Autres tests de tolérance et d’efficacité

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du foie, par injection simple ou par chirurgie dans le foie, la rate ou la veine porte, puis des traitements testés et un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que le développement de la tumeur peut entraîner des effets délétères encadrés par des points limites, les animaux étant tués pour prélever organes et fluides. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'évalue un médicament sur le cancer du foie et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de cancer du foie. Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les stratégies thérapeutiques testées sont actives dans un modèle expérimental et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers hépatiques, une pathologie humaine touchant plus de 10 000 personnes par an en France.

Procédures

Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sc, ip, iv - durée max 1 min) soit par chirurgie (injection dans le foie, la veine prote ou encore la rate - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés Le schéma thérapeutique sera adapté en fonction de la nature du traitement testé. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt et donc de garantir le bien-être animal. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter les signes de mal être au plus tôt et donc de pouvoir agir rapidement et ainsi de garantir le bien-être animal. Les procédures chirurgicales d’implantation intrahépatique, intrasplénique et veine porte repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du foie. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6 à 10 / par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse,

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .

25 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie est faite dans le pharynx puis suturée et recouverte d'un biomatériau, pour tester un dispositif censé prévenir les fistules salivaires après ablation du larynx chez l'Homme. Le porteur liste comme risques un hématome, une infection, une fistule, des douleurs à l'alimentation et une dégradation de l'état général. Il indique que la mise à mort est nécessaire pour l'analyse histologique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico de fistule salivaire n'existe.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau sur chirurgie du cou / de la gorge chez le petit animal (n = 25 rats). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale consistant à effectuer une plaie dans le pharynx (situé dans le cou / dans la gorge), la suturer et couvrir la suture par le biomatériau. Chirurgie durant 30 minutes environ. Réalisation au cours de la même anesthésie d'un prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), fistule salivaire (pharyngostome), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et déterioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées, un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet. De plus, aucun modèle de fistule salivaire in silico ou in vitro n'existe ou n'est envisageable à l'heure actuelle, du fait d'une grande complexité anatomique, histologique et microbiologique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalables afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 25 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon le design suivant : (risque alpha = 10%, 1-beta=90%) et (p0=70%; p1=90%).

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée à la règlementation à savoir un compartiment minimal de 800cm² par animal. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie).

Choix des espèces

Rats Whistar mâles sexuellement matures pour plus de robustesse et pour faciliter la chirurgie (pharynx plus grand). Modèle animal de pharyngotomie simple, fiable et robuste, déjà décrit dans la littérature.

18 404 animaux non-humains, dont 13 048 rats, 2 780 souris et 2 576 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un produit par gavage quotidien pendant jusqu'à seize semaines, les femelles subissent des lavages vaginaux répétés et une partie des animaux a été ovariectomisée ou castrée, pour évaluer la toxicité de produits sur la reproduction selon des lignes directrices réglementaires. Le porteur indique que le produit testé peut altérer l'accouplement, la gestation, la mise bas et le développement des descendants, et que la nature des nuisances dépend de chaque substance. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces essais et les présente comme "indispensables" à la mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet doit permettre l’évaluation de la toxicité d’un produit chez le rongeur et le lagomorphe sur les fonctions de reproduction notamment, et/ou sur la santé, conformément aux lignes directrices : - ICH M3 (R2), S5 (R2). - OCDE 421 et/ ou 422. - OCDE 440 et/ou 441. Les procédures peuvent être indispensables pour une mise sur le marché ou un enregistrement de produit, et permettre la sélection de doses pour des études postérieures. Les études de cette procédure permettent aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition en fournissant des informations sur les effets toxiques majeurs (détermination d’une dose sans effet adverse, d’une marge de sécurité pour l’utilisation/exposition humaine).

Bénéfices attendus

Ces études permettent d’intégrer globalement l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce). En effet, à ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais des études in vivo restent indispensables pour une évaluation complète de l’exposition maternelle à certains produits. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441 correspondent au Niveau 3 de test de screening in vivo dans le contexte du « Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens » (GD 150 (OCDE, 2018)) et ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires dans le contexte de la démarche et dans la suite des tests précédents, comme test de screening essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien.

Procédures

Les animaux sont traités le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière (jusqu’à 16 semaines, mais dépend du type d’étude), avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux (jusqu’à 5 semaines). Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle (jusqu’à positivité du test), observations ophtalmologiques (en général 1 occasion par étude), mesures de pattes (1 à 2 fois par semaine jusque l’âge adulte), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels, en général 1 occasion par étude). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur. Chaque technique (administration par voie orale, réalisation d’un frottis vaginal, examen ophtalmologique, mesure de la longueur de la pattes, évaluation du comportement) dure moins d’une minute par paramètre par animal. Les animaux utilisés dans le cadre des OCDE 440/441 pourront avoir fait l’objet d’une chirurgie (femelles ovariectomisées ou mâles castrés), tel que demandé par les lignes directrices. Cette chirurgie aura été réalisée chez le fournisseur d’animaux, selon autorisation du fournisseur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, des difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, des altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. La toxicité du produit administré peut cibler chaque phase. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ces types de procédure en raison de la complexité que représente un organisme vivant et celle des processus de développement des concepti et des échanges dynamiques entre mère et descendance. Ces études in vivo, ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires au cours de cette démarche et dans la suite des évaluations et tests précédents. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441, font partie d’une batterie d’essais in vitro et in vivo permettant d'identifier les substances susceptibles d’interagir avec le système endocrinien, et, à terme, d’évaluer les risques et les dangers pour la santé humaine ou l’environnement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est en moyenne de 20 par sexe afin d'obtenir au moins 16 portées par groupe permettant d'avoir des résultats cohérents. Au-dessus de 20-24, il n'y a pas d'amélioration de la cohérence et de la précision des résultats. Ce nombre de portées par groupe (entre 16 et 20-24) est recommandé par la ligne directrice ICH. Le nombre d’animaux par groupe est lui aussi celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état de santé des animaux est contrôlé tous les jours et évalué par rapport à des points limites définis de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e). Si nécessaire, un vétérinaire peut intervenir, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable (i.e., en conformité avec la réglementation en vigueur). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. En cas de plaie et/ou douleur, possibilités de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les lagomorphes ou rongeurs, notamment le rat, sont les espèces de choix car : - recommandées par les lignes directrices et pertinentes pour atteindre les objectifs des études, - présentent notamment une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de descendants par portée, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rat, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - font l’objet de données historiques robustes, - l'utérus des rattes est considéré (notamment par les lignes de l'OCDE 440) comme un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et des antagonistes des œstrogènes, puisque les tissus utérins répondent par une croissance rapide et vigoureuse à la stimulation par les œstrogènes, - l’emploi de rats castrés et des cinq tissus sexuels cibles est jugé pertinent par les lignes directrices de l'OCDE 441 pour le dépistage in vivo d’agonistes et d’antagonistes des androgènes et d’inhibiteurs de 5α-réductase. Le produit sera administré à des animaux juvéniles ou adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement), car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements et doivent correspondre aux âges requis par les lignes directrices. Dans les OCDE 440/441 : conformément aux exigences des lignes directrices associées, le produit pourra être administré à des animaux ayant subis une chirurgie (femelles ovariectomisées ou males castrés), car l’activité endocrine endogène des animaux doit être réduite au minimum afin de pouvoir évaluer l’effet du produit seul. Les petits qui naissent dans le cadre de certaines études (OCDE 421/422), seront gardés pendant une partie de la lactation (selon les lignes directrices ; observation du développement des petits pendant les premières périodes de vie).

9 chiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à la colonie de l'établissement. Ils subissent trois prélèvements sanguins et une injection intraveineuse lente de fibroblastes gingivaux humains sous tranquillisation, pour vérifier l'innocuité de ce produit avant un futur essai visant le traitement de l'atopie du chien. Le porteur décrit une longue phase d'habituation avec caresses et croquettes pour réduire le stress. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne convient et que le chien, espèce cible de la mise sur le marché, ne peut être remplacé.

Objectifs

L’objectif de cette étude préclinique est d’évaluer l’innocuité (l'absence d'effets néfastes) d’une injection intraveineuse de fibroblastes (cellules jeunes, peu différenciées) gingivaux humains chez le chien, afin de tester par la suite, dans une étude clinique ultérieure faite sur chiens de propriétaires, leur efficacité dans le traitement de l’atopie (inflammation chronique de la peau). Les cellules mésenchymateuses, comme les fibroblastes gingivaux d’origine humaine ou animale, sont des produits d’origine biologique avec une très forte capacité de régénération. Des travaux expérimentaux (reconnus par des publications internationales et par l’obtention de brevets) ont montré qu’il était possible de transposer le pouvoir cicatrisant et anti-inflammatoire du fibroblaste gingival, cellule majoritaire de la gencive, à trois types de tissus très différents : les artères, la peau et l’appareil locomoteur (articulations, tendons). Ces cellules assurent la restauration de la fonctionnalité de l’organe lésé, notamment suite à une agression infectieuse, inflammatoire ou traumatique. L’utilisation des fibroblastes gingivaux humains est actuellement envisagée dans le traitement de l’atopie chez le chien. Cette maladie chronique de la peau, qui représente une des affections majeures rencontrées en dermatologie vétérinaire, résulte à la fois d'anomalies de la barrière cutanée, et d'une réaction de l'organisme à des allergènes de l'environnement (acariens de poussières de maison, pollens …), plus rarement alimentaires ou microbiens, conduisant à une inflammation chronique du tégument. L’utilisation des fibroblastes gingivaux se fera par administration intraveineuse chez le chien, et permettra de limiter voire même d’éviter une administration répétée, parfois quotidienne, de corticoïdes et d’immunosuppresseurs, habituellement utilisés dans le traitement de cette affection et ayant des effets néfastes à plus ou moins long terme. Les fibroblastes gingivaux sont déjà utilisés chez le chien et le cheval en administration intra-articulaire dans le traitement de l’arthrose chronique. Ils permettent de remplacer avantageusement la prise répétée d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, et donc d’éviter les effets secondaires associés. Cette thérapie cellulaire, utilisée en médecine régénérative, représente des options thérapeutiques innovantes et efficaces pour l’animal et pour l’Homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’innocuité (l'absence d'effets néfastes) de l’administration intraveineuse de fibroblastes gingivaux humains chez le chien, pour ensuite proposer une étude clinique d’efficacité réalisée sur chiens de propriétaires atteints d’atopie. Cela permettra de construire le dossier d’autorisation de mise sur le marché de cette thérapie cellulaire chez le chien, qui sera une alternative innovante et intéressante à l’administration quotidienne de corticoïdes et/ou d’immunosuppresseurs, et donc un bénéfice pour les animaux atteints de cette pathologie chronique. Cette étude représentera en parallèle des données d’efficacité et d’innocuité dans un objectif translationnel à l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 prélèvements sanguins. Il s'agit de gestes vétérinaires de routine qui se déroulent en quelques minutes. Ils recevront une injection intraveineuse lente (1 ml/kg) sur une durée de 20 minutes environ. Ils seront tranquillisés pour cette injection.

Impact sur les animaux

Les chiens pourront être stressés par le passage de leur lieu d’hébergement vers la salle d’examen où seront réalisés les examens cliniques, les prises de sang et l’injection intraveineuse. Des actions de renforcement positif seront mises en place au cours de la période d’acclimatation en amenant régulièrement chaque animal dans la salle, en le laissant au minimum 5 minutes sur la table d’examen, au cours desquelles il sera caressé par le manipulateur qui lui parlera, puis avant de quitter la salle, quelques croquettes lui seront données. Les prises de sang et la pose de la voie d’accès veineux (cathéter) seront réalisées par du personnel compétent, habilité et entrainé. Les personnes en charge des soins quotidiens des chiens, et donc connues par ces derniers réaliseront l’habituation pendant la période d’acclimatation, et seront également présentes lors des manipulations de chaque chien (prise de sang, pose de la voie veineuse, injection, …) afin de rassurer les animaux et donc de diminuer leur stress.

Devenir

A l'issue de la procédure, les chiens retourneront dans la colonie de l'établissement utilisateur.

Remplacement

L’administration intraveineuse de fibroblastes gingivaux humains a été réalisée chez la souris dans une étude préalable, sans effet délétère observé. Le passage chez le chien est donc nécessaire en vue d’une obtention de mise sur le marché de cette thérapie pour cette espèce cible. L’objectif de cette thérapie cellulaire est de proposer les fibroblastes gingivaux comme traitement de l’atopie chez le chien après administration intraveineuse, aucune autre alternative n’est donc envisageable à ce stade.

Réduction

Les effets secondaires éventuels liés à une injection intraveineuse de fibroblastes gingivaux humains chez le chien n’ont pas été rapportés. Ainsi nous nous sommes basés sur des études similaires disponibles dans la littérature afin de déterminer le nombre minimal et optimal d’animaux à utiliser dans cette étude. Après consultation des résultats de ces différentes équipes (utilisant des effectifs de 3 à 10 animaux par groupe, avec une moyenne de 4 à 5 chiens, groupes témoin et traité n’étant pas nécessairement équilibrés), un nombre minimum de 5 chiens pour le groupe traité et de 4 chiens pour le groupe témoin semble requis pour obtenir des données nécessaires et suffisantes pour la réalisation de tests statistiques adaptés et exploitables. Nous avons donc choisi d’utiliser 5 chiens dans le groupe traité, et 4 chiens dans le groupe témoin, afin d’inclure un nombre minimal d’animaux dans notre étude.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions de l’étude pour une durée minimale de 15 jours avant le jour d’administration de la suspension de fibroblastes gingivaux ou du soluté contrôle (J0). Les locaux d’hébergement climatisés toute l’année seront les mêmes que ceux de l'expérimentation, les animaux pourront simplement être changés de boxe pour faciliter le déroulé de l’étude. Au cours de cette période, des actions de renforcement positif seront mises en place en amenant régulièrement chaque animal dans la salle où seront réalisés les différents actes (examens cliniques, prises de sang, injection intraveineuse), en le laissant au minimum 5 minutes sur la table d’examen, au cours desquels il sera caressé par le manipulateur qui lui parlera, puis avant de quitter la salle, quelques croquettes lui seront données. Par ailleurs, cette salle est connue des chiens de l’EU, car ils y sont régulièrement manipulés pour des actes non invasifs : peignage, coupe de griffes ; il ne s’agira donc pas pour eux d’un lieu « nouveau ». Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’étude, et en cas d’observation anormale, le vétérinaire sanitaire de l’EU sera immédiatement averti. Les examens cliniques, les prises de sang et la pose de la voie veineuse seront réalisés par du personnel compétent et entrainé, permettant de réaliser ces actes très rapidement. Les personnes en charge des soins quotidiens des chiens, et donc connues par ces derniers réaliseront l’habituation pendant la période d’acclimatation, et la contention lors de chaque manipulation (prise de sang, pose de la voie veineuse, injection), afin de les rassurer et donc de diminuer leur stress. Une sédation légère sera réalisée, afin de diminuer le stress lié à l’injection intraveineuse lente, qui nécessitera un maintien de l’animal sur la table d’examen pour une durée de 20-25 min environ. Le cathéter sera placé une fois l’animal tranquillisé. Enfin, une surveillance clinique accrue (examen clinique complet, mesure de l’oxymétrie de pouls) sera mise en place au cours de l’administration intraveineuse de fibroblastes, puis à 1h, 2h, 3h, 6h, 24h et 48h après. Un nouvel examen clinique sera réalisé en fin d’étude à 7 jours (en plus des observations quotidiennes).

Choix des espèces

L’espèce utilisée pour cette étude est l’espèce cible de cette thérapie cellulaire, car il n’existe pas de modèle in vitro ou de modèle animal actuellement pertinent ou disponible permettant une extrapolation de résultats obtenus et reproduisant la complexité d’un organisme de chien et qui pourrait être utilisés pour la demande de mise sur le marché. En outre, comme indiqué précédemment, il s’agit d’une étude préclinique règlementaire. Nous utiliserons des chiens adultes. L’atopie se déclare chez le chien adulte, généralement âgé de plus de 2 ans. Nous utiliserons donc des chiens de plus de 2 ans dans cette étude.

20 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules à tester en administration unique ou répétée jusqu'à quinze jours, puis sont tués dans les quatre heures pour prélever des structures cérébrales et en mesurer les neuromédiateurs. Le porteur indique que les composés peuvent provoquer prostration, hyperlocomotion, perte de poids, stéréotypies, agressivité voire convulsions, auquel cas les animaux sont écartés et tués. Il justifie le recours au rongeur par la "nécessité" d'un système nerveux "intègre" pour évaluer les molécules.

Objectifs

La communication entre les différentes cellules du système nerveux central s’effectue via la libération de molécules, des neuromédiateurs, se liant à des récepteurs localisés sur les cellules cibles. Les nouveaux composés à tester, agissent sur ce système de transmission entre cellules nerveuses en activant ou inhibant la libération de neurotransmetteurs, en activant ou bloquant les récepteurs cibles. Afin de connaitre l’action de nos nouveaux composés sur l’activité de ces systèmes neurochimiques nous avons besoin d’évaluer les contenus en neuromédiateurs (dopamine, noradrénaline, acétylcholine, histamine…) et leurs métabolites (molécules résultant de leur dégradation) dans le cerveau ou des zones particulières du cerveau (hippocampe, hypothalamus, striatum, cortex…) de rongeurs. Pour ce faire nous avons besoin d’administrer nos composés à des rongeurs afin d’observer leurs effets sur les contenus en différents neuromédiateurs cérébraux.

Bénéfices attendus

La technique de neurochimie va permettre d'orienter la recherche de nouvelles molécules à visée thérapeutique - en permettant de vérifier leurs actions positives sur des systèmes neurochimiques connus pour être défaillants dans certaines pathologies psychiatriques (trouble du sommeil, dépression, anxiété, schizophrénie...). - au contraire en vérifiant leur absence d'effet délétère sur certains systèmes neurochimiques pouvant être impliqués dans des effets indésirables (addiction, hypolocomotion...). - en aidant la chimie médicinale à déterminer les familles de molécules ayant le plus d'activité sur un système neurochimique ciblé et à optimiser le(s) composé(s).

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration aigüe ou chronique (maximum 15 jours, deux fois par jour) de molécules à tester. La mise à mort se fera au maximum 4 h après la dernière administration de composé.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de sélectionner les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être une prostration ou une hyperlocomotion, une perte de poids (si traitement chronique), des stéréotypies, de l'agressivité voir des convulsions. Si ces signes sont détectés, les animaux sont écartés de l'expérimentation et euthanasiés.

Devenir

L'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever les différentes structures centrales d'intérêt.

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour les mesures de neurochimie est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système nerveux intègre. En effet, le fonctionnement neurochimique du cerveau est particulièrement complexe avec de nombreuses interactions entre les différents systèmes neurochimiques des différentes régions du cerveau.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

L'euthanasie des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien-Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors l’euthanasie de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Dans le cas d'une expérimentation chronique, en plus de la surveillance continue pendant 1h30 post-traitement, une fiche de suivi journalier est mise en place : tout signe de mal être (prostration, poils hérissés, perte de poids supérieure à 15% dans le cas des traitements chroniques, convulsions) entraînera l'exclusion de l'animal du protocole et son euthanasie (par exposition à une concentration croissante de CO2).

Choix des espèces

- La taille adéquat de l’animal : les rats et les souris présentent une taille suffisante pour permettre des microdissections de structures déterminées du cerveau. - Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée et documentée chez le rat et la souris. Les études de neurochimie pourront être menées aussi bien sur de jeunes animaux sevrés que sur des animaux adultes en fonction des objectifs.