Tests réglementaires

520 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un autre projet après accord vétérinaire. Chaque animal reçoit l'implantation chirurgicale d'un émetteur de télémétrie sous anesthésie, puis des administrations de candidats médicaments et des prélèvements sanguins, avec des périodes d'isolement pouvant atteindre plusieurs jours, pour évaluer la sécurité cardiovasculaire de ces molécules. Le porteur indique que les effets indésirables des produits testés ne sont "pas prévisibles" au départ. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante et présente même l'étude comme bénéfique pour l'animal par le développement d'outils de raffinement.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardiovasculaires chez le cobaye vigile en utilisant la télémétrie dans le cadre réglementaire de l'évaluation de la sécurité des médicaments sur les fonctions vitales de l'organisme. La télémétrie permet de mesurer différents paramètres physiologiques chez l'animal vigile libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire. Pour l'animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée (le cobaye) par le développement d'outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l'espèce la plus prédictive en fonction de l'objectif scientifique attendu.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : - une anesthésie générale pour l'implantation chirurgicale d’un dispositif de télémétrie avec une analgésie morphinique (1 implantation dans leur vie - durée maximale 1h30) et un suivi postopératoire suivant les bonnes pratiques vétérinaires - une administration du produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes) à un volume respectant les recommandations éthiques. - des prélèvements de sang (maximum 2 prélèvements /24h, 1 min/prélèvement) en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvement. - des périodes d'isolement en environnement restreint sur 48h maximum (généralement 24h) pendant les périodes d'enregistrement de télémétrie. - une mise à jeun éventuelle de 16 et 24h avant administration du produit à tester.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés pour l'implantation de l'émetteur de télémétrie. Les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8j) et chaque jour d'enregistrement (48h max). Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 1min/prélèvement), et à une mise à jeun éventuelle de 16 et 24h avant administration du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. La nuisance pour l’animal est réduite à son maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le cobaye car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fonction cardiovasculaire. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le cobaye est l’une des espèces de rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés. De plus, un même animal pourra recevoir plusieurs doses d'un même produit, ce qui permettra également de reduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le cobaye est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la fonction cardiovasculaire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par des souches vivantes de Brucella pour leur faire produire des anticorps, puis mis à mort par ponction cardiaque afin de récupérer leur sang et leurs organes. Le porteur indique que l'infection provoque une fièvre intermittente, une baisse d'appétit et une perte de poids, et présente cette production de sérums mutualisée en Europe comme visant à limiter le nombre de lapins utilisés. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" de production de ces anticorps, tout en évoquant une piste à partir des cellules de rate pour "s'affranchir" à l'avenir de l'animal.

Objectifs

La brucellose est une maladie qui se transmet de l'animal à l'homme, et vice versa, causée par la bactérie Brucella, qui touche un très large spectre d’hôtes, incluant les hommes, de nombreuses espèces de mammifères et même les amphibiens. L'une des étapes du diagnostic consiste en l’identification de la souche de Brucella responsable de la maladie par un test rapide d'identification sur lame appelé typage bactériologique. Ce typage nécessite l'utilisation de sérums contenant des anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella, dit sérums monospécifiques. Notre premier objectif est la préparation de sérums monospécifiques contre quatres espèces de Brucella : deux espèces lisses de Brucella (B. abortus et B. melitensis), une espèce rugueuse (B. ovis) et une nouvelle espèce (BO3). Il permettra également de produire un sérum négatif (sans anticorps) pour la validation du biotypage (contrôle négatif) permettant l’identification du genre Brucella. L’expérimentation permettra également la production d’un sérum négatif indispensable pour la validation du biotypage. La production de sérums mono-spécifiques est mutualisée à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale de lapins vivants et devrait permettre d’obtenir une quantité de sérum visant à maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans. Cette préparation de sérums monospécifiques sera réalisée en trois étapes : immunisation/inoculation de lapins au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées ; prélèvement du sang des animaux infectés et des contrôles négatifs pour arriver à obtenir une concentration en anticorps suffisante pour la suite des étapes ; et élimination des anticorps non-spécifiques des sérums afin d’obtenir un sérum spécifique d’une seule espèce bactérienne. Ce projet permettra également de collecter les organes (foie, poumons, ganglions lymphatiques et organes reproducteurs) des animaux après mise à mort afin de constituer une collection de tissus positifs pour chacun des genres de Brucella qui serviront de contrôles positifs pour la validation des méthodes de diagnostic. Enfin, les cellules de la rate qui produisent des anticorps mono-spécifiques seront utilisées afin de développer un protocole de production in vitro d’anticorps mono-spécifiques et ainsi réduire si possible la nécessité d'utiliser des animaux.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire des réactifs (sérums monospécifiques et témoin négatif) permettant l’identification de l’espèce bactérienne de Brucella lors d’une suspicion de brucellose. Quatre sérums monospécifiques seront produit grace à ce projet, chaque sérum monospécifique étant constitué d’anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella. Un sérum « contrôle négatif » (sans anticorps) sera également produit. Ces sérums sont indispensables pour le typage bactériologique, et notamment pour une espèce récemment décrite (souche zoonotique de Brucella BO3) qui n’est à ce jour pas identifiable à l'aide des sérums existants, et pour laquelle les anticorps ne sont pas détectables par les méthodes d’immuno-sérologie classiques. Ces sérums seront utilisés comme réactifs par l’ensemble des laboratoires de référence de l’Union Européenne pour les diagnostiques de brucelloses animales. À ce jour, il n'existe pas de méthode in vitro de production d'anticorps et le recours à une infection expérimentale est le seul moyen d'obtenir ces anticorps spécifiques. Un autre bénéfice attendu du projet est d’obtenir à partir de la rate des lapins infectés des cellules productrices d’anticorps spécifiques contre le genre Brucella qui pourraient permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques avec l’objectif de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.

Procédures

Tous les animaux utilisés (12 animaux au mimimum et 15 animaux au maximum) seront soumis à des prélèvements sanguins (1 mL) avant infection (à J-5), puis à J6 post-infection et éventuellement à J8 et J10 selon les résultats de la concentration sérique des prélèvements. Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intra-musculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 - 10 minutes. Soit au maximum 4 prélèvements par animal. À J0, les animaux dans l’animalerie A3 (8 animaux, par série de 2 animaux à la fois) seront infectés par une des 4 souches de Brucella dédiées (2 animaux infectés pour chaque souche). Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 minutes. Soit une seule injection par animal. La technique de mise à mort est appropriée pour les lapins (selon l’annexe IV). Les lapins sont anesthésiés par un mélange Xylazine (35 mg/Kg) et de Kétamine (10 mg/Kg) injecté par voie intramusculaire pendant 15 minutes. L’anesthésie est confirmée par les tests de réflexe de retrait de la patte et de réflexe de la paupière. La mise à mort des lapins est assurée par une injection intracardiaque de 5 mL de barbiturate (Doléthal) après exsanguination par ponction cardiaque. Soit deux injections pour la mise à mort par animal.

Impact sur les animaux

Les lapins sont des animaux sensibles à l’infection par Brucella spp. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l'infection par Brucella spp.. La dose proposée est calibrée en fonction de la réaction du système immunitaire des lapins pour provoquer une forte réponse immunitaire (production d’anticorps par l’organisme) mais la durée de l’infection n’est pas suffisante pour que des symptômes non spécifiques se développent. D’après les expériences similaires décrites dans la littérature, la courte période de l’expérimentation et la dose infectieuse utilisée nous attendons chez les lapins les effets indésirables suivants : une fièvre intermittente de quelques jours, baisse d’appétit et par conséquent perte de poids. Après inoculation des agents pathogènes, l'état clinique des animaux sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

La production de sérums monospécifiques n’est possible qu’à partir de l’immunisation d’animaux au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées. En effet, la production d'anticorps spécifiques nécessite la stimulation de l'ensemble du système immunitaire pour la maturation des anticorps dans un modèle animal vivant sous conditions contrôlées. Cette production n’est réalisée que rarement, tous les 10 ans en moyenne, en mutualisant l’utilisation des réactifs à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux. Nous profiterons de cette série de production pour isoler les cellules de rate, productrices des anticorps spécifiques contre la souche de Brucella inoculée, et les immortaliser. Cette étape pourrait nous permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques et ainsi de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.

Réduction

La production de sérums monospécifiques est mutualisée à l’échelle européenne afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux vivants. Le modèle lapin a été choisi au regard de la quantité de sérum qui pourra être produite (50 mL de sérum monospécifique attendu pour un prélevement de sang total de 80 mL par lapin) et qui sera suffisante pour couvrir les besoins en sérum monospécifiques pour une longue durée tout en utilisant le moins d’animal possible. Le nombre minimal de lapins a été calculé pour chaque sérum monospécifique (2 lapins infectés et 1 animal témoin pour chaque espèce de Brucella), avec l’objectif d’obtenir une quantité de sérum permettant de maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans, correspondant à une quantité d’environ 100 mL pour chaque sérum monospécifique.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins étant très sensibles à la manipulation, ils seront surveillés et approchés quotidiennement pendant les sept jours d’acclimatation par les animaliers et les expérimentateurs pour les habituer à leur présence et aux manipulations. Après la periode d’acclimatation, les lapins destinés à l’infection seront transférés dans la zone confinée de niveau de sécurité biologique 3 de l’animalerie et placés dans des cages avec des branches en bois et des branches végétales comme enrichissement. Durant l’expérimentation, l'état clinique des animaux sera contrôlé quotidiennement, afin de suivre l’évolution de la température corporelle, l’évolution du poids, la prise de nourriture et l’état général des animaux. Avant tous prélèvements sanguins, prise de température et pesée, les animaux seront tranquillisés par une injection en intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg).

Choix des espèces

Les lapins sont sensibles à l’infection par de nombreux agents pathogènes, dont les espèces classiques du genre Brucella. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l'infection par Brucella spp. Les lapins utilisés pour l’expérimentation sont des adultes (race New Zealand White) présentant un poids de 3,5 à 4 Kg afin d’optimiser la quantité de sérum obtenue par animal.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie un implant en silicone au graphène ou un disque de titane en sous-cutané, neuf d'entre elles subissant un prélèvement intracardiaque avant la mise à mort destinée à récupérer l'implant et les tissus. Le porteur affirme que ces matériaux, déjà utilisés en clinique, sont "parfaitement tolérés" et que les animaux ne montrent aucun signe de souffrance après réveil. Il indique que les tests in vitro, jugés "indispensables", ont été réalisés, l'étape sur animaux répondant à une demande réglementaire et au choix de l'industriel commanditaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance d’un implant en silicone traité avec des nanoparticules de graphène pouvant induire un changement de forme (comparé à un implant en silicone non traité) ou d’un disque de titane nano-texturé après une implantation sous-cutanée chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer des matériaux innovants permettant d’améliorer des dispositifs médicaux (comme des prothèses, des cathéters…). Les disques de titane ont été modifiés pour posséder une nano-texture augmentant leur énergie de surface afin de modifier l’adsorption de protéines. Ce dispositif aura pour but de fournir en toute sécurité des cellules régénératrices et/ ou des produits biothérapeutiques dont les cibles pourraient être les cellules bêta productrices d’insuline. L’implant en silicone coaté avec des nanoparticules de graphène pouvant changer de forme dans le corps sous l’influence d’un stimulus externe permettra une avancée révolutionnaire dans différents domaines d’application tels que la cicatrisation des plaies à la demande, la fermeture de sphincter, la cicatrisation des tissus mous, le réglage de dispositifs médicaux implantés etc…) tout en s’affranchissant d’une ré-ouverture chirurgicale.

Procédures

La mise en place de l’implant chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe 30 min après une administration d’analgésique. La procédure chirurgicale sera réalisée stérilement et le disque (titane ou silicone) sera inséré. La plaie sera ensuite refermée. La durée de la chirurgie pour chaque animal est évaluée à 10 minutes environ. Le changement de forme induite par le dispositif se fera sous anesthésie fixe et ne durera quelques secondes. 9 souris seront soumises à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe avant la mise à mort. Les autres souris (3) seront mises à mort par sans prélèvement intracardiaque.

Impact sur les animaux

S’agissant de matériels étrangers implantés en sous-cutané (sans infection bactérienne), les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane et en silicone sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire à type de collection purulente (en cas de contamination bactérienne), d’œdème au niveau du site d’implantation peut être attendue mais les expériences menées par le passé par l’équipe montrent que celles-ci sont extrêmement rares voire inexistantes. Les animaux retrouvent une mobilité immédiatement après leur réveil et ne montrent aucun signe de souffrance. De plus les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents supports. Le changement de forme induite par le dispositif Si traité se fera sous anesthésie fixe et ne dura quelques secondes. Si toutefois, l’animal présente un score clinique entre 5 et 7 une injection de buprénorphine pourra être envisagée pour soulager l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une étude histologique et bactérienne

Remplacement

Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, ou encore dans le domaine de la médecine régénérative, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées selon des méthodes traditionnelles in vitro (mesure de l’activité bactéricide selon différentes normes, de l’inflammation, de changement chimique ou encore de structure). Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement et ont en effet été réalisés par le commanditaire de l’étude. Les instances règlementaires demandent à ce stade d’évaluer ces nouveaux dispositifs en conditions réelles, c’est-à-dire dans des modèles vivo, afin d’approcher au mieux les conditions de cicatrisation tissulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum : 4 souris par groupe pour évaluer la phase de tolérance des différents dispositifs. - Implant Ti - Implant en Si traité Implant en Si non traité

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation. De plus, les marqueurs à analyser lors de cette étude sont essentiellement inflammatoires. L’utilisation d’un antalgique, 30 min avant l’anesthésie permettra de diminuer la douleur et une récupération plus rapide de la mobilité des souris. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leurs réveils. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers, selon l’expérience de l’équipe. Par ailleurs, il s’agit d’une implantation sans infection donc en aucun cas une infection locale ou systémique ne sont anticipées. Si toutefois, l’animal présente un score clinique entre 5 et 7 une injection de buprénorphine pourra être envisagée pour soulager l’animal. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les modèles d’implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris C57Bl6 de 7 semaines de façon à avoir un poids corporel de 23-25g

10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau deux implants d'un biomatériau lors d'une chirurgie, avec un risque d'hématome, d'abcès et de douleurs à l'alimentation. Le porteur, en collaboration avec deux partenaires industriels, évalue la tolérance d'un film destiné à prévenir les fistules après ablation du larynx chez l'humain. Il indique que le dispositif n'a jamais été testé in vivo et qu'un modèle in silico n'est pas envisageable.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau implanté sous la peau chez le petit animal (10 souris). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale sera effectuée, consistant à effectuer une insertion du biomatériau sous la peau. Chirurgie durant 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et détérioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie pour analyse de l'explant).

Remplacement

ll n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées dans un milieu non calcique seulement. Un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalable afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 10 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon un design établi au préalable. De plus, chaque animal sera porteur de deux implants, ce qui divise par deux le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation. Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages contiendront 3 à 4 souris et seront de taille adaptée à la règlementation. Le change sera effectué 2 fois par mois. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie pour analyse des explants).

Choix des espèces

Modèle animal simple, fiable et suffisamment robuste pour l'objectif de l'étude. Souris adultes d'au moins 5 semaines. Les souris seront utilisées à l'âge adulte car le taux d'hormone de croissance et les capacités de cicatrisation sont accrus chez les animaux en croissance. Des souris mâles seront utilisées. Aucune étude ne prouve de différence de capacité de cicatrisation chez la souris adulte en fonction du sexe, notre choix a donc été guidé par l'aspect logistique (éviter de mélanger les sexes en cage) et car les cancers de la tête et du cou touchent principalement les hommes.

10 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une lipoaspiration puis l'implantation sous-cutanée de bioprothèses mammaires, avec pansements répétés et prélèvements sanguins, avant explantation. Le porteur décrit des douleurs faibles à modérées et un risque d'infection du site opératoire. Les animaux sont tués par surdosage anesthésique à la fin, le porteur justifiant le choix du cochon par la proximité de sa peau avec la peau humaine.

Objectifs

Développement d’une nouvelle bioprothèse mammaire constituée, à sa surface d’une matrice de derme porcin decellularisé et en son sein de cellules adipeuses du sujet receveur associées à une molécule de transport de l’oxygène le M101 Hemo2life ®. L’objectif ici est de déterminer in vivo après implantation sous cutanée chez un porc la survie des cellules adipeuses au sein de la bioprothèse contenant du M101 comparativement à une prothèse dépourvue de M101.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le developpement d’une bioprothèse mammaire utilisable dans le cadre de la reconstruction mammaire après cancer du sein. Aucune évolution majeure n’est apparue depuis la creation des prothèses en sillicone dans les années 1970. En revanche de nombreuses complications restent fréquentes (infection, exposition, coque et réactions inflammatoires). Le traitement de ces complications reste difficile et inclus soit le changement des prothèses exposant de nouveaux aux mêmes complications, soit le passage à une reconstruction mammaire avec tissus autologues si elle est possible. Ainsi la creation d’une bioprothèse remplie par des cellules adipeuses du patient receveur permettrait d’offrir aux patientes une reconstruction durable dans le temps, présentant un resultat plus naturel et surtout une tolérance meilleure de par l’origine biologique de ces composants.

Procédures

Intervention unique : -Lipoaspiration (1h ) -> Implantation de bioprothèses biologiques en sous cutané ( 45 min) -> Explantation des implants (45 min) Interventions multiples à la demande : Prelevements sanguins

Impact sur les animaux

L’implantation des implants biologiques sous cutanés chez le porc pourrait entrainer des douleurs d’intensité faible à modérée ainsi qu’une limitation possible de l’activité. L’infection de site opératoire est un évènement possible. Pour éviter la survenue de cette complication, le site chirurgical sera fermé hermétiquement et une antibioprophylaxie sera mise en place pendant les 7 premiers jours post-opératoires. Aucune réaction immunologique n’est attendue chez l’animal, les composants de l’implant étant faits de derme porcin décellularisé (non immunogène) et de sa propre graisse. La molécule M101 (hemoglobine de ver marin permettant une augmentation du transport de l'oxygène et un relargage en situation d'ischémie) a déjà été testée chez le porc en injection systémique et n’a pas démontré d’effet indésirable. Dans le cadre de notre étude, elle ne sera pas utilisée dans la circulation systémique mais seulement au sein de l’implant sous cutané.

Devenir

Lipoaspiration et mise en place des implants sous cutanés: Vivant pour suivi Prélevement sanguin peripherique: Vivant Pansement: Vivant Explantation des implants: Euthanasie par surdosage anesthésique après sédation : sous anesthésie, injection de Doléthal (solution injectable pour euthanasie ; flacon de 250 ml ; 10 kg/10 ml)., fin de l'étude. La mise à mort des animaux est nécessaire en fin de procédure car les animaux présenteront d'importantes cicatrices (retractions cicatricielles, atrophies musculaires) entrainant des douleurs chroniques ne permettant pas de garder les animaux en vie dans les meilleures conditions possibles à la suite des expériences.

Remplacement

Aucune alternative non animale n’est possible à ce stade du projet. L’utilisation d’animaux vivants permet d’évaluer en condition in-vivo la durabilité de la prothèse ainsi que son efficacité dans les échanges gazeux pour maintenir la viabilité des cellules adipeuses contenues dans la prothèse. Les expériences in-vitro ont déjà été réalisés et ont montré l'efficacité de notre procédé pour maintenir les cellules adipeuses viables dans ce milieu. Nous en sommes donc à l'étape pré-clinique non réalisable sans animaux.

Réduction

Deux groupes composés de 5 animaux chacun permettront de comparer l'efficacité de la solution Adipolife dans les échanges gazeux à l'intérieur de la bioprothèse et ainsi la survie des cellules graisseuses. De plus le même animal sera utilisé pour le prelevement de la graisse et l'implantation des implants, réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Ces deux groupes incluent le risque d'échec (2 echecs par groupes) par infection du site opératoire, ainsi en l'absence d'échecs moins d'animaux seront utlisés (6 seulement). 3 animaux par groupes étant indispensable pour obtenir une significativité statistique.

Raffinement

Toutes les conditions nécessaires à une antalgie efficace en per et post opératoire seront mises en place. Ainsi une surveillance accrue de la douleur en post opératoire sera réalisée, ainsi qu’un contrôle quotidien des sites opératoires pour s’assurer de l’absence de réaction inflammatoire ou infectieuse post opératoire. En cas de constatation de modification comportementale des animaux, l'équipe veterinaire sera alertée et consultée afin de determiner l'attitude therapeutique à adopter. Des points limites (signes de souffrances des animaux) ont été définis et un arbre decisionne Hébergement en cage individuel – jeux (boule avec granule, jeux de mordillements) alimentation en poudre avec de l’eau.

Choix des espèces

En matière de recherche en chirurgie plastique et reconstructrice, l’utilisation du porc se justifie par la proximité de la peau porcine avec la peau humaine. Ainsi l’anatomie de la peau du porc est semblable à celle des humains composés de trois couches, l’épiderme, le derme et l’hypoderme. Le prelevement de tissu graisseux par lipoaspiration dans le modèle porcin est une méthode decrite, reproductible et peu douloureuse chez cet animal. Compte tenu de la taille de l’implant testé (150cc), les espèces animales murines, beaucoup plus éloignées des caractéritiques de la peau humaine, sont de plus inadaptées à ce type de recherche. Des animaux femelles adultes pesant environ 70kg seront utilisés dans cette expérience, nous avons besoin d'animaux adultes présentant un important pannicule adipeux pour réaliser la lipoaspiration

2 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié réutilisée dans d'autres projets et l'autre tuée pour prélèvement d'organes. Certaines reçoivent une minipompe implantée sous anesthésie, toutes reçoivent un candidat médicament par diverses voies puis passent le test d'Irwin, une batterie d'observations neurologiques, l'amphétamine et l'halopéridol servant de références. Le porteur, prestataire de service, propose cette évaluation des effets d'un composé sur le système nerveux central dans le cadre d'une offre commerciale. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit pour évaluer les effets comportementaux et neurologiques avant le passage chez l'humain.

Objectifs

La développement de nouveaux médicaments s'accompagne d'une évaluation de leurs potentiels effets secondaires chez l'animal avant toute administration chez l'homme. Cette évaluation pré-clinique de la sécurité du candidat médicament au niveau du système nerveux central peut être effectuée par le test d'Irwin chez la souris. Le test consiste à effectuer une batterie d'observations fonctionnelles incluant des paramètres comportementaux sensori-moteurs, autonomes ou neurologiques après administration d'un candidat médicament afin d'évaluer les effets secondaires de ce dernier sur le système nerveux central de la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments avec peu d'effets secondaires pour le patient afin de traiter diverses maladies dans de nombreuses indications thérapeutiques (par exemple, les cancers, les maladies du système nerveux central). Ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive.

Procédures

Avant de réaliser le test d'Irwin et afin de permettre une administration chronique du produit à tester, les animaux pourront être sujet à l'implantation d’une minipompe (environ 35 mins) sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique et recevoir un suivi post-opératoire selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux peuvent également recevoir le produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes ; voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intradermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion)) à un volume respectant les recommandations éthiques. Les animaux seront ensuite évalués d'un point de vue neurologique dans le test d'Irwin, un test durant 6 minutes et qui consiste en l'évaluation de différents paramètres à différents temps de mesure post-admininistration. Leur activité locomotrice pourra également être évaluée dans un actimètre (environ 60 minutes). Une observation peut être réalisée avant l'adminsitration et la période d'observation post-administration sera de 24h à 72h. Celle-ci pourra être allongée en fonction de la durée de demi-vie du candidat médicament. Des prélèvements de sang (environ 1 min) pourront également être effectués en cours d'étude en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvements. Des fluides corporels et des tissus pourront également être prélevés à la fin de l'étude après euthanasie de l'animal selon les bonnes pratiques vétérinaires.

Impact sur les animaux

Si chirurgie pour implanter une minipompe, les animaux seront sujets à une anesthésie. . Les animaux peuvent également être mis en isolement social après la chirurgie et jusqu'à 3 semaines post-chirurgie. Le test d'Irwin en lui-même ne provoque pas plus de nuisance pour l'animal qu'un éventuel stress lié à la préhension et au déplacement de ce dernier. L'administration d'éléments de référence comme l'amphétamine et l'halopéridol peuvent induire des effets secondaires modérés et limités par les doses utilisées dans cette procédure. Les animaux peuvent également être mis à jeun pour une période de 18-20h avec complémentation en glucose ou non.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux pourront être euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Un certain nombre d'animaux pourra également être réutilisé dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes comportementaux ou neurologiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour évaluer la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes, les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées pour évaluer les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement afin de s'affranchir de divers effets liés au développement et à l'âge (par exemple les changements hormonaux).

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une thérapie par ultrasons focalisés sur la valve aortique de 80 à 105 minutes, avec des échographies et des prélèvements de sang, puis est gardé un mois en observation avant d'être tué. Le porteur indique des douleurs possibles liées à l'application de la sonde et à l'émission des ultrasons, en s'appuyant sur des essais déjà menés chez l'humain. Cet amendement, qui ajoute un prélèvement sanguin, sert à tester l'innocuité d'un dispositif traitant le rétrécissement de la valve aortique, les cochons étant tués pour une analyse anatomopathologique.

Objectifs

AMENDEMENT. Notre dispositif est destiné à permettre de traiter de manière non invasive les patients souffrant de rétrécissement aortique calcifié, maladie durant laquelle la valve aortique se rigidifie. Cette pathologie est à l’heure actuelle traitée de manière invasive soit par chirurgie à cœur ouvert soit par cathétérisme afin de remplacer la valve malade. Ces interventions sont lourdes et parfois difficiles voire impossibles à supporter pour des sujets âgés. En focalisant les ultrasons de manière non-invasive sur la valve des patients notre thérapie permettrait de dérigidifier la valve et d’améliorer son fonctionnement sans effets secondaires. De premiers essais cliniques (« First In Human ») de notre prototype d’investigation clinique (Valvosoft®) ont été réalisés en Europe sur 34 patients souffrant de rétrécissement aortique calcifié sévère, inopérables avec les techniques invasives existantes. Les résultats de ces essais sont très encourageants tant du point de vue de l’innocuité de notre thérapie avec aucun évènement indésirable à court et long terme (suivi jusqu’à 24 mois) lié à notre dispositif médical, que des signaux d’efficacité très encourageants. Cependant la performance de la thérapie pourrait encore être améliorée. La durée de la thérapie pour obtenir l’efficacité avait été déterminée in vitro car il n’existe pas de modèle animal du rétrécissement aortique calcifié. Nous avions ensuite vérifié l’innocuité de cette durée sur porcs sains. Notre hypothèse est qu’une durée de thérapie supérieure est nécessaire sur les patients du fait des obstacles aux ultrasons (peau, muscles, côtes, poumons, etc…) qui ne peuvent être reproduits in vitro. Suite aux essais cliniques et à l’analyse des résultats cliniques intermédiaires, nous avons significativement amélioré notre dispositif médical (Valvosoft®) afin d’améliorer sa performance, son innocuité, son usabilité et sa maintenance, en particulier avec un nouveau système d’imagerie, une modification de la forme de l’interface acoustique facilitant la transmission des ultrasons et une nouvelle interface graphique. Nous avons donc trois objectifs : 1) Vérifier l’innocuité de notre thérapie per et post procédure à 30 jours avec le nouveau prototype d’investigation clinique 2) Déterminer si une durée plus longue de 105 minutes de notre thérapie reste sans danger. 3) Vérifier l’usabilité de la version améliorée de notre dispositif.

Bénéfices attendus

L’application de notre thérapie par ultrasons sur des pathologies cardiaques, et sa validation, ouvrirait des nouvelles perspectives pour la prise en charge de ces pathologies chez l’homme (cardiopathie valvulaire) normalement traitées par chirurgie ou cathétérisme. Cela permettrait de proposer à long terme une solution thérapeutique noninvasive et indolore (uniquement par ultrasons), sans chirurgie ni cathétérisme. Cette nouvelle approche si elle s'avère positive transformera la prise en charge des patients avec rétrécissement aortique calcifié.

Procédures

AMENDEMENT. La demande d'amendement de ce projet porte sur l'ajout d'un prélèvement sanguin supplémentaire sur l'animal pendant sa période d'observation entre 12 heures et 24 heures après la fin de notre thérapie par ultrasons. Sous anesthésie générale et analgésie, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Thérapie non-invasive par ultrasons transthoraciques d’une durée de 80 ou 105 minutes suivant les lots. 2) Echocardiographies de contrôle avant et après thérapie ainsi qu’un mois après thérapie, d’une durée approximative de 15 minutes chacune. 3) Prélèvements sanguins avant et après thérapie ainsi qu’un mois après thérapie, quatre tubes de 5 ml à chaque prélèvement, durée approximative deux minutes à chaque point de contrôle.

Impact sur les animaux

Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Sur la base des essais précliniques et cliniques précédents, nous n’anticipons pas de douleurs au réveil ni de perte de poids ou de mobilité. Cependant lors de l’expérimentation des douleurs liées à l’application prolongée de la sonde d’imagerie dans l’espace intercostal sont possibles. Certains patients ont également rapporté une douleur lors de l’émission des ultrasons thérapeutiques qui cesse dès l’arrêt de l’émission.

Devenir

A l’issue de la thérapie, les animaux seront maintenus en vie pour observation et suivi à un mois afin de détecter d’éventuels effets indésirables de notre thérapie. Après le suivi à un mois, les animaux seront mis à mort afin de procéder à une analyse anatomopathologique permettant de détecter d’éventuels effets indésirables de notre thérapie, non détectables par les méthodes non-invasives (échocardiographie) ou minimalement invasives (prélèvements sanguins) mises en œuvre avant la mise à mort.

Remplacement

L’application de notre thérapie in vitro (sur tissus statiques) a déjà été réalisée à de multiples reprises. Nous devons travailler sur le vivant car le mouvement cardiaque et l’obstacle produit par les tissus thoraciques sont les principales difficultés pour l’application de cette technologie, et la réaction des tissus traités sur un mois n’est pas modélisable in silico ou in vitro. De plus, il va être crucial de démontrer l'innocuité (in vivo) de notre thérapie avec la version 2 de notre dispositif chez l’animal à moyen terme pour pouvoir ensuite l’appliquer sur la cardiopathie valvulaire humaine. Enfin, il est important d’évaluer les effets potentiellement indésirables de notre thérapie ce qui n’est possible que in vivo et de vérifier l’activité cardiaque à court et moyen terme (par échocardiographie et biochimie sanguine) avant d’utiliser notre dispositif sur l’homme avec une durée de thérapie plus longue que celle actuellement autorisée. Pour analyser et interpréter notre expérimentation, nous avons deux nécessités : 1) rendre l’expérimentation possible, donc il nous faut un animal d’un poids suffisant, avec une fenêtre de thérapie accessible ; 2) obtenir des résultats extrapolables à l’homme, donc avoir accès à une anatomie comparable aux caractéristiques humaines en effet la profondeur de la valve aortique de porc est de 5 à 10 cm, correspondant à celle de l’homme et c’est un animal qui présente une grille costale comparable à celle de l’homme également. Cela permettra de tester un dispositif identique à celui qui sera utilisé sur les patients. Une des limites actuelles de notre technologie est la taille de notre zone thérapeutique (5 à 10 mm). Travailler sur des animaux plus petits nous exposerait à une difficulté de précision de thérapie et une impossibilité d’extrapoler à l’humain les résultats obtenus.

Réduction

La vérification de l’innocuité de notre thérapie avec notre nouveau prototype d’investigation clinique, sera effectuée dans les mêmes conditions qu’avec la version précédente : 80 minutes de thérapie sur porcs sains, groupe de 15 porcs avec un suivi d'un mois après thérapie par ultrasons. La vérification du deuxième objectif sera réalisée sur 15 porcs exposés à une durée de 105 minutes de thérapie avec un suivi d'un mois après thérapie par ultrasons. Les améliorations d’usabilité de notre dispositif version 2 doivent faire l’objet d’évaluations formatives et sommatives afin de satisfaire les exigences de la Food and Drug Administration (FDA), troisième objectif de cette étude. Dans le cadre des 3R et en particulier de la Réduction, les animaux utilisés pour les deux premiers objectifs permettront de valider et documenter l’usabilité de la nouvelle version de notre dispositif, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de 30 animaux en deux groupes de 15 est légitime pour garantir la preuve de concept sur une série (Réduction). Nous nous basons en particulier sur notre étude précédente ayant permis de détecter à l’histologie des effets microscopiques sur la valve de 5 des 16 porcs traités. Travailler sur plus d’animaux n’aurait pas d’intérêt scientifique. Travailler sur moins d’animaux nous exposerait au risque de ne pas aboutir à la preuve de concept, donc de sacrifier inutilement. Une étude statistique sera réalisée avec des tests adaptés afin d’évaluer les effets du traitement sur l'insuffisance aortique et la surface valvulaire pour chaque groupe. De même ces tests seront appliqués pour les évaluations de biochimie sanguine.

Raffinement

Toutes les manipulations chez l’animal seront sous anesthésie générale et analgésie, pour une pénibilité minimale. Sur la base des essais précliniques et cliniques précédents, nous n’anticipons pas de douleurs au réveil ni de perte de poids ou de mobilité. Une fois anesthésiés, les animaux sont intubés et placés sous ventilation contrôlée. Après réveil, les points limites seront basés sur l’examen visuel: état de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; émaciation prononcée et atrophie musculaire ; difficultés respiratoires (sifflements, râle, respiration rapide); position anormale (dos voûté, couché sur le côté); et réduction de la mobilité (faiblesse, incoordination, tremblements, paralysie). Si ces signes sont observés, le vétérinaire (qui effectue aussi une visite par semaine) déterminera la procédure à suivre: - soit analgésie dont le traitement sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours -soit euthanasie, sous anesthésie et analgésie. Une alimentation en poudre est administrée afin de faciliter la déglutition suite à l’intubation. Hébergement en cage individuelle, des jeux (boule avec granule, jeux de mordillements) sont fournis.

Choix des espèces

Pour analyser et interpréter notre expérimentation, nous avons deux nécessités : 1) rendre l’expérimentation possible, donc il nous faut un animal d’un poids suffisant, avec une fenêtre de thérapie accessible ; 2) obtenir des résultats extrapolables à l’homme, donc avoir accès à une anatomie comparable aux caractéristiques humaines en effet la profondeur de la valve aortique de porc est de 5 à 10 cm, correspondant à celle de l’homme et c’est un animal qui présente une grille costale comparable à celle de l’homme également. Cela permettra de tester un dispositif identique à celui qui sera utilisé sur les patients. Une des limites actuelles de notre technologie est la taille de notre zone thérapeutique (5 à 10 mm). Travailler sur des animaux plus petits nous exposerait à une difficulté de précision de thérapie et une impossibilité d’extrapoler à l’humain les résultats obtenus. Nous travaillerons sur des cochons jeunes adultes de 14 à 16 semaines d’âge car leur poids compris entre 45-55 kg permettra de tester la faisabilité de notre thérapie ultrasonore sur une anatomie similaire à l’homme.