Autres tests de tolérance et d’efficacité

Provoquer des démangeaisons chez des chiens en bonne santé pour trier des molécules candidates à la mise sur le marché : c'est l'objet de ce projet, qui concerne 200 chiens dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à cinq injections intraveineuses d'une solution prurigineuse, espacées d'une semaine, chaque crise durant environ deux heures pendant lesquelles il se gratte, se lèche et se mordille. S'y ajoutent des prises de sang sur animal éveillé et, à l'occasion, des raclages ou des biopsies de peau, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit un comportement de prurit et que cette étape reste "indispensable". Aucun chien n'est tué : 180 seront réutilisés dans d'autres projets, 20 proposés à l'adoption.

Objectifs

L’objectif du projet est d’utiliser un modèle validé de prurit transitoire et modéré, provoqué par une administration intra-veineuse dune solution prurigineuse chez le chien, pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter entre autres, la dermatite atopique canine (DAC) ou d’autres pathologies entraînant des comportements de prurit chez le chien. L’utilisation a de ce modèle maitrisé permettrait d’évaluer, premièrement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation dans notre modèle avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien avec environ 10% de la population canine mondiale touchée. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse liée à une prédisposition génétique associée au développement d’allergie à des allergènes variés entrainant des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du chien et de son propriétaire. Tout ceci pouvant, à terme, être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce de destination lors d’un épisode clinique. La maitrise et le maintien d’un modèle induisant des signes cliniques similaires aux crises de prurit observées chez les chiens souffrant de DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de prurit présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’un comportement de prurit expérimental, les caractéristiques du prurit sont suivies en temps réel et en continu pendant toute la période d’expression, standardisée lors de la validation du modèle. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation de l’efficacité. Ce modèle permet aussi une évaluation de la tolérance, du profil pharmacocinétique des molécules testées et offre la possibilité de rechercher et/ou de suivre l’évolution des bio-marqueurs d’intérêt. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce de destination par procédure expérimentale dans un modèle transitoire, représentatif d’un comportement observé dans la DAC spontanée.

Procédures

Au cours de ces études, les animaux pourront recevoir, par voie intraveineuse, une solution entrainant des démangeaisons raisonnables et contrôlées. Ses administrations pourront être répétées au cours d'une étude, sans toutefois dépasser les 5 fois avec au minimum 1 semaine de récupération entre les administrations. Des voies d'administration telles que la voie intramusculaire, la voie sous-cutanée, la voie transcutanée ou la voie orale pourront être utilisée pour l'administration du produit a tester. Les volumes administrés seront en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Selon l’objectif de l’étude, des prélèvements sanguins pourront être réalisés. Ces derniers sont réalisés sur animaux vigiles. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal. Exceptionnellement, selon l’objectif de l’étude, des prélèvements de cutanés par raclage ou biopsie pourraient être réalisés. Selon les prélèvements à réaliser, une anesthésie associée à une analgésie adaptées seront mises en place selon les procédures en vigueur de l'établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Les chiens recevant une injection d’une solution prurigineuse développent des signes modérés et transitoires de prurit, pouvant provoquer de l’inconfort : grattage, léchage, mordillements ou frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et tous les signes de prurit disparaissent spontanément quelques heures après cette injection (le plus généralement dans les 2 heures suivant l’injection). Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées peuvent également générer un inconfort et/ou une douleur légère à modérée. Avant de conduire des études d’efficacité en utilisant ce modèle, des informations de tolérance chez le chien sont disponibles pour les produits à tester (dose maximale tolérée chez le chien et/ou une autre espèce pertinente, effets secondaires potentiels). Des réactions d’intolérance sévère liées aux produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvements sur un animal vigile peuvent occasionner un(e) léger(e) stress/gêne/contrainte en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil des échantillons le cas échéant.

Devenir

Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire un comportement clinique de prurit chez le chien et d’évaluer l’impact de nouvelles molécules sur l’intensité de l’expression clinique de la crise de prurit. L’utilisation de techniques in vitro préalables à l’utilisation de ce modèle in vivo permet de sélectionner en amont des molécules avec un fort potentiel d’activité sur le processus d’apparition du prurit impliquant certaines interleukines et ainsi de minimiser le recours au modèle in vivo. Cependant, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant pas être reproduite in vitro, cette étape demeure indispensable avant de prendre une décision sur la potentielle efficacité clinique d’une molécule chez le chien et l’éventuelle poursuite de son développement à des fins thérapeutiques.

Réduction

Les comportements de prurit présentent une variabilité entre individus. L'expérience avec ce type de modèle nous montre qu'il faut déterminer le nombre minimal d'animaux par groupe permettant d’obtenir des résultats exploitables et répétables. Ce sont le plus souvent, des études de preuve de concept/pilotes, étapes précoces de l'évaluation d'un nouveau produit/composé actif utilisant 3 à 6 animaux par groupe, qui permettront de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour des études ultérieures réglementaires. L'évaluation et l'interprétation des résultats sont faites avec une échelle de score adaptée pour ce modèle. Il est possible de réduire le nombre d'animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d'étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d'étude, le nombre d'animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié sur la base des informations déjà disponibles, de manière à optimiser l'utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s'assurant que ce nombre d'animaux permette d'atteindre l'objectif de l'étude, c'est-à-dire que les résultats de l'étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l'efficacité du produit/des produits évalués. En plus d'étudier le contrôle du prurit (effet pharmacodynamique), l'utilisation d'un modèle permet d’obtenir éventuellement un profil pharmacocinétique en parallèle. Ces paramètres pourront être combinés et permettre par modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) d’établir une relation entre l’effet et la dose et ainsi proposer une dose thérapeutique adaptée. Lors de ce modèle pourra aussi être réalisée une évaluation de la tolérance générale de la molécule. Toutes les informations obtenues lors d’une seule étude sur ce modèle permettent de diminuer le nombre d’études à réaliser pour statuer sur l’intérêt d’une nouvelle molécule ou de contribuer au développement d’une molécule à des fins thérapeutiques, et de ce fait, de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont observés et manipulés quotidiennement depuis leur arrivée sur le site afin de les habituer à la contention et au contact du personnel formé et impliqué dans les études. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons, et elle n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau ), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Dans le cadre de ce Projet, les animaux sont préalablement testés pour leur capacité à exprimer un comportement de prurit modéré, reproductible, contrôlable et de durée limitée (environ 2h). Depuis leur inclusion dans une étude du projet jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes (toutes les 15 minutes) sont prévues après l’injection de la solution prurigineuse et l’administration des produits testés, pendant au moins 2h30, pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques attendus (prurit) n’entraine pas de dégradation importante de l’état général et du bien-être de l’animal ainsi qu'une bonne tolérance au traitement. Le comportement général, la respiration, le grattage et l’aspect de la peau sont évalués avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront un examen vétérinaire et éventuellement l’administration d’un traitement adapté à sa condition clinique. La réaction aigue induite et l’inconfort que l’injection de prurigineux engendre, peuvent être contrôlés avec des molécules anti-prurigineux. La grille d’évaluation des observations et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés après analyse rétrospective par la SBEA, des résultats obtenus pendant chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent réglementairement être testés dans l’espèce pour laquelle le produit est développé (animal de « destination »), dans ce cas, le chien. Les modèles seront réalisés chez des chiens jeunes adultes sains, c’est à dire des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.

Caractériser un candidat médicament développé par une société privée, l'O2L-001, en vue d'un essai clinique annoncé dans deux ans: 160 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'histologie ou pour quantifier les traceurs injectés. Cinquante d'entre eux reçoivent une injection du produit directement dans le cerveau, cinquante autres dans les ventricules cérébraux, soixante subissent la pose d'un cathéter intraveineux et cent passent une IRM de quatre-vingt-dix minutes. Sur les effets subis par les rats, le RNT tient en une ligne, des douleurs, sans autre précision. Le projet relève à la fois de la recherche fondamentale, du contrôle qualité et des tests réglementaires d'efficacité et de tolérance, pour un produit dont l'entrée en clinique est déjà annoncée.

Objectifs

Cette étude cherche à examiner les caractéristiques d'un nouveau médicament appelé O2L-001, développé par la société Op2lysis pour traiter les hématomes qui se forment après des saignements cérébraux. Ce médicament contient un ingrédient actif nommé OptPA, qui est une version améliorée d'une substance utilisée pour dissoudre les caillots sanguins. L'OptPA a été modifié de manière à être moins toxique et à provoquer moins d'effets secondaires que les traitements actuels. Pour le rendre encore plus efficace, il est mélangé avec un matériau spécial appelé Poloxamère 407. Ce matériau se comporte comme un liquide lorsqu'il est injecté, mais se transforme en gel à la température du corps (37°C) pour libérer le médicament lentement dans l'hématome, aidant ainsi à dissoudre le caillot plus efficacement. L'objectif principal de cette recherche est d'en savoir plus sur les propriétés de l'OptPA et de comprendre comment O2L-001 fonctionne dans le corps.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'O2L-001 et sur son principe actif l'OptPA. L'O2L-001 est une nouvelle génération de thrombolytique qui vise à être testé en clinique d'ici 2 ans pour le traitement et l'évacuation des hématomes formés suite à un AVC hémorragique.

Procédures

1- Pose de cathéter intraveineux pour injection d’OptPA, tPA ou NaCl (30 minutes/animal, n=30 animaux) 2- Pose de cathéter intraveineux pour récupération de sang (30 minutes/animal, n=30 animaux) 3- Injection intracérébral d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux. 4- Injection intraventriculaire d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux) 5- IRM (90 minutes environ, n=100 animaux) 6- Imageur IVIS® (5 minutes environ, n=20 animaux)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux seraient des douleurs.

Devenir

Les animaux feront l'objet d'une mise à mort, soit, afin de générer des tissus permettant des observations histologiques, soit, pour quantifier les traceurs injectés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le rat est l’une des espèces les plus utilisés dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 160 rats seront nécessaires pour réaliser cette étude et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et d’étudier la distribution du produit permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux : 160 animaux) a été évalué via un test statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad lithium. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l’issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu’à l’obtention d’un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placé sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température de la salle d’expérimentation est contrôlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces animales les plus utilisées pour les études de pharmacodynamique et de pharmacocinétique. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie du rat sont également documentés et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que le rat représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ce stade est adapté aux études de pharmacocinétique et pharmacodynamique.

Rendus immunodéficients par construction, puis greffés de cellules souches et d'un fragment de thymus humains, 120 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La greffe de thymus est placée sous la peau ou sous la capsule rénale, suivie d'injections d'anticorps dans le ventre aux jours 0, 7 et 14, puis de prélèvements de sang derrière l'œil aux semaines 12, 18 et 24. Le porteur mentionne parmi les atteintes possibles la séparation de la mère, le risque qu'elle rejette ses petits, et une réaction du greffon contre l'hôte, sans en décrire les manifestations. Tous sont tués à l'issue pour prélever sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Afin de pouvoir répondre à ce type de problèmatique, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire en mimant de manière plus spécifique la physiologie humaine. Et cela tous en permettant d'extrapoler les effets qu'ils pourront avoir avec d'avantage de sécurité. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Ce projet expose donc la procédure visant à améliorer l'humanisation de rats immunodéficients qui recevront une greffe de cellules souches et une greffe de thymus.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation dans les rats humanisés par une greffe de cellules souches et une greffe de thymus. Ces animaux pourront montrer un système immunitaire semblable au système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'injection de cellules souches, la greffe de thymus soit en sous-cutanée soit sous la capsule rénale (durée entre 10-20 min). Les injections d'anticorps LoCD2b en intra-péritonéale à J0, J7 et J14. Ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil). Toutes ces procédures expérimentales sont maitrisées.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont : le stress dû à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales (placement biopsie thymique en sous cutanée ou sous la capsule rénale, l'injection en ip, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux, GVHD...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude grâce à une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux afin de pouvoir documenter l'effet des différents traitements étudiés sur le système immunitaire.

Remplacement

Il n'est à l'heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et d'étudier l'effet sur celui-ci d'anticorps et/ou médicament. Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Le rat ayant un système immunitaire humain constituera donc un modèle scientifiquement robuste et fiable pour reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entres les groupes.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter le stress du à l'expérimentation. Les rats seront hébergées en cages ventilées par groupe de 2 à 5 individus dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). La nourriture et l'eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Par ailleurs, nous maitrisons les gestes expérimentaux. L'état de santé des animaux seront surveillés par une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Choix des espèces

Le choix du rat repose sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris. Les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés.

Le dossier réglementaire exigé avant une première administration chez l'être humain repose sur 182 macaques à longue queue, tous tués pour évaluer la toxicité et la biodistribution du produit, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures, jusqu'à quatre heures pour un traitement bilatéral, et parfois deux chirurgies espacées d'un mois. Les prises de sang se font sur animal éveillé sous contention manuelle, le liquide cérébrospinal est ponctionné sous anesthésie, et le recueil des urines et des fèces impose un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce comme effets indésirables possibles une perte d'équilibre, un défaut de clignement des paupières et une paralysie faciale transitoire, et présente la réalisation de ce projet chez le primate comme "indispensable".

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le primate afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier les surdités génétiques/héréditaires tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un implant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 et 2 heures (traitement unilatéral) et jusqu’à 4 heures (traitement bilatéral). Chaque animal est soumis à une chirurgie généralement. Potentiellement, un animal peut être soumis à deux chirurgies espacées d’au moins 1 mois pour réaliser des injections bilatérales non simultanées. Examens cliniques : les animaux sont suivis quotidiennement mais des examens spécifiques peuvent être conduits pour suivre les paramètres cardiovasculaires, la pression artérielle par exemple. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces examens sont réalisés entre 2 et 4 fois selon la durée de l’étude. Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes). Liquide de l’oreille, liquide cérébrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie sous anesthésie générale et à la nécropsie après euthanasie). Larmes, salive, température corporelle : ces prélèvements non invasifs sont réalisés chez les animaux avec une contrainte manuelle légère pour que l’animal ne bouge pas le temps du prélèvement (durée : quelques secondes et moins d’1 minute). Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces prélèvements sont généralement réalisés une fois dans les semaines précédant le traitement, deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines après traitement, puis en milieu et en fin d’étude. Les urines et les fèces sont collectés quand l’animal est hébergé dans une cage dédiée pour le recueil de ces fluides. L’hébergement individuel ne peut dépasser 24 heures. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Chaque animal est soumis à 4 collectes généralement, réalisées une fois dans les semaines précédant le traitement, une fois dans les 2 premières semaines après traitement en milieu d’étude et en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère, ponctuelle et transitoire de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre, un défaut de clignement des paupières et/ou une paralysie faciale transitoire(s). Des effets indésirables liés aux prélèvements et/ou aux examens cliniques sont liés à la contention légère des animaux qui peut induire un léger inconfort ou stress aux animaux, qui restent transitoire. Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le primate afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le minimum requis pour permettre une analyse statistique, conformément aux recommandations des lignes directrices. L’estimation du nombre d’animaux a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et d’une éventuelle variation de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire, de réveil et les jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement notamment l’activité et la mobilité des animaux, les interactions sociales, l’apparence physique, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. Toute anomalie est signalée au vétérinaire pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se font sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux est surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a des signes d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de Macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

Une lésion est provoquée sur un seul œil de chaque animal, puis des gouttes sont instillées jusqu'à six à huit fois par jour et des produits injectés dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical. 1 425 souris, 1 425 rats et 1 425 lapins vont être utilisés, soit 4 275 individus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une gêne ou une douleur limitée à quelques heures après l'induction, tout en indiquant ailleurs que la lésion entraîne une altération partielle et permanente de la vision. Tous les animaux ayant suivi la procédure entière sont tués pour des analyses histologiques et des dosages.

Objectifs

La cornée, partie du globe oculaire située en avant de l'œil est un tissu transparent. Dans certaines pathologies, des vaisseaux sanguins envahissent de façon anormale l’intérieur de la cornée. Ce phénomène appelé « néovascularisation cornéenne », est un problème majeur de santé publique car la perte de la transparence de la cornée empêche une vision correcte et peut conduire à une cécité. Les origines de ce phénomène sont multiples : maladies héréditaires, séquelles d’un traumatisme ou d’une brûlure, complications d’infections virales ou bactériennes, complications de greffes de cornées, port prolongé de lentilles de contact. La majorité des traitements actuels ciblent la régression des vaisseaux par : - Application de produits anti-inflammatoires, - Coagulation des vaisseaux à l’aide d’un laser ophtalmique, - Transplantation de membrane amniotique. Ces traitements ne sont pas toujours efficaces et les effets secondaires fréquents ne sont pas à négliger : - Augmentation de la pression intra oculaire avec risque de glaucome, - Apparition de cataracte (opacification du cristallin, autre structure de l’oeil dont la transparence est capitale pour la vision). Les récents traitements visent les facteurs directement impliqués dans la formation de ces nouveaux vaisseaux au niveau moléculaire. L’objectif du projet est la mise en place au sein de l’établissement utilisateur de modèles expérimentaux de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur afin de participer au développement de nouvelles thérapies pour cette pathologie. Le principe est d’induire sur un seul oeil, par différentes méthodes, la prolifération de vaisseaux suite à une lésion cornéenne.

Bénéfices attendus

Les pathologies de la cornée sont un réel handicap puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. L’assemblage en couches cellulaires très organisées et dépourvues de vaisseaux, garantit la transparence du tissu essentielle à la vision. Ce « privilège » anti-angiogénique résulterait d’un équilibre entre production de facteurs anti-angiogéniques et répression de facteurs pro-angiogéniques. Lors d’une atteinte de la cornée, il y a une rupture dans cet équilibre, en faveur de la production de facteurs angiogéniques. Cette rupture entrainerait le développement de nouveaux vaisseaux à partir du limbe vers le centre de la cornée, le limbe étant la zone de transition entre la sclère opaque et la cornée transparente.

Procédures

La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, l’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.