Autres tests de tolérance et d’efficacité

Pour mettre au point une prothèse mammaire biologique destinée à des femmes ayant subi une mastectomie, 10 cochons miniatures, tous des femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une lipoaspiration d'une heure, puis l'implantation sous la peau de quatre bioprothèses sous anesthésie générale, avant quinze jours d'hébergement en box individuel et jusqu'à douze pansements sur trois mois. Le porteur retient le cochon pour la ressemblance de sa peau avec la peau humaine, et des animaux de 15 à 30 kilos pour qu'ils aient assez de graisse à aspirer sans écraser les implants en position couchée. Les dix sont tués pour retirer les prothèses de leur corps.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de développer une prothèse mammaire biologique permettant une reconstruction définitive, plus sur et de meilleure qualité aux femmes touchées par un cancer du sein (cela concerne plus de 20000 femmes par an subissant une mastectomie). On éspère ainsi reconstituer un sein natif à l'image des bioorganes en cours de developpement (decellularisation-recellularisation de cœur, foie, poumons etc). Cette nouvelle méthode permettrait ainsi d’allier les bénéfices d’une reconstruction par prothèses (simplicité, pas de morbidité du site donneur, une seule cicatrice) aux bénéfices d’une reconstruction à partir des propres tissus de la patiente (définitifs et resultats plus naturels).

Bénéfices attendus

Notre projet prévoit la création d'une bioprothèse mammaire. Cette bioprothèse agirait comme un néo-sein (néo-organe) : la matrice porcine decellularisée servirait d'echaffaudage aux cellules graisseuses de la patiente pour repeupler et recellulariser ce néo- sein. On éspère ainsi reconstituer un sein natif à l'image des bioorganes en cours de developpement (decellularisation-recellularisation de cœur, foie, poumons etc).Cette nouvelle méthode permettrait ainsi d’allier les bénéfices d’une reconstruction par prothèses(simplicité, pas de morbidité du site donneur, une seule cicatrice) aux bénéfices d’une reconstruction autologue (autologues, définitifs et resultats plus naturels).

Procédures

-Lipoaspiration (1h) -Implantation de bioprothèses biologiques en sous cutané (4 par animal sous anesthésie générale en 1h) - Prelevements sanguins si besoin (une fois / semaine pendant toute l'expérience soit 3 mois) si signes d'infections/rejets/inflammation des implants -Hebergements en boxe individuel 15 jours - Pansements (après evaluation par equipe veterinaire, fréquence maximale de 3 par semaine soit 12 au total) -Explantation des implants

Impact sur les animaux

L’implantation des implants biologiques sous cutanés chez le porc pourrait entrainer des douleurs d’intensité faible à modérée ainsi qu’une limitation possible de l’activité. L’infection de site opératoire est un évènement possible. Des douleurs d'intensités faibles à modérée sont possible au site de prelevements de la graisse et d'implantation des prothèses

Devenir

Mise à mort pour explantation des implants

Remplacement

Aucune alternative non animale n’est possible à ce stade du projet. Les expériences in-vitro ont déjà été réalisés et ont permis: 1) d’évaluer les échanges gazeux à travers la membrane de derme porcins décellularisés (passage de l’oxygène selon un gradient donné); 2) de démontrer que la matrice est imperméable à la molécule de transport de l’oxygène (moléule de grande taille); 3)démontrer in-vitro une amélioration de la survie des cellules adipeuses lorsqu’elles sont en contact avec la molécule de transport de l’oxygène comparativement à des cellules seules. Notre matrice est donc perméable à l’oxygène et imperméable à la molécule de transport de l'oxygéne permettant de créer un gradient en oxygène favorable à la survie des adipocytes. Les résultats in-vitro étant en faveur de l’efficacité de notre bioprothèse, nous en sommes donc au stade pré clinique de l’expérimentation.

Réduction

Deux groupes composés de 5 animaux chacun permettront de comparer l'efficacité de la solution Adipolife dans les échanges gazeux à l'intérieur de la bioprothèse et ainsi la survie des cellules graisseuses. Le mise en place de 4 implants par animal est une stratégie de réduction du nombre d’animal. . Ces deux groupes incluent le risque d'échec (2 echecs par groupes) par infection du site opératoire, ainsi en l'absence d'échecs moins d'animaux seront utlisés (6 seulement). 3 animaux par groupes étant indispensable pour obtenir une significativité statistique.

Raffinement

Toutes les conditions nécessaires à une antalgie efficace en per et post opératoire seront mises en place. Ainsi une surveillance accrue de la douleur en post opératoire sera réalisée, ainsi qu’un contrôle quotidien des sites opératoires pour s’assurer de l’absence de réaction inflammatoire ou infectieuse post opératoire. En cas de constatation de modification comportementale des animaux, l'équipe veterinaire sera alertée et consultée afin de determiner l'attitude therapeutique à adopter. Hébergement en boxe individuel – La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Les animaux sont mis en boxe commun dès que les conditions optimums nous le permettent

Choix des espèces

En matière de recherche en chirurgie plastique et reconstructrice, l’utilisation du porc se justifie par la proximité de la peau porcine avec la peau humaine. Ainsi l’anatomie de la peau du porc est semblable à celle des humains composés de trois couches, l’épiderme, le derme et l’hypoderme. Le prelevement de tissu graisseux par lipoaspiration dans le modèle porcin est une méthode decrite, reproductible et peu douloureuse chez cet animal. Des animaux femelles mini pig Yucatan pesant environ 15 à 30 kg seront utilisés dans cette expérience, nous avons besoin d'animaux présentant un important pannicule adipeux pour réaliser la lipoaspiration mais d'un poids modéré pour ne pas altérer les implants lorsqu'ils sont en position couchées.

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Mesurer combien de nouveaux antibiotiques passent dans le liquide cérébro-spinal, en vue d'ouvrir la voie à un essai clinique : 848 souris femelles vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour analyser leur cerveau. Elles reçoivent dans le ventre un lipopolysaccharide destiné à mimer une inflammation infectieuse, puis un inhibiteur de transporteurs, puis l'antibiotique. Le crâne est rasé et la peau incisée sur un centimètre pour ponctionner cinq microlitres de liquide cérébro-spinal, avant un prélèvement de sang à la veine de la queue. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et décrit un effectif calculé "au plus juste", qui comprend 10 % de souris supplémentaires prévues en cas de mortalité.

Objectifs

Les infections bactériennes au niveau cérébral sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance des bactéries, les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, plusieurs molécules sont recommandées dans les infections cérébrales cependant ces antibiotiques peuvent présenter des effets indésirables sévères et générer des résistances bactériennes. De nouveaux antibiotiques, actifs sur les bactéries résistantes, possèdent de plus longues durées d'action et moins d'effets indésirables. Cependant, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion au niveau cérébral. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral. Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système cérébral de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

La possibilité d’usage de ces nouveaux antibiotiques pour lutter contre les infections cérébrales par des bactéries résistantes est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système cérébral de la souris pourront ouvrir les portes à un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Nous administrerons aux souris, par voie intra-péritonéale en 10 à 15 secondes : des antibiotiques, du lipo-poly-saccharide (afin de mimer une inflammation liée à une infection), ainsi que des molécules inhibitrices des transporteurs de médicaments afin d’explorer les mécanismes de passage des antibiotiques au niveau cérébral. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Cérébro-Spinal (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le liquide cérébro-spinal puis le sang seront prélevés. Pour prélever le liquide cérébro-spinal, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement d'un anesthésiant 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection d'antalgique 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipo-poly-saccharide par voie injectable en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 30 minutes après l’administration de lipo-poly-saccahride et 2 heures après l'administration de la molécule inhibitrice.

Impact sur les animaux

Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (cerveau).

Remplacement

L'utilisation des animaux est indispensable en raison des nombreux mécanismes impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte le devenir du médicament dans l'organisme ou des effets comme l'inflammation. Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système cérébral de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre minimum de points de dosage des médicaments (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le liquide cérébro spinal. Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point de dosage est nécessaire. Des analyses statistiques des résultats sont réalisées. Le nombre de 848 souris nécessaires au total (8 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Les prélèvements du liquide cérébro spinal (5µl) et du sang (200µl) se font sous anesthésie. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le liquide cérébro spinal, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale par voie injectable 10min avant prélèvement du liquide cérébro spinal. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipopolysaccharide, et les souris recevront un traitement antidouleur par voie injectable 30 minutes avant l’injection du lipopolysaccharide. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du lipopolysaccharide. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaire pour pouvoir étudier les concentrations des médicaments dans le sang et le liquide cérébro spinal.

Greffées d'une tumeur sous la peau en état vigile, mesurées trois fois par semaine, traitées par injection dans la veine de la queue puis mises à mort quand la tumeur atteint 1 500 mm3 ou se nécrose, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est immunodéprimée pour éviter le rejet des cellules tumorales humaines. Le porteur affirme que les preuves d'efficacité hors organisme vivant ont déjà été obtenues et qu'aucune alternative ne peut se substituer à la souris, les candidats médicaments visant une cible commune à la souris et à l'être humain. 928 souris sont réutilisées dans une autre procédure, et celles qui n'entrent pas en protocole sont réformées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : # La Procédure-1 permettra mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s contrôle de référence sur les meilleurs modèles de procédure-1. # La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection souscutanée ainsi que lors (2) de l’injection par intraveineuse dans la veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger).Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souches consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte. # Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Tués pour analyse des tissus dans les études d'efficacité, ou réutilisés après retrait des points de suture pour la moitié des animaux utilisés dans la formation du personnel, 500 lapins et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La paupière d'un œil leur est cousue sous anesthésie générale pendant une vingtaine de minutes, opération qui peut irriter la cornée, déformer ou faire saillir la membrane nictitante, et dont les points peuvent s'arracher au grattage, les griffes étant coupées pour l'éviter. L'objet déclaré est d'améliorer l'absorption de traitements oculaires en empêchant le clignement, une partie des animaux ne servant qu'à entraîner du personnel à ce geste. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de mimer l'œil dans sa globalité fonctionnelle.

Objectifs

La blépharorraphie est une intervention chirurgicale courante en ophtalmologie vétérinaire pour des multiples indications thérapeutiques, notamment : le soin des ulcères de la cornée ou de plaies/érosions cornéennes, le soin des œdèmes cornéens, le soin des kératites. Le but de projet sera donc celui d'effectuer cette pratique chirurgicale dans le cas où cela améliorerait l'absorption de certains traitements oculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'optimiser l'efficacité de certains traitements en utilisant la blépharorraphie, qui permettra une meilleure libération de certains principes actifs en contrant le clignement des yeux.

Procédures

La seule intervention effectuée sera la suture de la paupière (blépharorraphie) d'un seul œil (sauf dans le cas particulier d’études pharmacocinétiques à temps courts si les animaux restent endormis) effectuée sous anesthésie générale avec administration d’anti-douleurs. L'intervention aura lieu une seule fois dans chaque étude et dure environ une vingtaine de minutes. Des prélèvements de sang pourront être effectuée en cours d'étude sur animaux vigiles, en suivant les recommandations scientifiques qui détaillent le volume maximum prélevable selon le poids de l'animal suivant un temps de repos adapté.

Impact sur les animaux

La blépharorraphie est une pratique chirurgicale couramment utilisée en ophtalmologie vétérinaire et humaine, sans difficultés techniques majeures et avec d'excellents résultats. Mis à part les manipulations lors des pesées des animaux et la contention des animaux pour les observations journalières ainsi que la piqûre pour l'injection des produits anesthésiants, cette technique pourrait induire : -irritation de la cornée par contact avec les fils de suture -déformation du cartilage de la membrane nictitante -protrusion de la membrane nictitante (souvent réversible) - infection à la suite de la chirurgie (risque très faible mais présent avec tout acte chirurgical). Ces phénomènes restent rares, réversibles et indolores. La douleur de l'acte chirurgical sera soulagée par injection d'un analgésique en plus de l'anesthésie. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant (lapin) ou d'armoires chauffantes (rats) selon les espèces. Les points de suture peuvent s’enlever (grattage de l’animal, par exemple) au bout de quelques jours, mais il sera possible de les refaire sous anesthésie et sans douleur. Afin d’éviter que les animaux s’arrachent des points de suture lors d’un éventuel grattage, une coupe des griffes sera effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour analyse des tissus dans le cas des études d'efficacité des traitements. Pour la formation du personnel, la moitié des animaux seront euthanasiés pour analyse des tissus en histologie et l'autre moitié sera reutilisée une fois le retrait des points de suture effectué.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples suivant le choix du test (paramétrique ou non paramétrique). Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien- être. Les animaux auront des enrichissements adaptés. Aucun examen invasif ne sera réalisée sur les animaux à la suite de la suture des paupières. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Des enricchissements supplémentaires (une balle de cellulose en plus, par exemple) sont prévus dans le cas des lapins qui seront hebergés individuellement.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, cette pratique chirurgicale est largement connue en médecine vétérinaire et s'effectue très bien chez le lapin et chez le rat. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.

Fournir un modèle expérimental pour tester des traitements des complications oculaires du diabète : 2 180 souris et 2 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine qui détruit les cellules du pancréas produisant l'insuline, puis une kératopathie leur est provoquée sur un œil après huit à seize semaines de diabète. Le porteur indique qu'au bout d'un mois les rats malades pèsent 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, et décrit les examens oculaires comme semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet. Les gouttes peuvent être administrées six à huit fois par jour et les injections dans l'œil une à deux fois par semaine, pour des études d'efficacité relevant en partie de l'usage réglementaire.

Objectifs

Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements impliquant des médiateurs de l’inflammation qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des capillaires sanguins de la rétine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritonéale d’une molécule qui rend les animaux diabétiques. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à trois fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal ou au niveau de la mandibule. L'induction de la kératophatie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique après une période de 8 et 16 semaines de diabète, la procédure ne durera pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de Streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris et serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la cornée diabétique est bien documentée chez la souris pigmentée (Young L, et al 2014) ou le rat albinos. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.