Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Évaluation des effets de différents produits sur la fonction cardio-vasculaire par télémétrie et sur le comportement chez le primate non humain vigile
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Macaques rhésus : 12
Pour mesurer les effets de candidats médicaments sur la fonction cardiovasculaire, 84 macaques, soit 72 macaques à longue queue et 12 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit l'implantation chirurgicale d'un émetteur de télémétrie, puis reçoit les produits par différentes voies, avec des prises de sang et, le cas échéant, des tests "neuro-comportementaux" que le porteur ne détaille pas. Il compte parmi les bénéfices attendus, pour les macaques eux-mêmes, des "outils de raffinement de plus en plus adaptés". Tous sont destinés à être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire, y compris un projet "sans réveil", c'est-à-dire mené sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardio-vasculaires chez le primate non-humain vigile en utilisant la télémétrie, méthode d'enregistrement de différents paramètres permettant de laisser l'animal totalement libre de ses mouvements dans la volière pendant les mesures.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire . Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (le primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.
Procédures
Dans ce projet une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté sera réalisée sur les animaux. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. Les animaux auront également des administrations de produits par différentes voies ainsi que des prélèvements de sang. Des tests neuro-comportementaux pourront également être réalisés.
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.
Devenir
Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non humain car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces de non-rongeurs adaptée à ce type de modèle.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • l'utilisation de la technique de télémétrie permettant de recueillir des informations sans manipulations animaux, •la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le primate non humain est, pour certains candidats-médicaments, l’espèce animale la plus adaptée car la plus proche de l’homme en termes de métabolisme et d’exposition. Le système cardiovasculaire du primate non humain est également très proche de celui de l'homme, donc les effets observés sont plus facilement extrapolables. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Etablissement d’un modèle de maladie rénale chronique (MRC) chez le chat.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
150 chats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 50 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Une maladie rénale chronique leur est induite par un agent viral, avec prises de tension, prélèvements d'urine par cystocentèse et de sang répétés, avant mise à mort pour analyse des reins. Le porteur énumère les atteintes possibles de la maladie induite, de l'anorexie à l'anémie, tout en affirmant vouloir empêcher l'atteinte d'un stade sévère par des points limites. Le modèle doit servir à tester de futurs médicaments chez le chat et à éclairer la maladie humaine.
Objectifs
Le projet a pour objectif la mise au point d’un modèle félin de maladie rénale chronique chez le chat, représentatif de la pathologie dans son développement réel. A terme, le modèle pourra permettre l’évaluation de l’efficacité et de l’innocuité de candidats médicaments dans la prise en charge des MRC félines.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet repose sur la mise au point d’un modèle de MRC peu invasif et reproductible chez l’espèce cible (chat), permettant d’induire des changements rénaux identiques à ceux d’une maladie rénale chronique chez l’animal sain. La mise au point de ce modèle pourra permettre, par la suite, d’investiguer de nouveaux candidats médicaments ayant une action au niveau des mécanismes pathogéniques, afin d’améliorer la qualité de vie et d’allonger l’espérance de vie chez les chats atteints de MRC. L’établissement d’un modèle de MRC chez le chat pourra améliorer notre connaissance du développement et de la pathophysiologie de la MRC chez l’homme. Le succès d’un modèle de MRC chez le chat ouvre aussi la voie à l’investigation de nouvelles modalités de prise en charge des fibroses rénales, néphropathies et maladies rénales chroniques chez l’humain.
Procédures
Les animaux issus du groupe test et contrôle positif ou du groupe contrôle si placebo subissent une administration de l'agent viral pour induction MRC ou placebo. Cet acte technique est pratiqué sous anesthésie générale en intra-veineux une fois au début de l'étude. Tous les animaux ont une prise de la tension arterielle en vigil à l'aide d'un bracelet et doppler à la queue. Cet acte technique est répété 1 à 4 fois par mois si nécessaire tout au long de la procédure expérimentale. Tous les animaux ont des prélèvements d'urine en vigile ou durant l’anesthésie. Cet acte technique est pratiqué en cystocentèse (sous échographie, si nécessaire) 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire tout au long de la procédure. Tous les animaux ont des prélèvements sanguins en vigile ou durant l’anesthésie. Cet acte technique est pratiqué à la jugulaire 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire (prélèvement maximal de 15% du volume circulant sur 28 jours en cumulé) tout au long de la procédure expérimentale. Tous les animaux ont des examens physiques complet en vigile 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire tout au long de la procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
L’objectif du projet étant la mise au point d’un modèle félin de MRC, les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont ceux d’une MRC, à savoir : - Lésions associées à la maladie rénale chronique, par exemple : fibrose rénale, inflammation tubulointerstitielle. - Répercussions extrarénales d’un dysfonctionnement rénal : • Azotémie et urémie, pouvant se traduire cliniquement par : de l’apathie, de l’anorexie, un amaigrissement, des ulcérations des muqueuses, de la déshydratation, de l’apathie, des troubles digestifs (vomissements, diarrhées ou constipation), des signes nerveux, du ptyalisme, une polyurie-polydipsie (liste non exhaustive). • hypertension systémique pouvant impacter différents systèmes (ex : système nerveux central, cardio-vasculaire, oculaire), • protéinurie rénale persistance pouvant se traduire par des signes cliniques (ascite, œdèmes périphériques) correspondant au « syndrome néphrotique » • Perturbation des fonctions rénales et par conséquent des paramètres biochimiques et hématologiques : o diminution de l’excrétion de créatinine, de sulfates o diminution de l’excrétion de phosphate et de la synthèse de calcitriol, pouvant conduire à une hyperparathyroidie secondaire rénale entraînant des signes cliniques ou augmentation de la kaliémie entraînant des signes cliniques (ex : troubles cardiaques) o perturbation de l’équilibre acido-basique (acidose métabolique) o diminution de la production d’érythropoïetine pouvant mener à une anémie o dépression immunitaire • Modifications de la volémie Cependant, la durée de la procédure étant limitée, il n’est pas attendu de voir l’ensemble de ces signes cliniques et/ou des signes de sévérité importante. Les points limites, établis sur la base d’un suivi clinique attentif et paraclinique, visent à empêcher toute atteinte d’un point sévère.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques des tissus rénaux, pour évaluer la pertinence du modèle à induire des modifications rénales semblables à la MRC. Les changements structurels rénaux pourront aussi être évalués par une analyse macroscopique.
Remplacement
Les MRC sont le résultat de phénomènes dynamiques entrainant l’altération progressive et irreversible de la fonction rénale, avec des répercussions extrarénales importantes et délétères. La mise au point d’un modèle in vivo s’avère indispensable, afin d’améliorer la compréhension de la maladie et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments non seulement sur le rein, mais également sur les répercussions des MRC sur les autres organes et sur l’organisme. La capacité du TGF-β sur l’induction de modifications fibrotiques rénales a été évaluée in vitro et in vivo. Le tropisme de FeMV pour les cellules rénales a déjà été démontré in vitro et in vivo. Les FeMV recombinant exprimant TGF-β auront montré une capacité d’expression de TGF-β in vitro. L’évaluation finale des candidats médicaments sélectionnés sur un modèle vivant de MRC reste indispensable pour apprécier leur efficacité et/ou leur innocuité dans le cadre d’une maladie dégénérative complexe, d’où la nécessité de disposer d’un modèle de MRC félin. De plus, des données d’efficacité et d’innocuité sur l’espèce cible doivent être fournies dans les dossiers réglementaires.
Réduction
Dans la perspective de réduction, les effectifs sont évalués au plus juste (historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre de chats utilisés tout en garantissant une approche rigoureuse et ceci afin d’éviter le risque d’études non conclusives. Une recherche de littérature non systématique a montré que les groupes se constituaient de 4 à 21 chats (5; 6; 7) dans les modèles antérieurs de CKD. Lorsque le statut des animaux le permet, les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par un vétérinaire, seront réutilisés
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. La durée optimale est de 7 jours pour des chats provenant de fournisseurs référencés. Des points limites spécifiques ont été définis afin de limiter le plus précocement possible la douleur des animaux. Ces critères sont en constante évolution pour les améliorer afin de réfleter au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est compétent pour identifier des signes d’inconfort ou de douleur. Une anesthésie et une analgésie peuvent être réalisées lors de certains actes si nécessaire. Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements : - Des opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal. - En cas d’administration et/ou de prélèvements douloureux ou répétées, ou pouvant entrainer un stress important, une anesthésie et/ou une analgésie peuvent être réalisées - La zone de prélèvements peut évoluer - Les animaux sont entrainés à la contention et aux méthodes de prélèvement afin de réduire le stress et l’inconfort lors de la réalisation des actes techniques. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Les chats ont à disposition des méthodes d’enrichissement adaptées afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Le développement d’un modèle spécifique pour les MRC félines est nécessaire pour l’étude de ces maladies et les études d’efficacité et/ou d’innocuité de médicaments candidats sur l’espèce cible. Des jeunes chats et des adultes seront utilisés. Les 2 catégories d’animaux peuvent être utilisés pour parvenir à mettre au point un modèle fiable. Les maladies rénales chroniques affectent les chats adultes.
Etudes de toxicologie de la reproduction avec observations post-natales longues chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 57566
71 086 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par gavage quotidien, les femelles subissent des lavages vaginaux et les petits nés sont suivis jusqu'à l'âge adulte, avant mise à mort pour examen des organes. Le porteur présente ces tests de toxicité sur la reproduction comme "indispensables" et "nécessaires" réglementairement pour la mise sur le marché de produits. Les effets attendus incluent des atteintes de la gestation, de la mise-bas et du développement des descendants.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché ou d'enregistrement d'un produit et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).
Bénéfices attendus
A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.
Procédures
Les animaux (adultes principalement, parfois des juvéniles) sont traités, le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle, observations ophtalmologiques, mesures de pattes, évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. Le produit administré peut cibler chaque phase du cycle de reproduction. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les procédures et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés à l’âge des animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage, tube de contention). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation, etc.
Choix des espèces
Bien que le rat soit l’espèce la plus fréquemment utilisée, le rat et la souris sont des espèces de choix car : - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits générés par gestation, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).
Modèle experimental de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 3300
Lapins : 3300
9 900 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Une sécheresse oculaire leur est induite par instillations répétées, pose de patchs, pompes osmotiques sous-cutanées ou ablation chirurgicale des glandes lacrymales, avant mise à mort pour analyses. Le porteur décrit picotements, brûlures et sensibilité à la lumière comme nuisances attendues. Les modèles doivent servir à tester de futurs traitements, dont l'efficacité reste à démontrer.
Objectifs
L'objectifs de ce projet est de pouvoir proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire plus fréquente chez les femmes, les personnes âgées et qui concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien représentés et décrits dans la littérature. Nous en avons sélectionné 3, parmi les plus référencés, les plus efficaces en terme d’impact sur la surface oculaire et la diminution de la sécrétion de larmes et les moins contraignants pour l’animal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleurs conditions possibles et dans le respect du bien-être animal.
Procédures
Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie transdermique (pose de patchs dermiques), sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Dans certains cas, comme la pose de pompes osmotiques en sous cutanée ou l'ablation des glandes lacrymales extra-orbitales situées juste sous la peau, une petite chirurgie unique dont la durée n'excèdera pas cinq minutes sera nécessaire. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur les recommandations du Gircor et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux ou bien encore une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme. L'administration en sous cutanée ou en transdermique pourra occasionner une petite inflammation avec l'apparition de rougeurs sans conséquence majeure.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, ELISA...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (cornéen, rétinien, vitréen, vasculaire, nerveux...) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. l'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans l'études auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 3 jours minimum.
Etudes d’innocuité d’un médicament destiné au chat
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
225 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart (215) tués et un petit nombre réutilisés ou adoptés. Ils reçoivent des administrations répétées d'un vaccin, des prélèvements de sang et des écouvillons, et sont euthanasiés quand un prélèvement terminal ou une nécropsie est requis. Le porteur présente ces tests comme une exigence réglementaire d'évaluation de l'innocuité sur l'espèce cible. Il affirme que les essais in vitro ne peuvent pas se substituer aux études sur l'animal vivant.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un vaccin sur le chat ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement, humains).
Bénéfices attendus
Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des vaccins présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux.
Procédures
Administrations de produit : 1 à 4 administrations sur une durée de 2 à 16 semaines. Cet acte peut être effectué sous anesthésie selon la sensibilité de l'animal. L'acte technique a une durée de 1 à 2 minutes. Prélèvements sanguins : 1 à 10 prélèvements sur la durée de l'étude. L'acte a une durée de 1 à 2 minutes. Des écouvillons (conjonctival ou pharyngé ou salivaire, nasal ou rectal) peuvent être effectués en fonction de l'objectif de l'étude. 0 à 10 écouvillons sur la durée de l'étude. Cet acte technique est inférieur à 1 minutes
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide, moins douloureuse et moins traumatisante. La répétition des administrations et des prélèvements sur le long terme peut occasionner une douleur de quelques minutes.
Devenir
Les animaux, sur lesquels un prélèvement sanguin terminal ou une biopsie post-mortem du site d’injection ou une nécropsie est requis(e), sont euthanasiés. Les animaux dont les points limites sont atteints sont euthanasiés pour raison éthiques. En fonction des études antérieures et si leur statut le permet, les animaux peuvent être utilisés dans d’autres projets. En fonction du produit administré et de l’état de l’animal et si les circonstances le permettent (acquéreur sérieux, bonnes conditions d’accueil après examen du candidat par la SBEA), les chats peuvent être adoptés. La réutilisation et l'adoption de l’animal est de la responsabilité du vétérinaire désigné qui évalue le bien-être des animaux à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’innocuité doit être réalisée sur l’animal. La diffusibilité, la persistance et l’intégration de l’agent vaccinal doivent être réalisées dans l’organisme cible pour que les conclusions soient valides. Il s’agit d’exigences réglementaires. Les essais in vitro et in vivo sur des espèces alternatives permettent d’obtenir des informations complémentaires et prédictives, mais ne peuvent se substituer à des études in vivo sur l’espèce cible. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible ne disposent pas toute d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à limiter les études non conclusives. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour chaque étude une période d'acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal peut être envisagée lors de certains actes, ainsi qu’une alternance des zones ou site de prélèvements lorsque cela est possible. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur l’espèce cible est une exigence règlementaire. Le chat est l’espèce cible pour le produit testé. Les chats utilisés ont entre 8 et 104 semaines. L’âge dépend des besoins pour les études d’innocuité et de diffusibilité qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du vaccin mis sur le marché et des exigences des autorités.
Etude d’immunogénicité, protection et suivi en stabilité d’un vaccin universel contre la grippe chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent deux injections dans la patte sans anesthésie, et 30 % d'entre elles sont infectées par la grippe par voie nasale sous anesthésie, l'infection pouvant provoquer une perte de poids, les souris atteignant -20 % de leur poids étant alors mises à mort. Le projet vise à tester un candidat-vaccin ciblant la nucléoprotéine du virus et à contrôler des lots destinés au marché humain. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro ne peut reproduire la réponse immunitaire et que le modèle souris est imposé par les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aiguëe, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux qui circulent dans toutes les régions du monde. On estime à un milliard le nombre de cas, à 3-5 millions le nombre de cas graves et entre 290 000-650 000 le nombre de décès liés à la grippe dans le monde. Des pandémies de grippe surviennent occasionnellement en plus de la grippe saisonnière annuelle, avec un impact sanitaire et économique considérable. La vaccination est la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle fonctionne en induisant des anticorps spécifiques à la souche de grippe circulante, visant à cibler les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins sont partiellement efficaces : 32% pour les personne âgées et 43% sur les adultes en raison du fait que les souches virales en circulation mutent tous les ans. Pour pallier la mutation des protéines de surface, les vaccins sont reformulés chaque année. Cependant, le virus de la grippe possède également une protéine contenue à l’intérieur de l’enveloppe virale, la nucléoprotéine (NP), qui diffère peu d’une souche à l’autre, ce qui fait d’elle une cible pertinente pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. Ainsi un vaccin qui induit une réponse protectrice contre une protéine peu sujette aux mutations pourrait donc conférer une protection plus durable non seulement contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre une nouvelle pandémie et pourrait donc avoir améliorer l'efficacité du vaccin. Un candidat-vaccin, contenant la nucléoprotéine de la souche A de la grippe est capable d’induire une réponse immunitaire de type cellulaire permettant une protection contre différentes souches du virus de la grippe chez la souris. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les vaccins actuels contre la grippe, en ouvrant la voie vers le développement clinique d'un candidat-vaccin qui pourra être utilisé seul, avec un adjuvant ou en association avec les vaccins saisonniers actuellement sur le marché. Les lots de vaccins destinés aux études cliniques chez l’homme doivent subir des tests concernant leur efficacité et leur activité biologique chez la souris. Enfin il est nécessaire de procéder à des études de stabilité, afin de vérifier que le médicament expérimental sera stable pendant la période de stockage prévue de sa libération à son administration aux patients
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’améliorer l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et pandémiques actuels. Ce candidat-vaccin produira, en plus de la réponse humorale habituellement observée à la suite d’une vaccination contre la grippe saisonnière ordinaire, une forte réponse des cellules T ainsi qu’une protection de longue durée contre l’antigène le plus conservé de la grippe : la nucléoprotéine NP. Afin d’obtenir une autorisation d’essai clinique chez l’homme (Phase IIA, III), il est nécessaire de réunir suffisamment de données concernant l’efficacité et l’innocuité de ce candidat-vaccin in vivo. Une preuve de concept de l’efficacité et de l’innocuité du candidat-vaccin seul ou coadministré avec un vaccin saisonnier ou avec un adjuvant sera effectuée dans un modèle physiopathologique infectieux, c'est-à-dire après inoculation de la grippe. La production et le contrôle qualité des vaccins répondent à des normes très strictes (réglementation européenne et bonnes pratiques de fabrication) qui doivent être respectées pour la libération des lots de vaccin, la surveillance de sa sécurité et son contrôle pour une utilisation chez l’homme. Un test chez la souris, comme contrôle de l’activité biologique est imposé à la libération des lots, et également dans les études de stabilité réalisées suivant les ICH pour contrôler une potentielle évolution des vaccins au cours du temps, et dans les conditions de stockage définies (température, humidité de l'air, lumière). Le suivi en stabilité permet de définir la date limite d’utilisation du vaccin.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne). 30% des animaux seront infectés par voie intra-nasales sous anesthésie profonde (70 mg/kg de Kétamine et 9 mg/kg de Xylazine, par injection intra-péritonéale)
Impact sur les animaux
Pour les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe et le dernier etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Le geste de l'immunisation intramusculaire est très peu invasif pour l'animal. Également, les volumes injectés ne dépassent pas 50μl évitant au maximum tout type de douleur musculaire et aucune souffrance n'est attendue en réponse aux formulations vaccinales injectées. La procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, l'infection virale peut entraîner une perte de poids chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.
Remplacement
L'efficacité d'un vaccin dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire, avec un mécanisme d’action spécifique, un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, les tests de protection contre une infection virale ne peuvent être menés que par des études in vivo. Pour la procédure: Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, nous étudions et essayons de mettre en place un test in vitro qui puisse répondre aux exigences de la réglementation pour remplacer les études sur les animaux, mais cette étude est toujours en recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires dans les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe ). Des groupes de 10 souris sont nécessaires dans les procédures ( Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins ou pour l'etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) pour l’utilisation d’un test plus performant et une analyse statistique plus stricte pour la libération de lots vaccins. L’analyse et l’estimation du nombre d'animaux à utiliser se font en amont de l’expérimentation.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant une semaine au PBES. L’immunisation est réalisée par voie intra musculaire. C’est une voie permettant l’obtention d’une bonne réponse immunitaire et qui est peu invasive pour l’animal. Les animaux en expérimentation sont observés au moins une fois tous les 2 jours et ce pendant 7 jours après les immunisations. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local sera appliqué. Pour la procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, les infections virales intra-nasales sont réalisées sous anesthésie profonde. De jour 43 à jour 56 après infection les souris feront l’objet d’une surveillance régulière et seront pesées quotidiennement pendant 2 semaines, un point limite est fixé à une perte de 20% de poids du poids initial.
Choix des espèces
Une partie des réponses immunes médiées par les lymphocytes T sont initiées dans les ganglions lymphatiques, qui drainent le site de l’immunisation, et qui vont pouvoir circuler dans les divers organes lymphoïdes et certains tissus comme le parenchyme pulmonaire. Cependant, aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique de circulation. Egalement, de nombreuses études déjà réalisées sur le modèle souris avec ce pathogène permettent d'optimiser les essais en limitant au maximum le nombre d'animaux, ainsi que la souffrance de l'animal. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques. Nous allons utiliser des animaux sevrés de 6 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge là et non vieillissant.
Évaluation de la sécurité d’un traitement laser de rétinopathie sur le cristallin du lapin NZW
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.
Objectifs
Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.
Bénéfices attendus
Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.
Procédures
Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.
Remplacement
Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.
Réduction
Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.
Raffinement
Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale
Choix des espèces
D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).
Utilisation d’animaux à des fins de production de virus et bactéries utilisés comme réactifs dans le cadre de contrôles réglementaires d’activité par épreuve sur les rongeurs ou pour la production de Principes Actifs.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Hamsters dorés : 4489
8 535 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 4 046 souris et 4 489 hamsters dorés, une large part dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère (846 souris et 3 689 hamsters). Ils sont inoculés, souvent par voie intracérébrale sous anesthésie, avec les agents de la rage, de la leptospirose et de la rhinopneumonie équine, pour produire des souches virales et bactériennes servant à fabriquer et contrôler des vaccins. Le porteur décrit des symptômes installés avant le prélèvement, tremblements, paralysie et prostration, les animaux étant prélevés "au stade moribond" pour garantir la virulence des souches. Il affirme que la production est "irréalisable" in vitro et qu'il n'est "actuellement pas possible" de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Afin d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la fabrication d’un lot commercial, ce projet vise à produire des souches destinées à : - fabriquer des vaccins (lots de semences de travail) - réaliser des contrôles qualité permettant la libération de lots (souches d’épreuve) Ces tests sont réalisés pour les agents responsables de la rage, de la leptospirose, et de la rhinopneumonie équine. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.
Bénéfices attendus
Les avantages de cette procédure sont qu’un cadre réglementaire est apporté par la pharmacopée, ce qui permet la libération de vaccins sans danger pour la santé animale. Le recours à des espèces alternatives permet de ne pas utiliser les espèces cibles, dans ce projet des chiens et des chevaux. Par ailleurs, la production de souches de virus de la rage représente un risque d’hygiène et sécurité majeur pour les manipulateurs (aucun traitement existant, il y a donc danger mortel en cas de contamination). Le prélèvement au stade moribond permet d’obtenir des quantités importantes de souches suffisamment virulentes, tout en manipulant le moins d’animaux possible. L’objectif est ici de limiter au maximum le nombre d’épisodes de production de souches virales pour ne pas exposer le personnel à des risques superflus.
Procédures
Après une durée minimale de deux jours d’acclimatation, les rongeurs sont inoculés avec la souche d’intérêt. Tous les animaux sont ensuite suivis au moins deux fois par jour (et au minimum toutes les 12 heures) jusqu’à la fin de l’épreuve. La démarche expérimentale est la même pour les trois procédures expérimentales. Une anesthésie est réalisée avant l’injection des souches par voie intracérébrale
Impact sur les animaux
Les dommages liés aux tests sont une souffrance pour les animaux et une augmentation du stress due aux injections et aux manipulations par l’homme. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent afin de limiter stress et souffrance. Il y a un développement de la pathologie pour les rongeurs. Les animaux montrent les symptômes liés aux maladies infectieuses testées : la prostration, le dos voussé, les reins creusés, des tremblements et l’absence de réactions aux stimuli. Pour les maladies virales avec un tropisme pour le système nerveux : les poils hérissés, la réduction des déplacements, des tremblements, des mouvements saccadés, la parésie, la paralysie, des flancs creusés, les yeux enfoncés, des convulsions. Les animaux sont prélevés quand les signes cliniques spécifiques sont installés, attestant ainsi de la bonne virulence de la souche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
La production de souches est actuellement irréalisable sur modèles in vitro. Il faut passer par des modèles in vivo. Ces souches servent à la fabrication des principes actifs des vaccins (lot de semence de travail), et à réaliser des contrôle qualité permettant la libération de lots (contrôles d’activité par épreuve).
Réduction
Le nombre de rongeurs utilisés correspond au nombre nécessaire pour la production des lots de semences primaires, des souches d’épreuves et des contrôles les validant. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies et les plus précoces possibles sont déterminés et appliqués. Le personnel vérifie régulièrement l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des enrichissements, dans des locaux appropriés et conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Les conditions d’hébergement varient en fonction de l’espèce et de l’âge des animaux pour maximiser leur confort. Des copeaux pressés sont disposés dans la cage pour les hamsters, et pour les souris, l’enrichissement est limité à la litière et aliment afin d’éviter tout risque EHS de manipulation de l’enrichissement par l’opérateur lors des observations quotidiennes. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ces espèces ont été choisies car ce sont celles décrites pour les productions par la Pharmacopée. Pour l’épreuve rage sur souris : Il faut des souris de 14-16g pour la technique de titrage et de 4 à 5 semaines pour la production de souche et pour le test d'homogénéité-fidélité. Pour la leptospirose sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 49g, soit de 3 à 4 semaines. Pour la rhinopneumonie équine sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 49g, soit de 3 à 4 semaines. Ces stades de développement correspondent à l’âge ou au poids requis pour répondre au dossier déposé aux autorités.
« Read-out » pharmacologique par hypothermie induite et biodistribution chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs par plusieurs voies et des prélèvements de sang à la queue, l'effet étant lu à travers une baisse provoquée de leur température corporelle, pour évaluer des molécules censées franchir la barrière du cerveau. Le porteur reconnaît un risque de choc immunitaire, de réaction allergique ou de détresse cardio-respiratoire, tout en pariant sur l'absence d'effet à court terme. Les animaux sont tués par exsanguination sous dose létale d'anesthésique pour prélever sang et tissus.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde et, à l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénratives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts de recherches, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer et de proposer à terme des perspectives thérapeutiques. Le savoir-faire de la société consiste en la conjugaison de peptides vecteurs à des pro-drogues ou molécules en cours de développement, voire déjà utilisées sur le marché, mais dont l'efficacité reste insuffisante ou encore à démontrer. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès au région ou organes à traiter. La maladie d’Alzheimer est un de ces exemples de neuropathies majeures, pour laquelle aucun traitement efficace n’existe, tout comme bon nombre de pathologies périphériques ou cancers. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre des partenaires endogènes spécifiques (récepteurs cellulaires) et d'utiliser leurs mécanismes naturels de trancytoses pour traverser les barrières cellulaires, protectrices des régions et organes sensibles de l'organisme. Dans notre cas, il s'agira en priorité du passage de la Barrière HématoEncéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). Par ce principe, nous pouvons passer naturellement ces barrières et amener in situ le médicament par la technique du cheval de Troie. Un avantage considérable qui permet de concentrer les médicaments au niveau des tissus à traiter et ainsi, de potentialiser les chances de traitements. Cette demande de projet s'inscrit dans ce contexte, en développant et optimisant nos molécules-vecteurs (VHH : Domaine variable chaine lourde Anticorps) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques. Par des approches systémiques, en administration intra-veineuses ou dermiques, en sous-cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur lignée murine consanguine (C57BL/6J) et génétiquement modifiée pour un récepteur cible.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (3R : raffinement), ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. Le faible nombre d'individus et l'optimisation des tests mettent en avant l'importance et la nécessité de bien caractériser la procédure. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours de notre procédure, nous allons manipuler les animaux en vigile, ce pour toutes les administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) ou prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl). Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou injections répétées. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois. L'animal sera alors placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes de 50 µl de sang. En point final de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. Les prélèvements finaux en post-mortem (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg), aiguille 25G (‘’5/8’’ ; 0.5*16mm), environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubation relativement courts. D’une part, sur un read-out de la thermorégulation corporelle, pour valider le passage spécifique à travers la barrière hémato-Encéphalique du cerveau. D’autre part et sur les mêmes animaux, une biodistribution plus précise et quantifiable de nos VHH sélectionnés, et/ou une mesure d’efficacité, par dosage des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. Les cinétiques d'incubations (maximum quelques jours) ne suffisent pas à générer d'effets indésirables ou de conséquences physiologiques, notamment, car les conjugués administrés présentent une demi-vie relativement courte, de quelques minutes à quelques heures. Le principal risque se trouve être la réaction immunitaire aigüe et spontanée. Dans le cadre de nos recherches, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplée par de la littérature, ainsi que de notre expertise chimie et in vivo. Les composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité. Le savoir-faire de la société et les données issues de la littérature nous permettent d'anticiper les principaux risques de toxicité, couramment observés post-administration (choc immunitaire (anaphylactique) ; réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Dans le cadre de nos études, les conjugués VHH pourront être couplés à des peptides, drogues, ou autres, tel que de petits ARN interférents (siRNA). Ces derniers nous intéressent particulièrement, car leur rôle sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Notre étude, sur fond standard C57BL/6J et lignée hTfr (même fond ; cf. Annexe 2), permettra de mieux comprendre et appréhender les disfonctionnements physiologiques, sans que pour autant nos conjugués VHH n'aient, à court termes, d’effets sur la santé et le bien-être animal (3R : raffinement). Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance (cf. Procédure, annexe1 MGS), le tout accompagné d'un suivit du poids des animaux entre le début et la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
A l'issue de la procédure (biodistribution) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal ; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg). Si des problèmes ou souffrances anormales sont rencontrées en cours de procédure, alors les animaux seront immédiatement sédatés par la même solution d’anesthésique à dose létale, suivit d’un sacrifice par une dislocation des cervicales.
Remplacement
Pour mener à bien nos modèles précliniques après validation in vitro, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, modèle indispensable pour l’étude des mécanismes in situ (3R : remplacement). Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront, malgré tout, d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives (3R : remplacement et réduction).
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 3 études de 80 individus (10 groupes sur fond C57BL/6J et 10 groupes sur fond mutant hTfr), suffisant pour appréhender un effet de la sélection de conjugués sur les souris des 2 lignées. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec. Pour la partie échantillonnage et prélèvements de tissus en fin de procédure, une liste précise et déclinée sur plusieurs types de post-expérimentations, permettra d'optimiser chacune des souris, de manière qu'il n'y ait pas d'utilisation abusives et inutiles de souris. La réalisation de prélèvements intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permettra d'obtenir des données plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal (voir points limites Annexe 1 MGS), appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain (C57BL/6J et C57BL/6J hTfr), la simplicité des administrations uniques ou répétées (administration i.v. 5.5ml/kg (Aiguilles 27G (3/4 ; 0.4/19mm)) ; s.c. 10ml/kg (Aiguilles 26G (‘’3/8’’ ; 0.45*10mm)) et i.p. 10ml/kg (Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm))) sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules (cinétique de quelques heures à maximum 1 semaine), nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de chez deux fournisseurs différents.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études pré-cliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé dans la racherche en expérimentation animale, notamment par sa physiologie connue (mammifère) et relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations, l’obtention de groupes jusqu’à 6-8 individus sans trop de contraintes de stabulation. Le modèle souris est surtout préférentiel lorsqu’il s’agit de mette en place l'élevage d’une lignée génétiquement modifiée avec une (des) mutation(s) donnée(s), ou encore d'étudier de nombreux modèles de pathologies, plus facilement accessibles. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus, qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Efficacité de la Léciréline pour induire l’ovulation chez la jument, et impact sur la survenue d’une gestation à 12 jours
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 juments vont être utilisées, puis rendues au troupeau expérimental de l'établissement, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chacune subit un suivi gynécologique sur quatre cycles avec échographies transrectales quotidiennes, inséminations, injections d'induction de l'ovulation, collectes d'embryons par lavage utérin et biopsie utérine, pour tester une molécule (léciréline) déclenchant l'ovulation. Le porteur déclare "aucun" impact sur les animaux, alors que les actes répétés touchent l'appareil génital. Le bénéfice annoncé vise la filière d'élevage équin, et le porteur affirme que l'usage de juments de l'espèce de destination est "indispensable".
Objectifs
Tester l'efficacité de la léciréline (molécule analogue de la GNRH) pour l'induction de l'ovulation ainsi que son impact sur la survenue ou non d'une gestation chez la jument. Cette étude se propose de réaliser le suivi gynécologique de 40 juments durant 3 mois (avril, mai, juin), sur 4 ovulations chacunes. Chacune des juments devra subir deux inductions d'ovulation par une injection de Léciréline et deux inductions d'ovulation par une injection de gonadotrophine chorionique humaine (hCG), les ovulations 1 et 3 seront induites sur chaleur délenchée par un traitement lutéolytique (injection de Cloprosténol), tandis que les ovulations 2 et 4 seront induites sur retour en chaleur spontané. On pourra ainsi comparer l'efficacité de la léciréline à celle de la gonadotrophine chorionique humaine sur chaleurs spontanées et sur chaleurs déclenchées par un traitement lutéolytique (cloprosténol) sur 40 juments. Par ailleurs, l'impact de la molécule utilisée pour induire l'ovulation sur le taux de gestation sera évalué grâce à l'exploitation en insémination artificielle (semence fraîche) 24 heures après l'induction d'ovulation des deux cycles spontanés de chaque jument. Suite à des collectes d'embryons à 12 jours post ovulation, les effets de l'âge et de la parité de la jument sur l'embryon seront aussi déterminés.
Bénéfices attendus
Offrir à la filière élevage équin des données d'inocuité et d'efficacité d'une molécule légalement utilisable chez la jument pour l'induction de l'ovulation, selon le principe de la cascade. Améliorer les connaissances liées aux effets du vieillissement de la jument sur l'embryon
Procédures
- échographie ovarienne et utérine par voie transrectale (2 minutes par examen, examen quotidien à biquotidien du début des chaleurs au constat d'ovulation) - insémination artificielle par voie transcervicale (1 minute, 2 fois par jument) - injection intraveineuse d'induction de l'ovulation (5 secondes, 4 fois par jument) - injection intramusculaire de cloprosténol (3 secondes, 2 fois par jument) - collecte d'embryon par lavage utérin par voie transcervicale (15 minutes, 2 fois maximum) - prise de sang (10 secondes, 1 par collecte, 2 fois maximum) - biopsie utérine (5 minutes, 1 fois par jument ayant donné un embryon) - Lavage utérin pour réalisation de cytologies (en même temps que la collecte d'embryon pour les juments avec un diagnostic de gestation positif à 12 jours et 15 minutes, maximum 2 fois par jument pour celles n'ayant pas donné d'embryon).
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
Retour au sein du troupeau expérimental de l'établissement utilisateur
Remplacement
L'objectif étant de valider l'inocuité et l'efficacité de la léciréline chez la jument, cet essai clinique impose l'utilisation d'individus vivants de l'espèce de destination (cheval).
Réduction
Exploitation de 4 cycles oestraux sur chaque jument afin de réduire le nombre d'animaux impliqués. Chaque jument sera son propre témoin. Afin de réduire l'utilisation des animaux, une collecte d'embryon sera effectuée au cycle 2 et 4 si un diagnostic de gestation positif est obtenu à J12. Des tests statistiques unilatéraux seront utilisés pour tester l'hypothèse de non-infériorité clinique de la léciréline par rapport au traitement de référence (hCG) sur la survenue de l'ovulation et de la gestation. Après la vérification de la normalité des données, des modèles linéaires à effets mixtes seront effectués à l’aide du logiciel Rstudio pour analyser l’effet de l’âge et de la parité. Si les données ne sont pas normales, des tests de permutations seront effectués pour corriger la p-value.
Raffinement
Les juments utilisées pour ce protocole sont des animaux parfaitement habitués aux examens et manipulations qui leur seront imposés dans le cadre de notre étude (examen gynécologique, insémination artificielle, collecte d'embryon par lavage utérin, injection intramusculaire, injection intraveineuse, prise de sang). Elles resteront dans leur environnement habituel (en groupe) où elles seront manipulées par leurs soigneurs habituels. Les actes de suivi gynécologique seront exclusivement réalisés par un vétérinaire équin expérimenté en suivi de reproduction de la jument. Les actes d'insémination artificielle, de collecte d'embryon, de lavage utérin, de biopsie, d'injections intraveineuse et intramusculaire et de prise de sang seront exclusivement réalisés par des manipulateurs habilités (inséminateurs équins, chefs de centre ou vétérinaire).
Choix des espèces
Il s'agit d'un essai clinique chez la jument d'un médicament vétérinaire disposant d'une autorisation de mise sur le marché pour cette même indication chez la lapine et la vache. L'utilisation d'animaux femelles à maturité sexuelle, de l'espèce de destination est indispensable.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies génétiques
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 450
2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.
Réduction
Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.
Raffinement
LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.
Choix des espèces
Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.
Etudes d’efficacité d’un médicament vétérinaire par suivi de la réponse immune : évaluation chez des espèces alternatives
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Cochons d'Inde : 50
Hamsters dorés : 50
Souris, cochons d'Inde et hamsters dorés remplacent ici les chiens, les chats et les chevaux dans des études d'efficacité de médicaments vétérinaires. 150 rongeurs, 50 de chaque espèce, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués en fin d'étude après une prise de sang terminale, ou plus tôt s'ils atteignent un point limite. Ils reçoivent le produit, puis des prises de sang suivent leur réponse immunitaire pendant des études qui peuvent durer jusqu'à cinq mois, et une partie des souris sert à produire des anticorps comme réactifs de laboratoire. Le porteur justifie ce choix par le souci d'utiliser "les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse", sans dire sur quoi repose ce classement.
Objectifs
Le projet consiste à immuniser des rongeurs (espèces modèles) avec un vaccin dans le but de : - Evaluer l’efficacité d’un vaccin par suivi de la réponse immune chez l’animal. - Produire, chez la souris, des anticorps monoclonaux ou du sérum polyclonal en tant que réactifs de laboratoire
Bénéfices attendus
Les études d’efficacité permettent de connaitre le niveau de réponse immunitaire induit par le vaccin chez l’animal grâce à des paramètres évalués par des analyses de laboratoires.
Procédures
Après l’administration du produit selon les recommandations établies, les paramètres cliniques (état général, poids, température…) et la réponse immune sont suivis (prélèvements sanguins). En fonction de la bibliographie et des connaissances acquises sur les produits, les conditions d’administration du produit (site et voie d’administration, doses, nombre d’injection, et intervalle entre les injections) sont optimisées. Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. La finalité de ce projet est de mettre sur le marché des médicaments vétérinaires présentant un risque minimal et de permettre aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations. La durée des études peut aller jusqu’à 5 mois et dépend de l’objectif de l’étude, du type de produit étudié et de l’avancement du projet (étapes de recherche amont ou développement).
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide et moins douloureuse et traumatisante possible. L’administration du produit et les prélèvements sanguins peuvent occasionner un stress et une douleur légère de quelques minutes
Devenir
Les animaux font l’objet d’un prélèvement sanguin terminal et sont euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, pendant l’étude, si l’animal atteint les points limites, il est euthanasié.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’efficacité par suivie de la réponse immune doit être évaluée sur l’animal. De même, la production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux nécessitent l’utilisation de l’animal. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal est réalisée lors de certains prélèvements. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
Ces études sur rongeurs sont des modèles alternatifs pour les études sur chien, chat et cheval. Les chiffres sont donc basés sur l’expérience (études antérieures et bibliographie) et les référentiels du modèle canin, félin et équin. Cette utilisation s’applique dans le cadre des 3R afin d’utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l’angoisse ou de subir des dommages durables en préservant l’objectif scientifique et la qualité du résultat. D’autant que l’efficacité d’un produit par suivi de la réponse immune ne peut pas être testées in vitro. La production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux chez la souris est un modèle de référence largement reconnu dans la bibliographie. Les procédures utilisant des rongeurs sont réalisées après le sevrage (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues à cet âge ; il s’agit de l’âge qui offre une meilleure sensibilité pour le modèle. Ces animaux sont communément utilisés à cet âge (bibliographie, données fournisseurs agréés).