Autres tests de tolérance et d’efficacité

Pour tester si de l'eau enrichie en oxygène réduit le portage de Campylobacter jejuni chez le poulet de chair, 144 oiseaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit, vigile et sous contention, un gavage unique de moins de cinq minutes pour l'inoculation, puis est élevé en isolateur jusqu'à trente-cinq jours. Tous sont tués pour prélever les cæca et compter les bactéries, à raison de douze animaux par point de la cinétique. Aucun traitement de soulagement n'est prévu, au motif qu'il fausserait les résultats, et l'association de plumes ébouriffées, de prostration et d'anorexie pendant vingt-quatre heures déclenche la mise à mort par électronarcose puis élongation cervicale.

Objectifs

Le développement des résistances bactériennes aux antibiotiques est une problématique de santé publique mondiale. Elle est la capacité d'un microorganisme à résister aux effets des antibiotiques. Les bactéries disposent de nombreux mécanismes de résistance contre des molécules toxiques auxquelles elles sont naturellement confrontées dans leur environnement. Le cas le plus fréquent est une adaptation, qui naît de mutations génétiques aléatoires, ou qui fait suite à des échanges de gènes de résistances entre des bactéries. Si une bactérie est porteuse de plusieurs gènes de résistance pour différents antibiotiques, elle est dite « multirésistante ». Parmi les pathologies avicoles bactériennes, la campylobactériose, maladie zoonotique, est un problème de santé publique mondial, important en Europe, aux États-Unis, en Australie et en Nouvelle-Zélande. Il s'agit d'une maladie d'origine alimentaire principalement due à la contamination de la viande de poulet par Campylobacter spp qui peut être transférée des animaux à l'homme par la consommation et la manipulation de la viande. Les espèces Campylobacter les plus importantes sont C. jejuni et C. coli qui peuvent induire divers signes cliniques tels que diarrhée, douleurs abdominales, fièvre, maux de tête, nausées et vomissements chez l’homme. Dans certains cas, des complications post-infectieuses sont observées, comme le syndrome de Guillain-Barré, une faiblesse musculaire à déclenchement rapide causée par le système immunitaire endommageant le système nerveux périphérique. Par conséquent, le portage asymptomatique de Campylobacter spp chez les volailles est une préoccupation majeure.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider l’efficacité des traitements alternatifs tels que l’eau enrichie en oxygène par rapport aux antibiotiques utilisés dans les élevages avicoles. Les entrants étant diminués, ce travail aura un impact économique et sanitaire pour les éleveurs et contribuera à la réduction de l’utilisation des antibioques mis en place par le gouvernement. A long terme, un impact sur la Santé publique sera obtenu en reduisant le nombre de contaminations humaines et limitant d’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans le monde vétérinaire, transmissible à l’homme.

Procédures

Inoculation par gavage par voie orale des poulets vigiles contentionnés, 1 fois et moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Juste lors de gavage de l’inoculum qui peut engendrer un léger stress lors de la contention.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pour prélever les caeca pour la quantification bactérienne et de mesurer l'effet du traitement sur la portage de Campylobacter.

Remplacement

Il n'existe aucune méthode alternative pour développer un portage asymptomatique chez le poulet.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature, les premières données expérimentales obtenues sur le modèle infectieux et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Le nombre de poussins par lot et par dose de produit (n=44) sont suffisantes pour montrer statistiquement l’efficacité du traitement contre Campylobacter jejuni (avec des effectifs similaires comme décrit dans la littérature) et qui montre une diminution significative de 60% sur la colonisation caecale dans le modèle Salmonella après vaccination et autres traitements (mesure de l’effet vaccination sur l’excrétion des salmonelles)). 12 poussins ou poulets seront donc euthanasiés par point de la cinétique. L'évaluation statistique des différences entre les groupes expérimentaux sera déterminée par une analyse de variance.

Raffinement

Aucune médication de soulagement ne peut être utilisée sans mettre en péril les résultats de l’étude. Il y a des possibilités d’interactions médicamenteuses entre les analgésiants et les nouvelles molécules. Les animaux sont hébergés en isolateur. La densité des animaux est surveillée en fonction de leur prise de poids et qu'elle ne dépasse pas celle prévue dans la règlementation. Il y aura un enrichissement social (vie en groupe et visite bi-journalière des animaliers) et des structures d'enrichissement (des perchoirs, tapis au sol sur une partie de l’isolateur et des objets suspendus afin qu’ils puissent être au plus proche de leur environnement naturel). Aucune symptôlogie ou mal-être n’est attendu pendant l’étude. Points limites : Les animaux seront euthanasiés si leur état clinique ne laisse aucun doute sur leur souffrance et/ou une issue fatale. En particulier, l’association de trois signes cliniques majeurs tels que : plumes ébouriffées, prostration, anorexie pendant au plus 24h, conduira de fait à l’euthanasie des animaux. Les animaux atteignant le point limite expérimental seront euthanasiés par électronarcose suivi d'une élongation cervicale en fonction de l'âge des animaux ou par injection par injection de barbituriques par le sinus occipital.

Choix des espèces

Selon l’OCDE, la viande de volaille est la plus consommée en quantité dans le monde. Selon la littérature scientifique, il apparait que la combinaison Campylobacter-poulet est celle qui est à l’origine du plus grand nombre de cas d’infections chez l’Homme. Le poulet est le vecteur principal de la zoonose (de la campylobactériose) chez l’Homme et donc l’espèce la plus pertinente. Il n'est pas possible de comprendre le portage asymptomatique de Campylobacter sur des modèles in vitro. Œufs fécondés, stade poussin de 1 jour, puis poulet. Les œufs embryonnés sont fournis par le couvoir, puis mis en incubationen interne afin de préserver le statut sanitaire des animaux et éviter toutes contaminations environnementales. Les poussins de 1 jour seront mise en place en isolateur avec un environnement enrichi, puis élevés pendant 35 jours.

Dix vaches en tarissement reçoivent des immunisations intramusculaires, sous-cutanées et directement dans la mamelle, puis une infection par Staphylococcus aureus par la même voie, avec jusqu'à quatre lavages intramammaires et une à deux prises de sang par semaine. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance légère, le porteur listant des hématomes, des phlébites et des mammites non infectieuses de moins de vingt-quatre heures. Il écrit par ailleurs que ses essais antérieurs de vaccins à base de levure de boulanger "ne causent aucune réaction adverse chez le bovin". Les dix vaches sont tuées, une espèce destinée à l'alimentation humaine ayant reçu des formulations sans autorisation de mise sur le marché ne pouvant, indique-t-il, être ni relâchée ni adoptée.

Objectifs

Limiter l’usage des antibiotiques représente un enjeu sociétal prioritaire. Dans ce contexte, la vaccination joue un rôle important dans la réduction de l’incidence et la sévérité des infections. Des alternatives aux vaccins privilegiant la réponse humorale demeurent un besoin dans la lutte contre certaines maladies animales, notamment les mammites à Staphylococcus aureus chez les ruminants. Les mammites sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Les vaccins actuels contre ces infections sont peu efficaces et des nouvelles approches vaccinales doivent être proposées. Des analyses in vivo récemment mises en place par notre équipe montrent que l’administration par les voies systemique (intramusculaire) et locale (intramammaire) de vaccins à base de la levure du boulanger (Saccharomyces cerevisiae - SCe) inactivée par la chaleur ne cause aucune réaction adverse chez le bovin. De plus, cette plateforme vaccinale a permis l’induction d’une réponse lymphocytaire antigène-spécifique dans le sang et la glande mammaire de vaches laitières. Basé sur ces observations, le présent protocole a pour but d’évaluer l’efficacité in vivo d’un vaccin contre les mammites à S. aureus.

Bénéfices attendus

Les vaccins actuels contre les mammites, basés sur des approches traditionnelles (bactéries inactivées), sont peu efficaces et ce constat est attribué à leur incapacité à déclencher une réponse immunitaire à médiation cellulaire (modulée par les lymphocytes). Les connaissances apportées par ce projet contribueront au développement de nouveaux vaccins contre les mammites dans le cadre du programme jeune chercheur de l’ANR. Ces vaccins exploiteront la levure du boulanger comme vecteur d’antigènes et cela permettra la production de vaccins plus sûrs, moins coûteux et stockables sans chaine de refroidissement. A long terme, cette stratégie pourra être utilisée pour la mise en place de vaccins contre d’autres maladies des animaux de rente, contribuant à la réduction de l’usage d’antibiotiques au sein des élevages.

Procédures

Prélèvement sanguin : une, éventuellement deux prises par semaine. Une période de repos d’au moins 5 jours sera instituée avant un nouveau prélèvement. Immunisation par la voie intramusculaire : 1 fois. L’intervention dure de 1 à 2 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Immunisation ou Infection par S. aureus par la voie intramammaire : 1 fois pour infection ou 2 fois maximum pour immunisation espacées d’au moins 4 mois, le cas échéant. L’intervention dure moins 5 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Immunisation par la voie sous-cutannée : 2 fois. L’intervention dure de 1 à 2 minutes par animal avec un opérateur entrainé. Stimulation et lavage intramammaire. 4 fois (maximum) espacées d’au moins 15 jours. L’intervention dure moins 10 minutes par animal

Impact sur les animaux

Hématomes et inflammation locale suite aux immunisations ou à l’infection. Phlébites suite aux prélèvements sanguins. Mammites non infectieuses de courte durée (< 24h) suite aux stimulations locales et aux lavages. La contention peut engendrer du stress et les différentes injections ou lavage intramammaire peuvent engendrer une douleur pour l’animal si réalisées par une personne peu expérimentée.

Devenir

S’agissant d’individus d’une espèce destinée à l’alimentation humaine ayant subi des traitements avec des formulations dépourvues d’une autorisation de mise sur le marché, l’ensemble des animaux sera mis à mort. Etant donné que les animaux seront maintenus au sein d’une plateforme de recherche en infectiologie, le replacement ou adoption de ces animaux n’est pas envisageable.

Remplacement

Les cellules bovines ne peuvent pas être remplacées par celles d’une autre espèce ou par une lignée cellulaire commerciale. De plus, bien souvent les résultats de protection contre l'infection obtenus avec l’immunisation des rongeurs ne sont pas transposables aux ruminants.

Réduction

Notre équipe a précédemment observé qu’un animal sur quatre ne présente pas une réponse immunitaire mesurable suite à des immunisations avec l’ovalbumine et d’autres antigènes. Ainsi, un collectif de six animaux par groupe, répartis en deux protocoles, représente le minimum pour obtenir des résultats se prêtant à des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. Concrètement, les analyses sur les échantillons sanguins et de sécrétion mammaire stimulés ex vivo/in vitro seront réalisées avant et après les immunisations ou stimulations in vivo la glande mammaire. De plus, 2 quartiers non-stimulés seront utilisés comme témoins pour les analyses.

Raffinement

Les prises de sang et les immunisations ne nécessiteront qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Pour les immunisations, l’infection et lavages intramammaires, les animaux seront retenus en groupe de 3 ou 4 dans la salle de traite, pour une période courte (inférieure à 30 min). Suite aux immunisations et lavages, les animaux seront surveillés pour la présence de signes systémiques et locaux de réaction adverse. Pour cela, l’état général et la température corporelle des animaux, ainsi que la présence d’hématomes et d’inflammation sera évalué au moins 1 fois par jour pendant la période d’une semaine après chaque administration. Le cas échéant, ces signes seront traités avec un anti-inflammatoire non stéroïdien approuvé pour l’usage chez le bovin. En cas de mammite infectieuse suite aux administrations intramammaires, les quartiers affectés seront soumis à un traitement antibiotique à spectre large. Enrichissement du mileu: pierre de sel, brosse de grattage, tapis de couchage, paille Enrichissement social : confinement en groupe et visite régulière des animaliers Une récompense positive (céreales) sera fournise aux animaux après les prélèvements et lavages intramammaires.

Choix des espèces

Les infections mammaires des bovins sont fréquentes en élevage. Elles sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Des vaccins plus efficaces contre ces infections doivent être mis au point. Le choix de l’espèce cible pour la mise en place de ce protocole est justifiée par l’observation que les résultats de protection contre l'infection obtenus avec des modèles murins sont peu transposables aux bovins. Les expérimentations seront réalisées sur des vaches en tarissement car ces animaux correspondent à la catégorie ciblée par notre approche vaccinale en cours de développement.

Des ratons de dix jours, dont le cristallin n'a pas fini de mûrir, reçoivent une injection sous la peau qui rend leur œil opaque. 810 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit ensuite des gouttes deux à trois fois par jour, ou des injections quotidiennes, ou des injections péri-oculaires hebdomadaires sous anesthésie, jusqu'à sa mise à mort vers trente jours de vie. Le porteur qualifie de "sénile" la cataracte ainsi obtenue chez des nouveau-nés. 720 rats sont tués pour l'analyse des tissus, les 90 mères gestantes écartées avant la fin pouvant être réutilisées dans d'autres procédures après avis du vétérinaire.

Objectifs

La cataracte est une affection oculaire très courante chez l'homme comme chez l'animal. Elle touche plus d’une personne sur cinq à partir de 65 ans et près de deux sur trois après 85 ans. Elle est en augmentation constante dans les pays développés du fait de l’allongement de l’espérance de vie. Il s’agit de la première cause de cécité chez l’homme, avec plus de 20 millions de personnes atteintes dans le monde. Elle est aussi l'une des causes principales de cécité chez l’animal domestique. Cette affection est caractérisée par une opacification du cristallin, la lentille naturelle de l'œil, qui entraîne une diminution de la vision, une vision trouble ou brouillée, une sensibilité accrue à la lumière et des difficultés à voir la nuit. La cataracte est souvent liée au vieillissement, mais peut aussi résulter de maladies, de traumatismes ou de traitements médicamenteux. À l’heure actuelle, la prise en charge médicale de la cataracte comporte des mesures préventives ou symptomatiques censées ralentir l’apparition de l’opacification du cristallin et son évolution. Chez l’homme comme chez l’animal, la chirurgie de la cataracte reste le seul traitement curatif disponible à ce jour. Actuellement plusieurs études étudient de nouvelles pistes de traitements. Ce projet s’inscrit donc dans ce courant et a pour objectif de mettre en place un modèle expérimental afin de tester et valider ces nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental de cataracte sénile chez le rat sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la cataracte. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.

Procédures

L'induction de la cataracte se fera par une injection sous-cutanée unique à 10 jours de développement. La durée de l’acte ne dépassera pas plus d’une minute par animal. La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 30 jours après la naissance. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 30 jours après la naissance. Là aussi, la durée des administrations et de la manipulation des animaux ne dépassera pas plus d’une minute par animal. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 30 jours de l'étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation au biomicroscope) seront généralement hebdomadaires et ne dureront pas plus de 5 minutes par animal. Tous les examens décrits ici sont également pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Ces examens sont totalement indolores et ne durent que cinq minutes tout au plus par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés à leur manipulation et à l’administration des produits. L'affection recherchée - la cataracte sénile - n'induit pas de douleur chez l'animal. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet secondaire en dehors de l'opacification du cristallin, d'une dégradation de la vision et d'une éventuelle sensibilité accrue à la lumière. La manipulation des animaux sera limitée au maximum et sera réalisée par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.

Devenir

A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, coton pour le nid) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. Dans le cas où des signes de douleur sont manifestés, un analgésique sera administré. Cette administration sera renouvelée au tant que nécessaire. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis sa mise en place par Ostadalova et al. en 1977. Il est bien caractérisé. L'espèce choisie est le rat jeune, avant la fin de la période critique de maturation du cristallin. C'est l'espèce référence pour ce modèle, l'opacification du cristallin est très facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité et une bonne fiabilité De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. L'induction se fera à 10 jours de développement du jeune rat avant la fin de la période critique de maturation du cristallin.

Un tube gastro-œsophagien introduit trois fois pour prélever du suc gastrique, avant le test puis à trente et soixante minutes, et une administration de pentagastrine pour faire sécréter l'estomac : 40 chiens adultes sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous sont gardés en vie. L'opération est répétée après au moins quatre jours de repos, pour vérifier que les mesures de pH sont reproductibles. Il s'agit de repérer les individus qui répondent à la pentagastrine, afin de les inclure dans de futures études de pharmacocinétique où l'absorption dépend du pH de l'estomac. Cet avenant augmente l'effectif "suite à une demande accrue d'études", et le porteur écrit qu'il n'y a pas eu d'approche statistique pour fixer ce nombre de 40 chiens.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir identifier des animaux qui répondent à la pentagastrine. La pentagastrine a pour effet d'entrainer la sécrétion gastrique. Cela permettra donc de vérifier l'acidité du pH gastrique chez les chiens et de limiter les variations inter individuelles également. Le pH gastrique a un rôle majeur au niveau de l'absorption des principes actifs dans les études de pharmacocinétiques. Ce projet est un avenant au projet autorisé dont l'objectif est d'augmenter le nombre d'animaux suite à une demande accrue d'études.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir vérifier que les animaux répondent bien à l'injection de pentagastrine. Cela permettra de vérifier l'acidité de l'estomac avant l'administration d'un élément d'essai. Ce projet permettra de s'assurer que les animaux sélectionnés pour de prochaines études seront dans de bonnes conditions pour pouvoir évaluer des paramètres physico chimiques des éléments testés dans le but de générer de nouveaux médicaments.

Procédures

Dans ce projet, il y aura des prélèvements de suc gastrique pour mesurer le pH du contenu de l'estomac. Pour cela, le suc gastrique sera prélevé via l'utilisation d'un tube gastro oesophagial. Il y aura 3 prélèvements ( avant le début du test puis à 30 et 60 min). La durée d'un prélèvement est de l'ordre de la minute. Les animaux auront aussi une administration d'une solution de pentagastrine. Le volume administré sera de 0.08 mL/kg. La durée de l'administration: inférieure à la minute. Ces mesures de pH seront réalisées deux fois pour vérifier que les résultats sont bien reproductibles. Une période de repos d'au minimum 4 jours sera respectée entre les 2 périodes.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques réalisés dans ce projet seront: - gavage ( voie orale): cela peut engendrer du stress lié à la contention - administration intramusculaire: cela peut également engendrer du stress lié à la contention, et peut être une gêne musculaire juste aprés administration.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

La réponse à la pentagastrine est individu dépendante. Il est necessaire dans ce projet de sélectionner les animaux qui répondront favorablement à l'effet de la pentagastrine en vu de réaliser de prochaines études pour lesquelles les éléments d'essai seront dépendant du pH gastrique. Les approches in vitro permettent de mimer la dissolution d'un élément test à un certain pH mais cela ne permet pas de voir les phases absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination. Il est donc indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble.

Réduction

Des groupes de 3 à 6 animaux par élément d'essai testé seront généralement prévus. Ce projet est un avenant au projet autorisé dont l'objectif est d'augmenter le nombre d'animaux suite à une demande accrue d'études. Sur une durée de 5 ans nous prévoyons de valider la réponse à la pentagastine sur 40 animaux soit environ 16 animaux tous les 2 ans . Six animaux sont nécessaire pour la réalisation d'une étude soit 12 animaux sont necessaire pour assurer un roulement entre les animaux avec une periode de repos suffisante d'au minimum 7 jours. Il n'y a pas eu d'approche statistique. C'est le nombre d'animaux minimal requis pour avoir un nombre animaux suffisant pour être inclus dans de futures études.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation et durant le test , les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Un suivi quotidien sera mis en place pour l'observation générale des animaux. Le jour du test les animaux seront observés plusieurs fois par jour. Si de la douleur est ressenti au cours du test, possibilité d'utiliser des analgésiques. Cette décision sera prise par le vétérinaire désigné. De l'enrichissement ( exemple: balle, corde, cachette, fond musical ) sera présent autant que possible dans les hébergements. Dans ce projet les points limites sont: - Des vomissements qui seraient liés à la technique de gavage ou qui suivrait l'injection de pentagastrine - Des douleurs au moment de l'administration de la solution de pentagastrine - Des douleurs au moment de la réalisation des gavages pour le prélèvement de suc gastrique Si les vomissements sont trés fréquents et important, si la douleur est également bien présente alors cela sera considéré comme un critère d'arrêt.

Choix des espèces

Espèce de choix pour valider ce type de réponse. Le chien est une espèce facile à manipuler. Données bibliographiques disponibles sur cette espèce. Espèce qui sera demandée dans les futures études. Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet.

Environ 10 % des animaux n'ayant pas suivi la procédure entière seront gardés en vie et réutilisés ailleurs, tous les autres seront tués pour analyse des yeux. 1 600 souris, 1 600 rats et 1 600 lapins vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, pour installer une rétinopathie diabétique par injection de produits de glycation. Selon les cas, l'injection se fait dans l'abdomen, dans la veine ou directement dans l'œil, avec jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des examens ophtalmologiques hebdomadaires sous anesthésie légère. Le porteur écrit que les maladies de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'être humain et transpose cette conclusion à l'animal, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité.

Objectifs

La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. L'objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de rétinopathie diabétique afin de tester des traitements potentiels qui pourraient améliorer la pris en charge de cette pathologie. Une étape clé dans l’installation de cette maladie et la détérioration des parois des capillaires sanguins de la rétine. Les capillaires sanguins perdent leur étanchéité ce qui induit une augmentation de la perméabilité vasculaire et une rupture de la barrière hématorétinienne, des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine et altèrent son fonctionnement neuronal. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine essentielle pour la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. L'excès de sucre dans le sang (l’hyperglicémie) génère des produits dérivés appelés les produits avancés de glycation : les AGEs. Ces AGEs sont impliqués dans le développement des complications du diabète. Une stratégie pour reproduire l’atteinte vasculaire de la rétinopathie diabétique consiste en l’injection de AGEs exogènes chez les rongeurs et le lapin. Selon les protocoles disponibles dans les publications scientifiques, l’injection peut se faire par différentes voies : injection intra veineuse, intra vitréenne, intrapéritonéale. Dans un premier temps nous souhaitons induire le modèle par injection intrapéritonéale de AGEs chez les rongeurs, en cas d'échec, s'il n'y a pas eu d'induction et que les signes cliniques ne sont pas présents, les injections intraveineuses seront envisagées ou encore l'injection intravitréenne (à l'intérieur de l'œil) chez les 3 espèces. Les durées des études peuvent être différentes selon le mode d'administration : 1 à 2 semaines pour les injections quotidiennes intrapéritonéales et intraveineuses et quelques heures à quelques jours pour les injections uniques intravitréennes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements agissants sur la composante vasculaire de la rétinopathie ou neuroprotecteurs de la rétine chez les diabétiques.

Procédures

Le déclenchement du modèle est dû à une injection par piqûre intrapéritonéale, ou intraveineuse ou une injection intravitréenne, un seul mode d'induction par animal. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine sur maximum deux semaines. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt (durée de moins d'une minute pour le prélèvement). De manière générale, les études auront une durée variable qui pourra aller d'1 jour à deux semaines.

Impact sur les animaux

Les maladies vasculaires ou neurodégénératives de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux intéractions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animaux en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.