Tests réglementaires

Sensibilisés à l'ovalbumine ou au pollen d'ambroisie puis exposés à l'allergène dans l'œil, 3 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Gonflement de la conjonctive, rougeur et larmoiement sont les effets attendus, auxquels s'ajoutent des nodules sous-cutanés au site d'immunisation, des injections péri-oculaires sous anesthésie légère et des prélèvements sanguins. Le porteur souligne que les examens ophtalmologiques employés se pratiquent chez l'être humain en cabinet et chez les autres animaux en clinique vétérinaire, sans anesthésie ni hospitalisation. Environ 360 animaux écartés du protocole pour un défaut anatomique de l'œil détecté avant l'induction de la maladie pourront être réutilisés ailleurs, les 3 240 autres sont tués pour analyses.

Objectifs

Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris ou le rat. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les nuisances attendues se manifesteront au niveau local après le challenge par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (pour administrer les anesthésies également). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues se manifesteront au niveau local après le challenge par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes, puis l’animal est replacé dans sa cage d’hébergement. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme. En dehors de ces périodes d’examen ou d’administration de traitement, l’animal est libre de ses mouvements, avec un accès à l’eau et à la nourriture. Lors des prélèvements de sang, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode de vie de l'animal une fois l'action finie.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, pour réaliser des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de l'allergie (immunisation et/ou challenge), ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative tels que les modèles in vitro (2D, 3D, organoïdes) ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. L’allergie oculaire est une pathologie systémique impliquants plusieurs acteurs biologiques qui ne sont pas simultanément présents ou fonctionnels in vitro. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude correspondant à de jeunes adultes conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Pour vérifier qu'un candidat médicament ne perturbe pas la respiration avant son administration à des personnes, 1 200 rats, 400 souris et 200 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe six heures, jusqu'à dix, enfermé dans une chambre de plexiglas de dix-neuf centimètres de diamètre, et certains subissent d'abord une chirurgie de quinze à trente minutes pour l'implantation d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis restent isolés jusqu'à soixante-douze heures pour que leurs congénères n'abîment pas le dispositif. Les administrations peuvent se répéter deux fois par jour pendant un mois. 270 animaux pourront être réutilisés dans d'autres projets, notamment de formation, si la souffrance réelle est restée légère ou modérée, les autres seront tués pour des prélèvements terminaux ou après des effets marqués du produit testé.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidat-médicaments sur les paramètres respiratoires en utilisant la pléthysmographie de corps entier chez le rongeur vigile. Cette technique permet d'évaluer la fonction respiratoire des animaux sans les contraindre (pas d'anesthésie ni contention pendant la réalisation des mesures). Dans la majorité des cas, ce test sera utilisé dans le cadre de la pharmacologie de sécurité pour vérifier que les candidats-médicaments n'ont pas d'impact sur la fonction respiratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Si le candidat médicament doit être administré par voie intraveineuse, les animaux subiront au préalable une chirugie sous anesthésie générale afin d'implanter un cathéter dans la veine jugulaire (durée 15-30min). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Et ces animaux seront ensuite hebergés seuls après la chirurgie afin que leur congénère ne puisse pas altérer le cathéter (maximum 72h). Dans tous les cas, les animaux de ce projet devront séjourner plusieurs heures (généralement 6h, maximum 10h) dans un pléthysmographe (c'est à dire une chambre en plexiglass transparent, de 19cm de diamètre pour 11cm de hauteur) afin de mesurer leurs paramètres respiratoires. Le candidat médicament et le placebo seront administrés aux animaux par différentes voies. Dans la grande majorité des cas, le candidat médicament sera administré une seule fois. S'il doit être administré plusieurs fois, l'administration aura lieu au maximum 2 fois par jour pendant 1 mois. Cette administration nécessitera une contention légère d'environ 1 minutes (non-nécessaire en cas d'administration iv via le cathéter). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min, maximum 2 prélèvements par 24h, sur 5 jours d'affilée maximum).

Impact sur les animaux

Certains animaux pourront subir une chirurgie d'implantation de cathéter veineux qui peut induire des douleurs, qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie et un traitement analgésique. Le séjour dans un espace restraint pendant plusieurs heures peut engendrer un stress léger, qui sera réduit par une habituation préalable aux conditions expérimentales. Par ailleurs, les contentions des animaux vigiles pour administrer le candidat-médicament peuvent engendrer un stress mineur. Enfin, peuvent être envisagés en cours d'expérience des prélèvements de sang, qui induisent chez l'animal une douleur de l'ordre d'une piqure d'aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non-utilisés pour d’autres projets. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la respiration; ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact sur la fonction respiratoire, ce qu'il n’est pas possible de faire sur des cellules en culture ou organes isolés et qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces rongeur qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (i.e. 8 par groupe).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu principalement pas le recours à une procédure non-invasive sans contrainte de l'animal (pléthysmographie corps-entier). De plus, les animaux sont habitués préalablement aux conditions expérimentales. En cas de chirurgie (nécessaire pour une administration intraveineuse), le raffinement sera mis en place par un protocole anesthésique et analgésique adapté. Des points limites adpatés sont définis et le recours à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans le modèle animal de pléthysmographie sur corps entier. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Inoculées avec Erysipelothrix rhusiopathiae, les poules peuvent développer une léthargie, une perte d'appétit, parfois une septicémie et des arthrites. 180 poules domestiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour le prélèvement de leurs tissus et la mesure de la colonisation bactérienne. Elles subissent cinq à sept prises de sang, deux administrations de vaccin et une pesée hebdomadaire, dans un projet dont la finalité est de constituer le dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un vaccin vétérinaire. Le porteur justifie 30 animaux pour la première procédure et 30 pour la seconde, sans expliquer les 120 restants.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de développer un modèle d'infection expérimental pour Erysipelothrix rhusiopathiae chez la poule domestique (Procédure 1) et d'utiliser ce modèle pour évaluer l'efficacité d'un vaccin contre cette infection (Procédure 2). La Procédure 1 vise à déterminer la dose optimale qui reproduit fidèlement l'infection naturelle. La Procédure 2 utilisera les paramètres optimisés de la Procédure 1 pour évaluer l'efficacité protectrice d'un vaccin candidat contre Erysipelothrix rhusiopathiae.

Bénéfices attendus

Les études d'efficacité vaccinale réalisées chez l'espèce cible sont nécessaires au dossier d'AMM des vaccins vétérinaires. Ce projet vise à développer des vaccins chez la poule domestique contre Erysipelothrix rhusiopathiae. L'évaluation de l'efficacité protectrice permet de déterminer les conditions d'utilisation du vaccin (doses, fréquence et protocole vaccinal) afin d'utiliser les vaccins avec un maximum d'efficacité et de sécurité. Par ailleurs, le développement de vaccins efficaces permet de réduire significativement l'utilisation d'antibiotiques dans la filière avicole puisque la prévention vaccinale évite le recours aux traitements préventifs ou curatifs à base d'antibiotiques. Ces vaccins contribueront à améliorer la santé animale, réduire les pertes économiques dues aux infections à Erysipelothrix rhusiopathiae et soutenir une approche préventive durable évitant le développement d'antibiorésistance en élevage avicole. Ces infections sont connues de longue date chez les volailles, et notamment chez les poules pondeuses, mais leur incidence était extrêmement réduite par une conduite d'élevage en cage. L’abandon des cages conventionnelles au profit de systèmes alternatifs (volières, élevages au sol ou plein air), encouragé par les attentes sociétales et les pratiques en faveur du bien-être animal, s’est accompagné d’une recrudescence de l’érysipèle aviaire. Erysipelothrix rhusiopathiae est un microorganisme ubiquitaire, zoonotique et commensal de nombreux animaux et est capable de persister durablement dans les sols et les matières organiques grâce à sa forte résistance environnementale. Les systèmes d’élevage alternatifs augmentent les contacts des animaux avec l’environnement contaminé, favorisant ainsi la circulation de la bactérie. La gestion actuelle de l’infection repose principalement sur les mesures de biosécurité, l’hygiène des bâtiments, la maîtrise des facteurs de stress et les traitements antibiotiques en chimioprophylaxie ou lors d’épisodes cliniques. Cependant, la persistance environnementale de la bactérie et la difficulté d’éradication limitent l’efficacité de ces approches. Dans ce contexte, le développement de stratégies vaccinales adaptées représente un enjeu majeur afin de prévenir les épisodes cliniques, réduire l’usage des antibiotiques et sécuriser durablement les systèmes de production alternatifs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des contentions pour : - Pesées: animal placé dans un seau pendant environ 1 minute une fois par semaine. - Prises de sang (au minimum 5 et au maximum 7), préleveur assis avec l'animal sur ses genoux; Durée attendue de la contention: environ 2 minutes. - Administration de l'inoculum (une administration), du vaccin (deux administrations) ou pour euthanasie chimique: animal tenu en contention par un animalier; Durée attendue de la contention: environ 30 secondes

Impact sur les animaux

Les injections de l'inoculum et des vaccins peuvent provoquer une douleur transitoire minimale au site d'injection. L'infection expérimentale peut provoquer des signes cliniques incluant léthargie et perte d'appétit, parfois septicémie et arthrites, qui seront surveillés quotidiennement. Les prélèvements sanguins répétés (5 fois pour la Procédure 1, 7 fois pour la Procédure 2) et la contention associée provoquent un stress mineur et transitoire; le volume prélevé ne doit pas avoir de conséquences sur la santé des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés pour ce projet sera euthanasié pour prélèvements tissulaires nécessaire au projet (colonisation tissulaire de la souche bactérienne).

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative validée pour remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet. L'évaluation de l'infection à Erysipelothrix rhusiopathiae et de l'efficacité vaccinale nécessite un modèle animal intégrant les interactions complexes entre l'agent pathogène, le système immunitaire et la physiologie de l'hôte. Les modèles in vitro ou les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la réponse immunitaire systémique, la dissémination de l'agent pathogène dans les organes, et l'évaluation clinique de la protection vaccinale. La poule domestique constitue l'une des espèce cible naturelle pour cette infection et représentent le modèle le plus pertinent et éthiquement justifié. D'autre part, la législation actuelle impose l'utilisation de l'espèce cible pour le développement de vaccins.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour assurer la validité statistique tout en minimisant l'utilisation d'animaux. Pour la Procédure 1, 30 animaux (3 groupes de 10) permettront de comparer trois doses de challenge et d'identifier la dose optimale avec une puissance statistique adéquate. Pour la Procédure 2, 30 animaux (2 groupes de 15) doivent fournir une puissance statistique suffisante pour détecter une différence significative d'efficacité vaccinale. Ces effectifs sont basés sur les publications existantes. L'approche séquentielle (Procédure 1 conditionnant la Procédure 2) optimise l'utilisation des animaux en s'appuyant sur les résultats de la première étude. A ce titre, il est possible que le nombre d'animaux nécessaire pour mener à bien la procédure 2 soit modifié, à la hausse comme à la baisse.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre pour minimiser la douleur, la détresse et le stress. Utilisation d'animaux EOPS permettant de réduire les variables confondantes et d'améliorer, voir de standardiser la réponse à l'inoculation et/ou à la vaccination. Période d'acclimatation d'au moins une semaine avant le début des procédures. Surveillance clinique quotidienne avec critères d'arrêt prématuré (points limites) pour prévenir la souffrance excessive. Logement en groupes dans des conditions enrichies respectant les besoins comportementaux et la directive 2010/63/UE pour les surfaces par animal (taille minimale du compartiment, densité, couchage, accès à l'aliment et à l'eau, etc.). Techniques de contention et de prélèvement réalisées par du personnel experimenté pour minimiser le stress. Euthanasie réalisée selon les méthodes recommandées pour assurer une mort rapide et sans douleur. La SBEA pourra être impliquée sur ces points.

Choix des espèces

Dans le cadre du développement des médicaments vétérinaires (essai réglementaire ou étude pilote), l’étude doit être menée sur l’espèce cible du produit à tester. Dans le cas de ce projet, la poule domestique (Gallus gallus domesticus). Les animaux seront utilisés au stade juvénile/jeune adulte: 6-9 semaines d'âge pour la Procédure 1 (développement du modèle d'infection) et 3 semaines d'âge au début de la Procédure 2 (évaluation vaccinale, avec utilisation jusqu'à 12 semaines d'âge). Ces âges correspondent aux périodes de susceptibilité maximale à l'infection (inoculation) et aux tranches d'âge cibles pour la vaccination en conditions pratiques.

Jusqu'à 23 injections et des prélèvements de sang atteignant 80 millilitres par animal : 150 chevaux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole immunise les animaux pour produire du plasma riche en anticorps, revendu comme traitement par une société de bio-défense, l'adjuvant employé pouvant provoquer nodules, abcès et granulomes douloureux au point d'injection. Le projet cherche justement un adjuvant moins réactif, tout en maintenant des taux d'anticorps élevés. Les chevaux ne sont pas tués : 100 sont réutilisés et 50 placés à l'adoption, selon les besoins de la structure.

Objectifs

La société impliquée est spécialisée dans les traitements contre des pathogènes (dont les maladies infectieuses émergentes et sévères) et les intoxications. Elle a déposé récemment une demande d’autorisation de mise sur le marché pour un produit dans le domaine de la bio-défense/menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). La société capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme est issue de procédés développés à l’origine par une autre entreprise et licenciés à la société actuellement dépositaire du brevet. Elle s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps. Le protocole d’immunisation comprend une série d’injections selon un calendrier qui optimise la production d’anticorps spécifiques de l’antigène, avec des titres les plus élevés possibles. Lorsque les titres maximaux sont obtenus (phase dite de « plateau »), le sang est prélevé dans des poches de grand volume contenant un anticoagulant, et il est ensuite traité pour obtenir du plasma. Les plasmas individuels sont poolés et utilisés pour purifier les immunoglobulines équines et obtenir les fragments qui constituent le produit thérapeutique final. Le projet vise à optimiser le protocole d’immunisation en identifiant un adjuvant et un schéma d’immunisation permettant d’améliorer l’innocuité tout en maintenant l’efficacité (fort taux d’anticorps). Cette optimisation du protocole s’accompagne de la recherche de marqueurs biologiques pertinents permettant de quantifier voire prédire la réaction inflammatoire potentiellement induite par le protocole d’immunisation.

Bénéfices attendus

Les fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique sûre à des problématiques majeures de santé publique pour lesquelles il n’existe pas d’autre solution. Il est crucial d’assurer la pérennité de la production et le raffinement des procédures permettant de les produire. Les antigènes correspondant aux cibles thérapeutiques doivent être administrés avec un adjuvant afin de stimuler la production d’anticorps spécifiques. L’adjuvant utilisé dans la technologie d’origine peut provoquer des réactions inflammatoires parfois douloureuses au site d'injection. Le projet vise à identifier un adjuvant et un schéma d’immunisation permettant de réduire ces réactions et d’améliorer le bien-être des animaux intervenant dans la production des traitements actuels et futurs. Le projet vise en parallèle à identifier un marqueur biologique prédicitf de la réaction inflammatoire induite par le protocole d’immunisation et utilisable en tant que point limite quantitatif dans toutes les procédures d’hyperimmunisation en cours et à venir.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des injections selon plusieurs modalités (sous-cutanée ou intra-musculaire). Les injections ne nécessiteront pas d’anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées maximum 23 fois par animal. Chaque injection durera environ 30 secondes. Au cours du suivi 10 prises de sang maximum par individus seront réalisées sans nécessité d’anesthésie. Les volumes prélevés allant de 10 à 80 mL (2 prélèvements de 10 mL et 8 prélèvements de 80mL) la durée de l’intervention pourra donc varier d’une minute 30 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

L’adjuvant utilisé dans la technologie d’origine peut provoquer des réactions inflammatoires parfois douloureuses au site d'injection (nodules, abcès, granulomes) pouvant altérer l’état général. Tous les adjuvants et protocoles d’immunisation qui seront testés sont définis afin de réduire significativement ces effets. Les adjuvants à tester ont été choisis sur base de leur innocuité démontrée. Tout adjuvant ou protocole ne permettant pas d’améliorer significativement l’innocuité seront arrêtés.

Devenir

Le projet comporte une seule procédure de classe modérée. Les animaux maintenus en vie pourront être réutilisés dans le cadre de procédures légères ou replacés. La réutilisation ou l’adoption seront décidées en fonction des besoins en animaux de la structure en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) dont le vétérinaire référent de la structure d'accueil des chevaux fait partie.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques et purifiées a largement démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production en grand volume d’anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo (et plus particulièrement avec des animaux de grande taille : bovins ou chevaux). Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Un maximum de 6 animaux sera utilisé pour chaque protocole d’immunisation à tester. Cet effectif est jugé suffisant pour établir une comparaison entre les réactions locales et générales induites par chaque adjuvant, l’évolution des paramètres biologiques ainsi que la quantité d’anticorps produits. Seule la première année exposera des animaux à l’adjuvant actuel connu pour créer des effets indésirables. Cette étape permettra d’avoir une référence et sa répétition non-nécessaire. Cet effectif permet également de limiter le volume de plasma à prélever sur chaque animal afin d’atteindre le volume minimal utilisable dans le procédé de purification Fab’entech.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe et observés bi-quotidiennement. Les animaux seront habitués dès le plus jeune âge au couloir de contention. Un enrichissement adapté est mis en place (hébergement en groupe, au pré dès que les conditions le permettent ou avec accès à une aire d’exercice). En cas de problème de santé, un vétérinaire diagnostique la maladie et prescrit un traitement. Le suivi santé des animaux se fait via des pesées régulières (a minima 1 fois toutes les deux semaines) et une grille d’observation et de suivi du bien-être animal est à disposition des équipes. Cette dernière leur permet d’identifier des signes d’inconfort, même en dehors des moments dédiés aux expérimentations (distribution d’alimentation par exemple). Les suivis et prélèvements sont réalisés par du personnel formé (habilitation à l’expérimentation animale de niveau 2) et connu des animaux. Ce projet met en œuvre des procédures maîtrisées qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines.

Choix des espèces

Le cheval est un animal de grande taille permettant de récolter une importante quantité importante de plasma (en respectant un maximum de 1% du poids vif). Les pathologies équines présentent très peu de risques zoonotiques, ce qui limite fortement les problématiques de biosécurité virale dans les plasmas. Le cheval est l’espèce décrite dans la technologie d’origine. La production d’anticorps polyclonaux tels que nécessaires dans la thérapeutiques humaines finales ne peuvent pas être produits in vitro. Seuls des animaux de plus de 2 ans seront inclus dans l’étude afin de travailler sur des individus dont l’immunité est pleinement acquise.

Pour mesurer le devenir de molécules pharmaceutiques dans l'organisme, 7 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent les composés par injection ou gavage, ce dernier pouvant irriter l'œsophage, et subissent des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie. Le volume de sang requis étant trop élevé pour les laisser en vie, ils sont tués juste après le prélèvement, puis leurs organes sont collectés. Le porteur décrit ce modèle comme "indispensable" et comme un prérequis réglementaire pour les dossiers soumis aux autorités.

Objectifs

Dans le cadre de nos programmes internes de maturation et de développement préclinique, nous testons au stade pré-clinique de nouvelles molécules pharmaceutiques, qu’il s’agisse de composés innovants ou de médicaments faisant l’objet d’un repositionnement thérapeutique. Pour chaque molécule intégrée dans notre pipeline de développement, des études de toxicologie, de pharmacocinétique et d’efficacité sont entreprises. La présente demande concerne spécifiquement la réalisation d’études de pharmacocinétique. La caractérisation du profil pharmacocinétique constitue une étape indispensable du développement d’un candidat-médicament. Elle permet notamment : (1) de documenter l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé ; (2) de guider le choix de la voie d’administration la plus appropriée ; (3) de définir des schémas posologiques pertinents permettant une efficacité pharmacologique tout en limitant les risques de toxicité ; (4) d’identifier les principaux métabolites issus de la biotransformation, et d’évaluer leur contribution potentielle à l’efficacité ou à la toxicité. En phase de recherche préclinique, ces données ne peuvent être obtenues qu’au moyen de modèles animaux, avant toute administration du candidat-médicament chez l’Homme. Elles constituent par ailleurs un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Dans le cas du repositionnement de médicaments déjà autorisés, en particulier lorsqu’un changement de voie d’administration, de formulation ou d’indication est envisagé, l’établissement ou l’actualisation du profil pharmacocinétique est également nécessaire afin de garantir la sécurité et la pertinence du développement. Ce projet a donc pour objectif de déterminer le profil pharmacocinétique de différents composés, afin d’éclairer les décisions de poursuite, d’adaptation ou d’arrêt de leur développement préclinique. Cette évaluation s’appuiera sur deux modalités expérimentales complémentaires : une étude après administration unique, et une étude après administrations répétées, réalisées chez le rat ou la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer le profil pharmacocinétique d’un composé avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements, d’adapter le schéma posologique, et de répondre aux exigences des agences réglementaires, fournissant un préalable nécessaire à toute expérimentation ou commercialisation chez l’humain. À court terme, ce projet générera des données quantitatives sur l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination des composés étudiés. Ces informations permettront d’orienter rapidement les décisions internes concernant la sélection, l’optimisation ou l’arrêt du développement de candidats-médicaments, contribuant ainsi à une utilisation plus rationnelle des ressources scientifiques et animales. À plus long terme, les connaissances acquises participeront à l’amélioration des stratégies de développement des médicaments, notamment en optimisant la sélection des doses et des voies d’administration, et en réduisant les risques d’échec lors des phases cliniques. Ces avancées bénéficieront indirectement aux patients, en favorisant la mise à disposition de traitements plus sûrs et plus efficaces, ainsi qu’aux acteurs de la recherche biomédicale. Ce projet contribue également à l’avancement des connaissances scientifiques en pharmacocinétique, en générant des données sur des composés de nature variée (petites molécules, peptides, biomolécules), parfois encore peu caractérisés. Les bénéfices attendus pourront être obtenus directement dans le cadre de ce projet pour les composés étudiés. Toutefois, leur valorisation complète, notamment en termes de développement clinique ou de mise sur le marché, nécessitera des étapes complémentaires (toxicologie, essais cliniques). Enfin, les résultats obtenus, qu’ils soient positifs ou négatifs, seront exploités en interne pour orienter les programmes de recherche et pourront, lorsque cela est possible, être valorisés (publications, communications scientifiques), contribuant ainsi à la diffusion des connaissances et à l’amélioration des pratiques expérimentales.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à des administrations de composés par injection ou gavage, de manière aiguë (une seule administration) ou répétée sur une durée allant de quelques minutes à environ 15 minutes par séance (temps nécessaire à la contention, l’injection et l’observation immédiate). Le nombre d’administration dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérée, cela pourra être une fois par semaine jusqu’à deux fois par jour. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés en utilisant un anesthésique au cours de l’étude afin de mesurer la concentration sanguine du candidat-médicament et/ou de ses métabolites, tout en respectant le volume maximal autorisé ainsi que le temps de récupération par animal. Chaque prélèvement dure environ 5 minutes. Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, des séances d’imagerie non invasive sous anesthésie gazeuse pourront être effectuées, avec un maximum de 5 par semaine. Chaque séance dure environ 5 à 10 minutes, incluant l’induction, la mesure et le réveil. En fonction du produit testé, de sa fréquence d’administration et de données scientifiques concernant son absorption, une mise à jeun pré- et/ou post-administration pourra être envisagée. La durée de jeûne sera limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique, généralement 12h chez la souris et 24h chez le rat, et l’eau restera accessible.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dépendront du type d’administration employée. Ainsi, les injections peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’administration par gavage peut entraîner un inconfort, une irritation de l’œsophage et du stress lié à la contention. Les administrations répétées, quel que soit le mode, peuvent générer une appréhension de la manipulation et un stress accru. Une éventuelle mise à jeun pré- et/ou post-administration (bien que limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique) peut également être un vecteur de stress. Deux types de prélèvements sanguins pourront être effectués : d’une part des prélèvements intermédiaires réalisés sous anesthésie qui peuvent causer une douleur passagère, une petite hémorragie locale ou un stress lié à la contention ; d’autre part des prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie et analgésie, en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Les doses administrées seront choisies sur la base de la littérature et/ou des résultats d’études préalables de toxicité aigüe et/ou répétée conduites en interne de telle sorte qu’elles n’induisent pas d’effets délétères ou de souffrance chez l’animal. Cependant, selon la nature du composé testé et la fréquence d’administration, des effets indésirables systémiques modérés pourraient également apparaître, tels qu’une perte de poids, une modification du pelage ou une altération de l’état général (léthargie, diminution de l’activité, troubles digestifs).

Devenir

La quantité de sang nécessaire pour réaliser les études de pharmacocinétique est trop élevée pour laisser une souris en vie après prélèvement ; elles seront donc euthanasiées juste après prélèvement. De plus, l'euthanasie est nécessaire pour permettre une collecte des organes afin d'analyser plus avant les effets physiologiques et biochimiques ainsi que la répartition histologique du composé et/ou de ses métabolites.

Remplacement

Notre projet se focalise sur un modèle intégré d’étude de pharmacocinétique nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier et est un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Il n'existe pas de modèle alternatif reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur la pharmacocinétique du traitement. Pour les études en traitement aigu, l’analyse des données entraînera la comparaison au maximum de 64 groupes de souris (groupe contrôle négatif et groupes traitement avec jusqu’à 3 doses de produit testées ; étude chez les 2 sexes ; 8 timepoints pour chaque groupe). Pour les études en traitement répété, l’analyse des données entrainera la comparaison de 80 groupes de souris (groupe contrôle négatif et groupes traités avec jusqu’à 4 cinétiques de traitements différentes ; étude sur les 2 sexes ; 8 timepoints pour chaque groupe). Pour la conduite de ces 2 procédures chez le rat, le nombre de groupes pourra être réduits à 16 et 20 respectivement, puisque chaque animal pourra être prélevé à 4 time-points différents. Une analyse statistique sera réalisée à l’aide d’un test non paramétrique. Un nombre de 4 animaux par groupe est requis pour obtenir une puissance statistique minimale et décrire précisément l’évolution de la disponibilité systémique du composé et/ou de ses métabolites en fonction du temps et du sexe.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront le respect de l’animal ; il y aura 2 à 3 rats ou 5 à 6 souris par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, de l’imagerie non-invasive pourra être effectuée pour suivre le profil de distribution du produit, permettant d’augmenter la quantité d’informations recueillies sans dégrader le bien-être animal. Lors de l’imagerie, comme lors des administrations du produit par les voies les plus invasives ou lors des prélèvements sanguins intermédiaires (sur rats uniquement), les animaux seront anesthésiés avec un inducteur chimique ou gazeux. Lors d’une anesthésie chimique, cette dernière sera antagonisée pour favoriser le réveil et la récupération des animaux. En revanche, aucune analgésie n’est possible au cours des études, puisqu’elle pourrait modifier le profil pharmacocinétique du composé étudié. A la fin des procédures, lors des prélèvements de sang avant euthanasie, une analgésie sera cependant réalisée par l’ajout d’un collyre analgésique en plus de l’anesthésie gazeuse. Un tableau de suivi a été mis en place permettant de définir les points limites adaptés.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d'étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de pharmacocinétique en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu, alimenté par de nombreuses données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l'espèce utilisée dépendra en particulier de la molécule utilisée, des objectifs et des besoins de l'étude. Elle pourra être éventuellement testée dans les 2 espèces afin de montrer documenter une pharmacocinétique espèce-indépendante. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, à un stade de jeune adulte pour permettre de déterminer le profil pharmacocinétique du traitement sur des animaux à maturité sexuelle dont les organes et le système immunitaire sont pleinement développés.

Dix macaques à longue queue subissent une même opération de quatre heures combinant une injection dans l'œil, une dans l'oreille interne et une par voie intraveineuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous seront tués pour analyser où se distribuent les vecteurs viraux testés. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie du vitré, de décollement de rétine et de troubles de l'audition et de l'équilibre. Il justifie le recours au primate par l'échec fréquent, chez le singe, des vecteurs sélectionnés sur la souris.

Objectifs

Le projet est une étude préliminaire visant sélectionner des vecteurs viraux AAV permettant d’apporter à un type de cellule une molécule thérapeutique sensible à la lumière. Cette sélection sera faite d’après l’affinité de ces vecteurs pour les organes cibles (oreille interne, rétine, estomac, cerveau), ainsi que leur distribution dans l’organisme. L’étude sera effectuée comme une étude de toxicologie pour évaluer tout effet potentiellement toxique. La sélection sera faite après leur administration intraoculaire, dans l'oreille interne et intraveineuse au cours d’une même anesthésie chez le macaque fascicularis. Les vecteurs viraux AAV sont dérivés d'un virus non pathogène et sont couramment utilisés dans la recherche biomédicale afin de développer des thérapies chez l’humain. Ils permettent une transduction efficace de nombreux types de cellules de mammifères et une expression génétique stable après un seul traitement d’un ou plusieurs gènes, ce qui permet de compenser un déficit génétique. Les protéines sensibles à la lumière sont utilisées pour développer la thérapie optogénétique, une méthode prometteuse pour compenser la perte des cellules de la rétine ou de restaurer l’audition via des implants intra-auriculaire chez des patients atteints de surdité. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les vecteurs viraux les plus prometteurs dans le développement de thérapies optogénétiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

Il permet de sélectionner les vecteurs viraux capbles de transduire efficacement dans les différents cellules et tissus cibles pour la réalisation d’études de toxicologie règlementaire prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'environ 4h et pendant laquelle une injection dans l'oeil, une injection dans l'oreille interne et une injection intraveineuse du produit testé seront effectués successivements. Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang effectués vigiles, dans un système de contention adapté, à raison d'un par jour au maximum sur 7 jours. Le prélèvement de sang dure quelques minutes. Un prétraitement sous forme d'une perfusion pourra être effectué selon des résutlats préliminaires, d'une durée maximal de 2h. Un isolement physique pendant la durée d'observation (7 à 15 jours) après les administrations est possible, si aucun animal compatible socialement et scientifiquement n'est disponible.

Impact sur les animaux

Quatre catégories de nuisances peuvent être provoquées chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises en compte de manière préventives pour réduire leur impact. 1)Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaire mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques 2) Liées à la chirurgie : un risque de nuisance modérée pour les animaux (inflammations, douleurs opératoires et post opératoire, etc) est possible 3) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang, peut provoquer des lésions locales (hématomes) et un stress modéré des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque d’infection lors d’administration dans la cochlée ou l’œil. Enfin, dans de rares cas, l’injection intravitréenne peut entrainer une augmentation de la pression intraoculaire, hémorragie du vitré, déchirures et décollement de la rétine, inflammation intraoculaire et endophtalmie et l’administration intra cochléaire peut provoquer des troubles auditifs et de l’équilibre se traduisant par exemple par des maux de tête ou des nausées. 4) Liées à une toxicité du mélange de vecteurs testés : ce type de nuisances est difficilement estimable, mais semblent faibles selon les données scientifiques des études chez d’autres espèces. Si des effets toxiques apparaissent, ils seront liés à la biodistribution des vecteurs dont l’évaluation est le but de cette étude.

Devenir

Les animaux utilisés seront euthansiés pour procéder à une analyse de la distribution des vecteurs dans l'organisme.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce type étude, qui visent à sélectionner des variants de vecteurs viraux les plus efficaces pour poursuivre le développement de thérapies optogénétiques. Il faudra pour cela pouvoir modéliser un organisme entier, ce qui n'est pas réalisable pour le moment avec les méthodes alternatives existantes.

Réduction

L’utilisation d’un male et d’une femelle par lot est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données. L’administration successive des variants AAV chez les mêmes animaux a pour but de réduire le nombre d’animaux d’un facteur 3 à 4 (par rapport à un criblage séparé pour chaque voie d’administration), sans introduire de charge supplémentaire pour l’animal individuel. Les 3 voies d'administrations n'interfèrent pas ensemble car chaque vecteur est identifié par un code spécifique. Les principaux organes cibles sont les cellules cilliées auditives, la rétine, le cerveau et l'estomac, d’où les 3 vois d'administration.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animal est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase de suivi après l’administration. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (boîte taxi, chaise à contention). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines vétérinaires. Concernant les administrations : ce sont des voies standard en médecine humaine. Elles seront effectuées sous anesthésie et analgésie par des chirurgiens expérimentés ayant pratiqués ces chirurgies chez l’humain et différents modèles animaux. La réalisation de l’ensemble des administration en une seule anesthésie limite l’accumulation des anesthésies et permet d’évaluer à modérée le degré de sévérité. Pour l'isolement des animaux, celui ci ne serait que physique, et l'ajout d'enrichissements spécifique sera mis en place dès la phase de réveil.

Choix des espèces

Le macaque fascicularis est une espèce reconnue pour son aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de produits à visée thérapeutiques humains pour des produits thérapeutiques dont la cible est la plus proche de l’humain, ce qui est le cas pour les structures oculaires et auditives. De plus, les variants AAV sélectionnés sur des modèles murins pour ce type de thérapies se révèlent souvent peu efficace chez le primate humain et non humain, ce qui explique la nécessité de passer par un primate non humain pour les sélectionner plus finement. Il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, et jusqu'à 5 ans.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort. 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, l'infection pouvant provoquer une parésie et une perte de poids. Le projet teste de nouvelles molécules avant un éventuel essai clinique, et le porteur revendique un "besoin de générer un maximum de données" pour de "meilleures armes" contre la maladie.

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours maximum par semaine pendant 4 à 8 semaines. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de très faible volume seront effectués. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – sur un nombre restreint de souris sélectionnées. Il s’agit d’un acte rapide de quelques secondes. 4. Des prélèvements de sang seront effectués sur animaux anesthésiés juste avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend pas plus d’1 minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

20 chevaux vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance modérée, réutilisés tant qu'ils restent en bonne santé, puis tués s'ils ne peuvent plus l'être. Ils reçoivent 32 injections sur dix mois et des prélèvements de sang trois fois par semaine pendant sept mois, avec des abcès et des plaies parfois purulentes aux points d'injection. Le porteur juge ces anticorps "indispensables" et sans équivalent de synthèse, leur plasma servant à fabriquer le seul antivenin contre les vipères d'Europe autorisé en France. Ce sont des chevaux de réforme, initialement destinés à la boucherie, chacun fournissant de quoi produire jusqu'à 400 doses.

Objectifs

Chaque année dans le monde, de nombreuses personnes décèdent où souffrent de lésions irréversibles par suite d’une morsure de serpent venimeux. C’est également le cas en Europe où les vipères d’Europe enveniment à des degrés divers environ 1000 personnes. 70% des morsures conduisent à une envenimation et 150 cas sont traités par cet antivenin par an. Dans le cadre de la production de spécialités antivenimeuses, ciblant les envenimations de Vipères d’Europe, l’obtention d’anticorps spécifiques est indispensable. Afin de produire ces anticorps, des chevaux sont immunisés de manière répétée dans le but d’obtenir une quantité élevée d’anticorps dans leur sang.

Bénéfices attendus

Le bénéfice escompté est d’assurer la fourniture de cet antivenin qui est la seule spécialité antivenimeuse avec autorisation de mise sur le marché (AMM) en France. Ce produit est plus largement utilisé en Europe, en fonction des besoins. Il n’existe aucune spécialité antivenimeuse ne faisant appel à l’animal pour la production d’immunoglobulines, les anticorps polyclonaux sont très efficaces pour la lutte contre les envenimations. Un cheval permet l’obtention de 125 litres de plasma anti-vipères d’Europe soit 200 à 400 doses d’antivenimeux.

Procédures

Deux ensembles de gestes techniques sont effectués chez tous les chevaux du projet. Tous les gestes techniques sont réalisés sur le cheval vigile : → Gestes associés à la technique d’hyper-immunisation: 32 injections sont effectuées par voie sous-cutanée réparties sur 10 mois. La durée de l’injection est de 2 à 10 secondes par animal. → Gestes associés aux prélèvements de sang pour la production des plasmas: • des prélèvements de sang par voie veineuse (à la veine jugulaire) d’une durée de 10 minutes par animal sont réalisés 3 fois par semaines toutes les 4 semaines sur une période de 7 mois une fois que le titre d’anticorps spécifique a atteint le plateau maximum. Si l’hématocrite du cheval prélevé a atteint un seuil bas prédéfini avec le vétérinaire désigné, il y a ré-administration des globules rouges par voie intraveineuse d’une durée de 20 minutes par animal (technique de « plasmaphérèse ») au maximum 3 fois par semaines toutes les 4 semaines sur une période de 7 mois.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont la formation de grosseurs inflammatoires au point d’injection pouvant entrainer des abcès froids qui peuvent se résorber sans plaie, mais qui occasionnent parfois des plaies avec écoulement séreux ou purulent. Dans ce cas, des soins locaux sont dispensés. Plus rarement, on observe une gêne transitoire de la mobilité de l’encolure des animaux, dans ce cas, le vétérinaire décrit la conduite à tenir et peut suspendre un protocole provisoirement ou définitivement. Une nuisance potentielle attendue, mais rare en pratique, est la baisse d’hématocrite consécutive à la répétition dans le temps des prélèvements sanguins de volumes importants. Quel que soit le protocole, si un animal présente des signes cliniques non attendus un examen clinique est réalisé par un vétérinaire. Celui-ci peut décider de réformer l’animal.

Devenir

En fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être réutilisés en interne après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

L’état actuel de la science ne permet pas de remplacer les anticorps polyclonaux (obtenus par immunisation d’animaux) par des anticorps monoclonaux, synthétisés en bio-fermenteur. Ceci est principalement dû au manque d’efficacité de ces derniers, trop spécifiques L’effet polyclonal est largement plébiscité car il agit avec un très large spectre face aux nombreuses protéines nocives des venins.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à un minimum. Les demandes commerciales et les titres des plasmas déterminent le niveau de production et par conséquent le nombre de chevaux producteurs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés dans des box en groupes sociaux de maximum 12 chevaux fixes dans le temps présentant une aire paillée et une aire d’exercice ouvertes sur l’extérieur. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Les contacts répétés avec l’homme contribuent à l’enrichissement. Des procédures optimisées sont en place pour l’habituation des chevaux aux injections et aux prélèvements de sang pour réduire le stress lors des opérations de production. Les manipulations (injection ou prélèvement de sang) sont réalisées en présence de chevaux du même groupe, dans des installations spécifiques adaptées. Une analyse des paramètres sanguins biologiques est réalisée mensuellement et suivie tout au long de la procédure. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire qui assure par ailleurs un suivi régulier. La possibilité de poursuivre ou non le protocole est évaluée au cas par cas par le vétérinaire désigné. Des points limites sont définis.

Choix des espèces

Les équidés représentent l’espèce de choix car leur gabarit leur confère un volume sanguin circulant élevé. Les volumes prélevés sont élevés, proportionnellement à ce volume sanguin, et leur capacité rapide à reconstituer ce stock en fait l’espèce de choix. C’est une espèce qui s’adapte bien à l’humain et pour laquelle il n’existe que peu de zoonoses sur le territoire français. Les chevaux utilisés pour ce projet sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’anticorps spécifiques est optimale. Ce sont des animaux de réforme (capacité compétition, infertilité…) destinés initialement à la boucherie.

3 164 souris et 3 172 rats vont être utilisés, chacun recevant un produit chimique ou pharmaceutique presque tous les jours pendant vingt-six à cent-quatre semaines, dans des procédures classées en souffrance modérée. Ces études de cancérogénèse cherchent à prédire si une substance provoque des tumeurs chez l'humain exposé sur de longues durées. Les animaux subissent jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, prélèvements sanguins et passages en cage métabolique compris, et développent des masses tumorales surveillées jusqu'à la mise à mort finale pour analyse des organes. Le RNT affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro et justifie la durée par l'exposition prolongée visée.

Objectifs

Certaines pathologies chez l’homme nécessitent des traitements médicaux à long terme (6 mois ou plus). Les études de cancérogenèse chez le rongeur décrites dans ce projet ont été développées pour prédire le risque qu’un produit pharmaceutique/chimique induise des tumeurs chez l’homme lorsqu’il est exposé à ce produit sur de longues périodes. Elles sont réalisées lorsque les données in vitro de génotoxicité ne mettent pas en évidence un effet mutagène potentiel du composé ou lorsqu’il y a un doute sur l’effet cancérogène lié à la structure du produit à tester. Il n'existe pas d'alternative in vitro pour le moment. Ce projet se résume en l’administration répétée (souvent quotidiennement) d’un produit pharmaceutique/chimique chez le rongeur pendant une durée allant de 26 à 104 semaines. La voie d’administration est généralement celle utilisée chez l’homme (souvent orale). L’animal choisi est un mammifère rongeur, espèce recommandée dans les lignes directrices pour ce type d’étude car la durée de vie de cette espèce est compatible avec une exposition au produit sur une très longue période, permettant d'évaluer l'effet possible du produit sur l'apparition de tumeurs sur un animal âgé. A ces fins, environ une quarantaine d'organes et toutes les tumeurs observées sont examinées par un pathologiste expérimenté pour discriminer les tumeurs spontanées des tumeurs induites sur la base d'une comparaison avec les animaux contrôles, en utilisant des tests statistiques exigeant un nombre minimal d'animaux en fin d'étude, et les données historiques sont un support pour l’interprétation. Le nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet suite les recommandations des lignes directrices dans le but de détecter la survenue de tumeurs. Dans certaines situations, le design des études peut être soumis à l'examen d'autorités . Les effectifs retenus sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques afin d’interpréter les résultats.

Bénéfices attendus

L’ensemble des études du projet vise à identifier les substances chimiques ou pharmaceutiques possédant un risque potentiel dans l’apparition de tumeurs en l’administrant sur la période la plus longue possible devant correspondre en général à la durée de vie de l’espèce. Ces études permettent l’évaluation du ratio bénéfice/risque de la substance pour la santé humaine. La conduite du projet est nécessaire pour les dossiers déposés auprès des autorités avant la mise sur le marché.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection sous cutanée, intranasale ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes). La durée des études varie de 26 à 104 semaines. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) sont également possibles pour bilan hémato-biochimique par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation en amont de chaque étude (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions (intégrant la surveillance et la mesure des masses palpables) est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine. Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus peuvent correspondre à l’apparition de tumeurs (identifiées par l’examen externe du vivant de l’animal de masses) peut provoquer un inconfort de l’animal. L’évolution, la location, la taille, le nombre de ces masses font partie d’une surveillance rapprochée des rongeurs impliqués dans les études de cancérogenèse et les critères de soins/d’euthanasie sont spécifiquement associés au respect de l’animal. En effet, ces masses peuvent gêner la contention, le déplacement de l’animal ou lui procurer une douleur). D’autres effets indésirables peuvent subvenir et découler d’effets pharmacologiques et/ou toxicologiques du produit administré, à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoire liés aux procédures de prélèvements, d’administrations répétées, la contention et/ou des effets systémiques comme la perte de poids et la baisse de consommation alimentaire. alimentaire, et apparition de tumeurs en cours d’étude)] qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de cancérogenèse incluent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de futurs médicaments/produits chimiques qui vont être mis sur le marché/utilisés par l’Homme nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe peut varier en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes (souvent les 2), ajout d’animaux satellites, ajout d’une phase de réversibilité, euthanasie en cours d’étude, suivi de marqueurs spécifiques, comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées. Dans le cadre de ces études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes et des recommandations sont publiées pour aider l’analyse statistique des tumeurs observées de façon optimale mais suffisant robuste pour garantir la solidité des interprétations et des conclusions finales qui visent à classer les produits testés carcinogènes ou pas. Une réglementation parue en 2022 indique la possibilité de soumettre aux autorités de tutelle une suggestion de ne mettre en place des études sur une seule espèce.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement et un certain nombre de paramètres sont enregistrés et analysés régulièrement comme le poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité. Plus spécifiquement, l’apparition de tumeurs est approchée par l’examen des masses palpables. Toute anomalie est signalée au Vétérinaire et au scientifique qui assure la conduite de l’étude. Si un ou plusieurs points limites sont atteints, identification d’infections bactériennes ou d’autres maladies pouvant interférer avec le protocole expérimental, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences de prélèvement. Les rongeurs sont hébergés en groupe et pour certaines substances ayant une action sur le système nerveux central, une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant le démarrage de la période d’administration.

Choix des espèces

Le mammifère est choisi pour sa proximité avec les grandes fonctions physiologiques de l’Homme. Dans le cadre d’études de cancérogenèse, le rongeur en raison de sa longévité compatible avec un temps de développement / recherche des effets sur la durée de vie entière est retenu. C’est aussi une espèce dont la manipulation est pratique, communément utilisée en recherche biomédicale (recul sur les données propres à l’espèce publiées dans la littérature), et requise au plan réglementaire sur un plan international. Des animaux adultes et des deux sexes sont utilisés.