisées seront dédiées à cette souche uniquement avec d'éviter des contaminations croisées et l'ensemble de l'étude se déroulera dans une zone SPF (Specific Pathogen Free). Des points limites ont été définies afin de permettre la mise en place d'actions correctives afin d'éviter tout souffrance.
Choix des espèces
Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires in vivo (régies par les lignes directrices ICH M3(R2) et ICH S3A et ICH S6(R1)) qui nécessitent l’utilisation d’au moins une espèce animal. Le rat nude immunodéficient permet d’implanter en sous cutanée l’implant de cellule humaine sans risque de rejet immédiat et il permet l’évaluation de la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles avant de faire les essais cliniques chez l’Homme A partir de 6 semaines, selon l’âge recommandé par les lignes directrices ICH/EMA
Génotypage invasif de rongeurs dans le cadre des élevages et des projets de recherche
- Production de routine
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Tests réglementaires
Rats : 12600
336 000 souris et 12 600 rats, quinze secondes de contention chacun : voilà l'échelle du génotypage par poinçon d'oreille demandé pour cinq ans dans un seul établissement. Ces 348 600 rongeurs, dont certains âgés de dix jours, subissent le prélèvement d'un morceau d'oreille sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec une douleur brève et un risque d'infection du site. Aucun calcul d'effectif n'accompagne la demande, le porteur se fondant sur ses chiffres de production des cinq dernières années. Les animaux restent vivants à l'issue et rejoignent d'autres projets ou les colonies d'élevage, ceux dont le génotype ne convient pas étant tués, en nombre que le porteur ne chiffre pas.
Objectifs
Les animaux transgéniques des élevages de souris génétiquement modifiés doivent être génotypés afin de pouvoir être utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés. L’objectif de ce projet est de décrire le prélèvement nécessaire pour le génotypage, au sein de notre structure. Cette demande couvrira l’élevage de toutes les lignées élevées au sein de notre établissement en dehors des projets de recherche. Les thématiques/domaines de recherche de l’établissement concernent la pathophysiologie des organes, la cancérologie, l’immunologie et le métabolisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont d’assurer une bonne traçabilité des animaux, connaître leur génotype pour les intégrer dans les projets de recherche validés. Ce projet nous permettra d’identifier génétiquement de façon correcte et efficace les animaux de notre établissement. Cette traçabilité nous aidera à maintenir un élevage raisonné en identifiant génétiquement au plus vite et efficacement les animaux d’intérêt.
Procédures
Tous les animaux issus de nos élevages transgéniques internes seront soumis à un poinçon d’oreille afin d’assurer son identification génétique. Cet acte est effectué sur animal vigile par simple contention manuelle et dure 15 secondes par animal (couplé à l'identification de l'animal - hors champ).
Impact sur les animaux
Tous les animaux seront soumis, vigiles, à une contention pour le prélèvement d’un bout d’oreille (à l’aide d’un poinçon d'oreille). Une légère et brève douleur au moment du prélèvement est envisagée. Le site de prélèvement peut s’infecter. La manipulation des animaux peut induire un stress.
Devenir
Les animaux seront en vie à la fin de la procédure. Les animaux maintenus en vie seront soit inclus dans les projets préalablement autorisés (utilisation continue) soit conservés pour l’entretien des colonies. Les animaux avec un génotype non souhaités seront euthanasiés (nombre non défini avec précision car dépendant des naissances).
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes artificiels, un système vivant est nécessaire dans de nombreux projets de recherche, car à l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs environnementaux rentrant en jeu. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable. L’utilisation des animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet. Nous avons besoin de réaliser cet acte de génotypage in vivo chez la souris et le rat afin de pouvoir utiliser ces animaux. Cette procédure ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas d’autres possibilités pour identifier génétiquement un animal au sein d’un établissement.
Réduction
Basé sur les données de production des dernières 5 ans au sein de notre établissement, ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 336.000 souris et 12.600 rats sur 5 ans. Les élevages seront raisonnés afin d’éviter la naissance d’animaux non utilisés dans les projets. Compte-tenu de la nature du projet, il n’y aura pas de calculs de puissance et/ou de tests statistiques appliqués à la présente demande. La biopsie sera couplée à une identification individuel effectué par puçage réalisés lors de la même contention. Il est important de préciser que bien que l'identification soit hors champ d'application, le choix de la méthode revêt une importance dans un contexte de réduction. En effet, nous utilisons des puces électroniques afin de ne pas avoir de redondance dans les numéros et de pouvoir assurer une meilleure traçabilité (2 animaux ne peuvent pas avoir la même numérotation). Ce système évite les risques d’erreur qui pourrait entrainer l’éventuelle euthanasie d’un animal mal identifié. La lecture du numéro est facile, rapide et sans risque d’erreur et ne nécessite pas l’utilisation d’un schéma d’identification qui pourrait éventuellement varier d’une animalerie à l’autre.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, maisonnettes, ou bâtons à ronger, etc). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Le comportement général des animaux sera suivi. A la moindre anomalie qui est observée un suivi et des conseils sont données par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) de manière à assurer une prise en charge rapide et optimale des animaux. Des points limites sont définis et sont respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux notamment en ce qui concerne le nombre de portées par femelle et le temps de reproduction des géniteurs. Le prélèvement tissulaire est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un re-prélevèment est demandé sur un adulte pour une vérification de son génome, sa légitimité sera vérifiée par le personnel de la structure. De plus, le personnel impliqué est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’élevage et expérimentation animale. Au sein de notre animalerie, le génotypage était réalisé sur un échantillon de queue, nous avons changé pour un prélèvement d’oreille considéré moins impactant pour l’animal. Actuellement, d’autres techniques sont testées pour un génotypage moins invasif (comme avec les poils), mais les résultats actuels ne nous permettent pas de remplacer la technique éprouvée utilisée en routine.
Choix des espèces
Le choix de la souris et du rat se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques: - Notre centre de recherche utilise des rongeurs (souris, rats) ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris et le rat sont les animaux de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ces types d’animaux et nous avons acquis une pratique expérimentale sur ces espèces. Les animaux seront utilisés à partir de 10j afin de minimiser l’impact de la procédure.
Evaluation de la securite ophtalmomologique d’une nouvelle technologie d’OCT chez le lapin NZW
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cinq lapins reçoivent dans l'œil, à quatre reprises, un laser dont l'éclairement dépasse d'un facteur dix la limite fixée par la norme ISO, avec une lame de verre posée sur la cornée. Ces séances de quarante-cinq minutes se déroulent sous anesthésie générale et relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des ulcères de l'épithélium cornéen, des lésions de l'endothélium et une cataracte par effet thermique comme atteintes possibles, et précise que l'étude est faite "justement" pour en constater la survenue. Tous les lapins sont tués pour histologie oculaire, leurs os et leur cochlée partant à d'autres équipes, afin qu'une startup française puisse déposer un dossier d'autorisation pour son appareil.
Objectifs
Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) nommée LC-OCT permettant d'effectuer des images proche de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer la safety sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte ou prise de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme des selles liquides.
Procédures
Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'oeil sous sédation et l'animal sous anesthésie général. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT durera 5 minutes.
Impact sur les animaux
L'éclairement du laser du LC OCT est de 820 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35). Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).
Devenir
En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires. D'autres équipes de recherche récupéreront les os et la cochlée des animaux.
Remplacement
Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.
Réduction
Tout d'abord nous utilisons l'oeil gauche de chaque animal comme oeil contrôle réduisant de moitié le nombre d'animaux nécessaire. Ensuite, Compte tenu de la faible variabilité interindividuelle habituellement observée dans les études ophtalmologiques utilisant l'imagerie non invasive, ainsi que de notre objectif de comparer, par suivi clinique et histologie post-mortem, l'état des tissus oculaires des yeux contrôles (OG) et des yeux analysés (OD) pour chaque animal à l'aide d'une échelle de graduation semi-quantitative, et afin d'obtenir un échantillonnage suffisant pour effectuer une analyse statistique avec des tests de rangs non paramétriques (OG vs OD), nous avons déterminé qu'un minimum de 5 animaux est nécessaire pour tirer des conclusions valables. En effet, avec moins de 5 lapins, les tests statistiques perdent de leur pertinence, tandis qu'un nombre supérieur à 5 semble excessif.
Raffinement
Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale.
Choix des espèces
D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).
Effet de l’eau riche en oxygène sur la méthanogènese entérique chez le ruminant
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Enfermées sept jours d'affilée en chambre respiratoire pour mesurer le méthane qu'elles émettent, 4 brebis de réforme vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une eau de boisson enrichie en nanobulles d'oxygène, censée gêner les microbes producteurs de méthane du rumen. Le porteur écrit que cette mesure n'entraîne "aucune souffrance ni douleur", ce que la gravité modérée déclarée dans le même document contredit. Le devenir des brebis dépend d'une évaluation administrative en cours : si l'innocuité des nanobulles n'est pas établie, elles seront tuées par précaution, sinon leur replacement sera soumis à l'avis de la structure de bien-être animal.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’effet d’une eau de boisson enrichie en nanobulles d’oxygène sur la production de méthane entérique chez l’ovin. Cet essai servira de preuve de concept. Les microbes producteurs de méthane (méthanogènes) sont très sensibles à l’oxygène et notre hypothèse de travail est que les nanobulles d’oxygène inhiberont l’activité des méthanogènes.
Bénéfices attendus
La diminution de l’empreinte carbone des ruminants par une solution innovante d’utilisation facile sur le terrain, y compris au pâturage, peu coûteuse et facilement acceptable par les utilisateurs et la société.
Procédures
Au cours des 7 jours d'expérimentation, les animaux seront dans des chambres respiratoires semi-ouvertes.
Impact sur les animaux
Les animaux entreront en chambre respiratoire pendant 7 jours consécutifs pour la mesure des émissions de méthane. Cette mesure n’entraîne aucune souffrance ni douleur chez l’animal qui est libre de mouvement dans une surface de 3,3 m2 qui est supérieure aux normes de bien être (2 m2). Les chambres respiratoires semi-ouvertes sont disposées côte à côte avec de larges parois translucides qui permettent aux animaux de se voir, de s’entendre et de percevoir les odeurs, ce qui diminue le stress lié à l’isolement.
Devenir
L’innocuité de l’utilisation de nanobulles dans l’eau de boisson est en cours d’évaluation par les autorités compétentes. Si elle ne peut être établie, en application du principe de précaution, les animaux seront mis à mort. Sinon, leur replacement sera soumis à l’avis de la SBEA.
Remplacement
Ce type d’étude a déjà été réalisé in vitro et nécessite une validation chez l’animal.
Réduction
D'après notre expérience reconnue dans le domaine de la mesure des émissions des gaz à effet de serre par les ruminants, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables en termes d'émissions de méthane en chambre respiratoire avec un écart entre groupes de ~30% est de 4 par lot. Chaque animal sera son propre témoin. Nous utilisons le nombre minimal d’individus pour cette étude de preuve de concept très peu contraignant pour les animaux.
Raffinement
Cette mesure n’entraîne aucune souffrance ni douleur chez l’animal qui est libre de mouvement dans une surface de 3,3 m2 qui est aménagée avec caillebotis pour assurer un confort de couchage et la bonne évacuation des effluents. Les chambres respiratoires semi-ouvertes sont disposées côte à côte avec de larges parois translucides qui permettent aux animaux de se voir, de s’entendre et de percevoir les odeurs, ce qui diminue le stress lié à l’isolement.
Choix des espèces
Pour cette étude nous avons besoin des animaux avec un rumen fonctionnel (des agneaux après sevrage ou des ovins adultes). Nous utiliserons des brebis de réforme car en fin de vie productive. Il n'y a pas de préférence de sexe pour l’objectif de l’étude, par contre tous les animaux seront du même sexe. Comme indiqué au-dessus, nous utiliserons des femelles de réforme. On s’attend à une diminution minimale de méthane d’environ 30%. Cette amplitude de diminution est facilement détectable en chambre respiratoire. Le nombre de 4 animaux est suffisant au vue de la précision des mesures pour cette preuve de concept.