Autres tests de tolérance et d’efficacité
Caractérisation et sélection de composés ciblant un nouveau mécanisme d’action biologique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil, c'est-à-dire une mise à mort sous anesthésie sans reprise de conscience. Auparavant vigiles, elles subissent des contentions, des injections et une administration orale de composés, puis sont endormies et tuées pour prélever sang et organes, afin de caractériser la pharmacocinétique et la biodistribution d'inhibiteurs enzymatiques. Le porteur affirme avoir mené de nombreux tests in vitro et sur embryon de poisson zèbre en amont pour limiter le recours aux souris. Il conclut que l'expérimentation animale est "obligatoirement requise" par les agences réglementaires avant tout essai clinique, sans autre alternative.
Objectifs
Le projet consiste à caractériser les propriétés de pharmacocinétique, de pharmacodynamique et de biodistribution de composés inhibiteurs d'une famille d'enzyme par voie systémique et orale. Au final, le but sera d'identifier et d'isoler les meilleurs composés. Les résultats constitueront un ensemble de données qui alimenteront le dossier préclinique réglementaire en vue d'obtenir les autorisations pour réaliser les essais cliniques chez l’Humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples et d’une très grande valeur pour le développement pharmaceutique envisagé. Cibler le mode d’action de l’enzyme d’intérêt n’a jamais été réalisé dans le panorama scientifique et pharmaceutique. A terme ces composés pourront servir à réaliser des essais cliniques humains dans des indications médicales comme certaines neuropathies, pour espérer apporter de nouveaux traitements dans des maladies présentant de forts besoins médicaux insatisfaits. Ainsi, les résultats du projet alimenteront la base de connaissances scientifiques et renseigneront sur les effets pharmacologiques et potentiellement toxiques de la voie de signalisation ciblée. L’ensemble des travaux proposés alimenteront le dossier à soumettre aux agences réglementaires en vue d’obtenir les autorisations d’essais cliniques. Ce projet permettra également de développer les compétences des équipes sur la recherche pharmaceutique qui pourront largement être mises à profit pour de futurs projets et pour la diffusion des connaissances.
Procédures
Les souris vigiles recevront des manipulations de "classe légère", comme des contentions (30 à 45 secondes, 3 à 4 fois maximum, sur une période de 24 heures) et des procédures équivalentes à une piqûre (15-30 secondes, un maximum de 3, sur une période de 24 heures). Pour les administrations en voie orale (une seule fois par animal), la contention et l'administration dureront au maximum 1minute par animal. Pour les manipulations classées sans réveil, les animaux recevront un analgésique, puis seront endormis par anesthésie générale (20 à 25 minutes, une seule et unique fois pour un animal). Nous veillerons à l’application des gestes corrects par le personnel qualifié pour limiter le stress des animaux et assister pendant toute la procédure à l'observation des animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Un de nos composés administré par voie systémique à des souris à des doses 4 fois supérieures à la dose efficace n’a présenté aucune toxicité apparente, ni à l’échelle macroscopique ni sur des paramètres anatomopathologiques. Ce résultat préliminaire important présage de l’absence ou du peu d'effets indésirables. De plus, nous savons que les données de la littérature entrevoient un profil de toxicité favorable pour nos inhibiteurs. Les animaux seront manipulés avec ou sans contention et seront soumis à des prélèvements de petits volumes sanguins, suffisants pour réaliser les analyses, mais n’entraînant pas de perturbations physiologiques. Ces manipulations représentent des douleurs de l’ordre d’une piqûre. Pour l'ensemble du projet, nous avons établi un score de suivi des animaux basé sur l'apparence physique, des signes cliniques et comportementaux pour contrôler nos procédures et limiter toute souffrance animale. Notamment, nous répertorierons toute anomalie liée au comportement (la tonicité et la réactivité), la posture (s’il y a isolement), l’alimentation, la température corporelle, les excrétions ; Et rapporterons le cas échéant, tout effet délétère au responsable du bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des mesures à prendre. En cas d'effet indésirable avéré, aucun animal ne sera laissé sans traitement palliatif, et si non applicable, sera immédiatement sorti du protocole.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’échantillons et d’organes afin de les analyser. Ces échantillons uniques et précieux permettront de réaliser les analyses microscopiques pour déterminer les effets de l’action des composés inhibiteurs et déterminer quels organes reçoivent ou non la molécule, ce qui permettra de réaliser la caractérisation à visée pharmacologique et réglementaire. L’euthanasie sera réalisée conformément aux méthodes recommandées par la réglementation et les comités d'éthique et de bien-être animal. Nous veillerons au contrôle des méthodes utilisées par le personnel formé et qualifié pour éviter toute souffrance animale.
Remplacement
Pour caractériser le devenir de nos composés inhibiteurs dans un organisme, le recours à l’expérimentation animale est obligatoirement requis par les agences réglementaires avant le passage à l’expérimentation clinique humaine. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris vivantes, sans aucune autre alternative. Toutefois, avant de proposer de tester nos composés inhibiteurs chez la souris, nous avons réalisé une multitude de tests in vitro, in cellulo et ex vivo pour traquer de potentiels effets toxiques et/ou indésirables. Jusqu’alors, nous avons analysé et confirmé que nos inhibiteurs n’engendrent aucun effet sur la prolifération et la survie cellulaire, le métabolisme énergétique, le métabolisme du calcium intracellulaire cardiaque. Nous avons également évalué la toxicité sur le développement de l’embryon de poisson zèbre par balnéation sans relever d’effet toxique notable. Avant de rédiger ce projet, nous avons veillé à mettre au point des méthodes robustes de détection et d’analyse sur des modèles non animaux. En somme, toutes ces préparations en amont permettent de drastiquement limiter les mises au point sur des échantillons issus de l’expérimentation animale.
Réduction
Nous avons déjà vérifié qu’un de nos composés ne provoque aucun dommage sur des neurones primaires de rétine jusqu’à dix fois la dose efficace. De plus, nous avons réalisé des expérimentations sur des lots très restreints d'animaux pour évaluer les potentiels effets délétères de nos composés sur le système nerveux ou plus généralement dans la circulation générale et n’avons relevé aucun effet dommageable. Le déroulé de ce projet, construit sur une séquentialité, permettra de bien choisir les doses minimales et maximales à utiliser et de révéler les organes cibles où les molécules s’accumulent : ces données sont prédictives des effets indésirables à anticiper et permettront de réduire de façon significative le nombre d’animaux. Nous avons défini des filtres décisionnels de sélection permettant d'étudier les composés inhibiteurs sur un faible nombre d’animaux de manière incrémentale et ainsi de rapidement réduire le nombre de composés à analyser et le nombre d'animaux. Ensuite, nous avons prévu d’arrêter chacune des procédures dès lors que les objectifs seraient atteints (par exemple, retenir 5 composés formulés ou non). Ceci permettra de facto de réduire le nombre d’animaux. Des tests statistiques sont prévus pour établir des corrélations clés, évaluer systématiquement la robustesse des résultats obtenus et interroger leur significativité. Ces tests permettront de contrôler la variabilité expérimentale, ce qui limitera drastiquement le nombre de répétition. En somme, ces analyses permettront de cerner des tendances ou valider des résultats sans recourir à un grand nombre d’animaux.
Raffinement
A réception, les souris seront stabulées une semaine dans leur habitat d’hébergement avant toute manipulation. Aucun animal ne sera jamais délaissé en isolement. De manière générale, pour pallier au manque de recul de l’effet de nos composés, les animaux traités seront suivis rigoureusement et quotidiennement pour traquer l’émergence d’effets indésirables potentiels. La méthodologie choisie permettra de détecter l’atteinte des « points limites » les plus précoces. Nous prévoyons de rapporter tout effet délétère au responsable de bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des orientations à suivre. Plus spécifiquement, notre stratégie de raffinement prévoit de rechercher l’émergence d’effets toxiques selon le suivi du comportement (agitation ou prostration), de l’apparence physique des animaux (clôture des yeux, aspect du pelage et du poil), et du suivi des signes cliniques (température corporelle, rythme respiratoire, poids corporel, état des fèces). De plus, nos travaux cadreront les fonctions rattachées aux organes à monitorer. Nous porterons alors une attention stricte aux fonctions biologiques liées à ces organes. Nous prévoyons qu’aucun animal présentant un signe de souffrance ne sera laissé sans traitement palliatif. Nous prévoyons une prise en charge des nuisances en apportant un complément à l’alimentation et à l’eau si nécessaire. Un animal recevant une injection sera désinfecté localement avec un antiseptique. Les manipulations plus invasives prévoient d’abord une analgésie, puis une anesthésie générale pour pallier à toute douleur potentielle.
Choix des espèces
La souris est un des modèles de petit animal de laboratoire utilisé pour étudier les caractéristiques pharmaceutiques in vivo pour des inhibiteurs de nature chimique. De plus, ce modèle est reconnu par les agences réglementaires de médicaments pour constituer les preuves pharmaceutiques et scientifiques en vue d'obtenir les autorisations d'essais cliniques. Puisque l’application de nos composés inhibiteurs est prévue pour des adultes, ce projet prévoit donc d’utiliser des souris mâles et femelles adultes, ce qui permet de réaliser l’étude alors que le contexte hormonal adulte est déclenché. Nous n'avons pas trouvé d'alternative de remplacement.
Etablissement d’un modèle de maladie rénale chronique (MRC) chez le chat.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
150 chats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 50 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Une maladie rénale chronique leur est induite par un agent viral, avec prises de tension, prélèvements d'urine par cystocentèse et de sang répétés, avant mise à mort pour analyse des reins. Le porteur énumère les atteintes possibles de la maladie induite, de l'anorexie à l'anémie, tout en affirmant vouloir empêcher l'atteinte d'un stade sévère par des points limites. Le modèle doit servir à tester de futurs médicaments chez le chat et à éclairer la maladie humaine.
Objectifs
Le projet a pour objectif la mise au point d’un modèle félin de maladie rénale chronique chez le chat, représentatif de la pathologie dans son développement réel. A terme, le modèle pourra permettre l’évaluation de l’efficacité et de l’innocuité de candidats médicaments dans la prise en charge des MRC félines.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet repose sur la mise au point d’un modèle de MRC peu invasif et reproductible chez l’espèce cible (chat), permettant d’induire des changements rénaux identiques à ceux d’une maladie rénale chronique chez l’animal sain. La mise au point de ce modèle pourra permettre, par la suite, d’investiguer de nouveaux candidats médicaments ayant une action au niveau des mécanismes pathogéniques, afin d’améliorer la qualité de vie et d’allonger l’espérance de vie chez les chats atteints de MRC. L’établissement d’un modèle de MRC chez le chat pourra améliorer notre connaissance du développement et de la pathophysiologie de la MRC chez l’homme. Le succès d’un modèle de MRC chez le chat ouvre aussi la voie à l’investigation de nouvelles modalités de prise en charge des fibroses rénales, néphropathies et maladies rénales chroniques chez l’humain.
Procédures
Les animaux issus du groupe test et contrôle positif ou du groupe contrôle si placebo subissent une administration de l'agent viral pour induction MRC ou placebo. Cet acte technique est pratiqué sous anesthésie générale en intra-veineux une fois au début de l'étude. Tous les animaux ont une prise de la tension arterielle en vigil à l'aide d'un bracelet et doppler à la queue. Cet acte technique est répété 1 à 4 fois par mois si nécessaire tout au long de la procédure expérimentale. Tous les animaux ont des prélèvements d'urine en vigile ou durant l’anesthésie. Cet acte technique est pratiqué en cystocentèse (sous échographie, si nécessaire) 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire tout au long de la procédure. Tous les animaux ont des prélèvements sanguins en vigile ou durant l’anesthésie. Cet acte technique est pratiqué à la jugulaire 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire (prélèvement maximal de 15% du volume circulant sur 28 jours en cumulé) tout au long de la procédure expérimentale. Tous les animaux ont des examens physiques complet en vigile 1 à 4 fois par mois ou si nécessaire tout au long de la procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
L’objectif du projet étant la mise au point d’un modèle félin de MRC, les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont ceux d’une MRC, à savoir : - Lésions associées à la maladie rénale chronique, par exemple : fibrose rénale, inflammation tubulointerstitielle. - Répercussions extrarénales d’un dysfonctionnement rénal : • Azotémie et urémie, pouvant se traduire cliniquement par : de l’apathie, de l’anorexie, un amaigrissement, des ulcérations des muqueuses, de la déshydratation, de l’apathie, des troubles digestifs (vomissements, diarrhées ou constipation), des signes nerveux, du ptyalisme, une polyurie-polydipsie (liste non exhaustive). • hypertension systémique pouvant impacter différents systèmes (ex : système nerveux central, cardio-vasculaire, oculaire), • protéinurie rénale persistance pouvant se traduire par des signes cliniques (ascite, œdèmes périphériques) correspondant au « syndrome néphrotique » • Perturbation des fonctions rénales et par conséquent des paramètres biochimiques et hématologiques : o diminution de l’excrétion de créatinine, de sulfates o diminution de l’excrétion de phosphate et de la synthèse de calcitriol, pouvant conduire à une hyperparathyroidie secondaire rénale entraînant des signes cliniques ou augmentation de la kaliémie entraînant des signes cliniques (ex : troubles cardiaques) o perturbation de l’équilibre acido-basique (acidose métabolique) o diminution de la production d’érythropoïetine pouvant mener à une anémie o dépression immunitaire • Modifications de la volémie Cependant, la durée de la procédure étant limitée, il n’est pas attendu de voir l’ensemble de ces signes cliniques et/ou des signes de sévérité importante. Les points limites, établis sur la base d’un suivi clinique attentif et paraclinique, visent à empêcher toute atteinte d’un point sévère.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques des tissus rénaux, pour évaluer la pertinence du modèle à induire des modifications rénales semblables à la MRC. Les changements structurels rénaux pourront aussi être évalués par une analyse macroscopique.
Remplacement
Les MRC sont le résultat de phénomènes dynamiques entrainant l’altération progressive et irreversible de la fonction rénale, avec des répercussions extrarénales importantes et délétères. La mise au point d’un modèle in vivo s’avère indispensable, afin d’améliorer la compréhension de la maladie et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments non seulement sur le rein, mais également sur les répercussions des MRC sur les autres organes et sur l’organisme. La capacité du TGF-β sur l’induction de modifications fibrotiques rénales a été évaluée in vitro et in vivo. Le tropisme de FeMV pour les cellules rénales a déjà été démontré in vitro et in vivo. Les FeMV recombinant exprimant TGF-β auront montré une capacité d’expression de TGF-β in vitro. L’évaluation finale des candidats médicaments sélectionnés sur un modèle vivant de MRC reste indispensable pour apprécier leur efficacité et/ou leur innocuité dans le cadre d’une maladie dégénérative complexe, d’où la nécessité de disposer d’un modèle de MRC félin. De plus, des données d’efficacité et d’innocuité sur l’espèce cible doivent être fournies dans les dossiers réglementaires.
Réduction
Dans la perspective de réduction, les effectifs sont évalués au plus juste (historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre de chats utilisés tout en garantissant une approche rigoureuse et ceci afin d’éviter le risque d’études non conclusives. Une recherche de littérature non systématique a montré que les groupes se constituaient de 4 à 21 chats (5; 6; 7) dans les modèles antérieurs de CKD. Lorsque le statut des animaux le permet, les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par un vétérinaire, seront réutilisés
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. La durée optimale est de 7 jours pour des chats provenant de fournisseurs référencés. Des points limites spécifiques ont été définis afin de limiter le plus précocement possible la douleur des animaux. Ces critères sont en constante évolution pour les améliorer afin de réfleter au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est compétent pour identifier des signes d’inconfort ou de douleur. Une anesthésie et une analgésie peuvent être réalisées lors de certains actes si nécessaire. Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements : - Des opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal. - En cas d’administration et/ou de prélèvements douloureux ou répétées, ou pouvant entrainer un stress important, une anesthésie et/ou une analgésie peuvent être réalisées - La zone de prélèvements peut évoluer - Les animaux sont entrainés à la contention et aux méthodes de prélèvement afin de réduire le stress et l’inconfort lors de la réalisation des actes techniques. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Les chats ont à disposition des méthodes d’enrichissement adaptées afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Le développement d’un modèle spécifique pour les MRC félines est nécessaire pour l’étude de ces maladies et les études d’efficacité et/ou d’innocuité de médicaments candidats sur l’espèce cible. Des jeunes chats et des adultes seront utilisés. Les 2 catégories d’animaux peuvent être utilisés pour parvenir à mettre au point un modèle fiable. Les maladies rénales chroniques affectent les chats adultes.
Etudes de toxicologie de la reproduction avec observations post-natales longues chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 57566
71 086 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par gavage quotidien, les femelles subissent des lavages vaginaux et les petits nés sont suivis jusqu'à l'âge adulte, avant mise à mort pour examen des organes. Le porteur présente ces tests de toxicité sur la reproduction comme "indispensables" et "nécessaires" réglementairement pour la mise sur le marché de produits. Les effets attendus incluent des atteintes de la gestation, de la mise-bas et du développement des descendants.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché ou d'enregistrement d'un produit et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).
Bénéfices attendus
A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.
Procédures
Les animaux (adultes principalement, parfois des juvéniles) sont traités, le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle, observations ophtalmologiques, mesures de pattes, évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. Le produit administré peut cibler chaque phase du cycle de reproduction. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les procédures et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés à l’âge des animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage, tube de contention). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation, etc.
Choix des espèces
Bien que le rat soit l’espèce la plus fréquemment utilisée, le rat et la souris sont des espèces de choix car : - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits générés par gestation, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).
Modèle experimental de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 3300
Lapins : 3300
9 900 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Une sécheresse oculaire leur est induite par instillations répétées, pose de patchs, pompes osmotiques sous-cutanées ou ablation chirurgicale des glandes lacrymales, avant mise à mort pour analyses. Le porteur décrit picotements, brûlures et sensibilité à la lumière comme nuisances attendues. Les modèles doivent servir à tester de futurs traitements, dont l'efficacité reste à démontrer.
Objectifs
L'objectifs de ce projet est de pouvoir proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire plus fréquente chez les femmes, les personnes âgées et qui concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien représentés et décrits dans la littérature. Nous en avons sélectionné 3, parmi les plus référencés, les plus efficaces en terme d’impact sur la surface oculaire et la diminution de la sécrétion de larmes et les moins contraignants pour l’animal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleurs conditions possibles et dans le respect du bien-être animal.
Procédures
Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie transdermique (pose de patchs dermiques), sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Dans certains cas, comme la pose de pompes osmotiques en sous cutanée ou l'ablation des glandes lacrymales extra-orbitales situées juste sous la peau, une petite chirurgie unique dont la durée n'excèdera pas cinq minutes sera nécessaire. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur les recommandations du Gircor et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux ou bien encore une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme. L'administration en sous cutanée ou en transdermique pourra occasionner une petite inflammation avec l'apparition de rougeurs sans conséquence majeure.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, ELISA...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (cornéen, rétinien, vitréen, vasculaire, nerveux...) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. l'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans l'études auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 3 jours minimum.
Etudes d’innocuité d’un médicament destiné au chat
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
225 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart (215) tués et un petit nombre réutilisés ou adoptés. Ils reçoivent des administrations répétées d'un vaccin, des prélèvements de sang et des écouvillons, et sont euthanasiés quand un prélèvement terminal ou une nécropsie est requis. Le porteur présente ces tests comme une exigence réglementaire d'évaluation de l'innocuité sur l'espèce cible. Il affirme que les essais in vitro ne peuvent pas se substituer aux études sur l'animal vivant.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un vaccin sur le chat ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement, humains).
Bénéfices attendus
Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des vaccins présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux.
Procédures
Administrations de produit : 1 à 4 administrations sur une durée de 2 à 16 semaines. Cet acte peut être effectué sous anesthésie selon la sensibilité de l'animal. L'acte technique a une durée de 1 à 2 minutes. Prélèvements sanguins : 1 à 10 prélèvements sur la durée de l'étude. L'acte a une durée de 1 à 2 minutes. Des écouvillons (conjonctival ou pharyngé ou salivaire, nasal ou rectal) peuvent être effectués en fonction de l'objectif de l'étude. 0 à 10 écouvillons sur la durée de l'étude. Cet acte technique est inférieur à 1 minutes
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide, moins douloureuse et moins traumatisante. La répétition des administrations et des prélèvements sur le long terme peut occasionner une douleur de quelques minutes.
Devenir
Les animaux, sur lesquels un prélèvement sanguin terminal ou une biopsie post-mortem du site d’injection ou une nécropsie est requis(e), sont euthanasiés. Les animaux dont les points limites sont atteints sont euthanasiés pour raison éthiques. En fonction des études antérieures et si leur statut le permet, les animaux peuvent être utilisés dans d’autres projets. En fonction du produit administré et de l’état de l’animal et si les circonstances le permettent (acquéreur sérieux, bonnes conditions d’accueil après examen du candidat par la SBEA), les chats peuvent être adoptés. La réutilisation et l'adoption de l’animal est de la responsabilité du vétérinaire désigné qui évalue le bien-être des animaux à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’innocuité doit être réalisée sur l’animal. La diffusibilité, la persistance et l’intégration de l’agent vaccinal doivent être réalisées dans l’organisme cible pour que les conclusions soient valides. Il s’agit d’exigences réglementaires. Les essais in vitro et in vivo sur des espèces alternatives permettent d’obtenir des informations complémentaires et prédictives, mais ne peuvent se substituer à des études in vivo sur l’espèce cible. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible ne disposent pas toute d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à limiter les études non conclusives. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour chaque étude une période d'acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal peut être envisagée lors de certains actes, ainsi qu’une alternance des zones ou site de prélèvements lorsque cela est possible. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur l’espèce cible est une exigence règlementaire. Le chat est l’espèce cible pour le produit testé. Les chats utilisés ont entre 8 et 104 semaines. L’âge dépend des besoins pour les études d’innocuité et de diffusibilité qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du vaccin mis sur le marché et des exigences des autorités.
« Read-out » pharmacologique par hypothermie induite et biodistribution chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs par plusieurs voies et des prélèvements de sang à la queue, l'effet étant lu à travers une baisse provoquée de leur température corporelle, pour évaluer des molécules censées franchir la barrière du cerveau. Le porteur reconnaît un risque de choc immunitaire, de réaction allergique ou de détresse cardio-respiratoire, tout en pariant sur l'absence d'effet à court terme. Les animaux sont tués par exsanguination sous dose létale d'anesthésique pour prélever sang et tissus.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde et, à l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénratives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts de recherches, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer et de proposer à terme des perspectives thérapeutiques. Le savoir-faire de la société consiste en la conjugaison de peptides vecteurs à des pro-drogues ou molécules en cours de développement, voire déjà utilisées sur le marché, mais dont l'efficacité reste insuffisante ou encore à démontrer. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès au région ou organes à traiter. La maladie d’Alzheimer est un de ces exemples de neuropathies majeures, pour laquelle aucun traitement efficace n’existe, tout comme bon nombre de pathologies périphériques ou cancers. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre des partenaires endogènes spécifiques (récepteurs cellulaires) et d'utiliser leurs mécanismes naturels de trancytoses pour traverser les barrières cellulaires, protectrices des régions et organes sensibles de l'organisme. Dans notre cas, il s'agira en priorité du passage de la Barrière HématoEncéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). Par ce principe, nous pouvons passer naturellement ces barrières et amener in situ le médicament par la technique du cheval de Troie. Un avantage considérable qui permet de concentrer les médicaments au niveau des tissus à traiter et ainsi, de potentialiser les chances de traitements. Cette demande de projet s'inscrit dans ce contexte, en développant et optimisant nos molécules-vecteurs (VHH : Domaine variable chaine lourde Anticorps) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques. Par des approches systémiques, en administration intra-veineuses ou dermiques, en sous-cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur lignée murine consanguine (C57BL/6J) et génétiquement modifiée pour un récepteur cible.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (3R : raffinement), ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. Le faible nombre d'individus et l'optimisation des tests mettent en avant l'importance et la nécessité de bien caractériser la procédure. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours de notre procédure, nous allons manipuler les animaux en vigile, ce pour toutes les administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) ou prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl). Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou injections répétées. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois. L'animal sera alors placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes de 50 µl de sang. En point final de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. Les prélèvements finaux en post-mortem (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg), aiguille 25G (‘’5/8’’ ; 0.5*16mm), environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubation relativement courts. D’une part, sur un read-out de la thermorégulation corporelle, pour valider le passage spécifique à travers la barrière hémato-Encéphalique du cerveau. D’autre part et sur les mêmes animaux, une biodistribution plus précise et quantifiable de nos VHH sélectionnés, et/ou une mesure d’efficacité, par dosage des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. Les cinétiques d'incubations (maximum quelques jours) ne suffisent pas à générer d'effets indésirables ou de conséquences physiologiques, notamment, car les conjugués administrés présentent une demi-vie relativement courte, de quelques minutes à quelques heures. Le principal risque se trouve être la réaction immunitaire aigüe et spontanée. Dans le cadre de nos recherches, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplée par de la littérature, ainsi que de notre expertise chimie et in vivo. Les composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité. Le savoir-faire de la société et les données issues de la littérature nous permettent d'anticiper les principaux risques de toxicité, couramment observés post-administration (choc immunitaire (anaphylactique) ; réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Dans le cadre de nos études, les conjugués VHH pourront être couplés à des peptides, drogues, ou autres, tel que de petits ARN interférents (siRNA). Ces derniers nous intéressent particulièrement, car leur rôle sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Notre étude, sur fond standard C57BL/6J et lignée hTfr (même fond ; cf. Annexe 2), permettra de mieux comprendre et appréhender les disfonctionnements physiologiques, sans que pour autant nos conjugués VHH n'aient, à court termes, d’effets sur la santé et le bien-être animal (3R : raffinement). Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance (cf. Procédure, annexe1 MGS), le tout accompagné d'un suivit du poids des animaux entre le début et la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
A l'issue de la procédure (biodistribution) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal ; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg). Si des problèmes ou souffrances anormales sont rencontrées en cours de procédure, alors les animaux seront immédiatement sédatés par la même solution d’anesthésique à dose létale, suivit d’un sacrifice par une dislocation des cervicales.
Remplacement
Pour mener à bien nos modèles précliniques après validation in vitro, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, modèle indispensable pour l’étude des mécanismes in situ (3R : remplacement). Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront, malgré tout, d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives (3R : remplacement et réduction).
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 3 études de 80 individus (10 groupes sur fond C57BL/6J et 10 groupes sur fond mutant hTfr), suffisant pour appréhender un effet de la sélection de conjugués sur les souris des 2 lignées. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec. Pour la partie échantillonnage et prélèvements de tissus en fin de procédure, une liste précise et déclinée sur plusieurs types de post-expérimentations, permettra d'optimiser chacune des souris, de manière qu'il n'y ait pas d'utilisation abusives et inutiles de souris. La réalisation de prélèvements intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permettra d'obtenir des données plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal (voir points limites Annexe 1 MGS), appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain (C57BL/6J et C57BL/6J hTfr), la simplicité des administrations uniques ou répétées (administration i.v. 5.5ml/kg (Aiguilles 27G (3/4 ; 0.4/19mm)) ; s.c. 10ml/kg (Aiguilles 26G (‘’3/8’’ ; 0.45*10mm)) et i.p. 10ml/kg (Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm))) sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules (cinétique de quelques heures à maximum 1 semaine), nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de chez deux fournisseurs différents.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études pré-cliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé dans la racherche en expérimentation animale, notamment par sa physiologie connue (mammifère) et relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations, l’obtention de groupes jusqu’à 6-8 individus sans trop de contraintes de stabulation. Le modèle souris est surtout préférentiel lorsqu’il s’agit de mette en place l'élevage d’une lignée génétiquement modifiée avec une (des) mutation(s) donnée(s), ou encore d'étudier de nombreux modèles de pathologies, plus facilement accessibles. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus, qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Efficacité de la Léciréline pour induire l’ovulation chez la jument, et impact sur la survenue d’une gestation à 12 jours
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 juments vont être utilisées, puis rendues au troupeau expérimental de l'établissement, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chacune subit un suivi gynécologique sur quatre cycles avec échographies transrectales quotidiennes, inséminations, injections d'induction de l'ovulation, collectes d'embryons par lavage utérin et biopsie utérine, pour tester une molécule (léciréline) déclenchant l'ovulation. Le porteur déclare "aucun" impact sur les animaux, alors que les actes répétés touchent l'appareil génital. Le bénéfice annoncé vise la filière d'élevage équin, et le porteur affirme que l'usage de juments de l'espèce de destination est "indispensable".
Objectifs
Tester l'efficacité de la léciréline (molécule analogue de la GNRH) pour l'induction de l'ovulation ainsi que son impact sur la survenue ou non d'une gestation chez la jument. Cette étude se propose de réaliser le suivi gynécologique de 40 juments durant 3 mois (avril, mai, juin), sur 4 ovulations chacunes. Chacune des juments devra subir deux inductions d'ovulation par une injection de Léciréline et deux inductions d'ovulation par une injection de gonadotrophine chorionique humaine (hCG), les ovulations 1 et 3 seront induites sur chaleur délenchée par un traitement lutéolytique (injection de Cloprosténol), tandis que les ovulations 2 et 4 seront induites sur retour en chaleur spontané. On pourra ainsi comparer l'efficacité de la léciréline à celle de la gonadotrophine chorionique humaine sur chaleurs spontanées et sur chaleurs déclenchées par un traitement lutéolytique (cloprosténol) sur 40 juments. Par ailleurs, l'impact de la molécule utilisée pour induire l'ovulation sur le taux de gestation sera évalué grâce à l'exploitation en insémination artificielle (semence fraîche) 24 heures après l'induction d'ovulation des deux cycles spontanés de chaque jument. Suite à des collectes d'embryons à 12 jours post ovulation, les effets de l'âge et de la parité de la jument sur l'embryon seront aussi déterminés.
Bénéfices attendus
Offrir à la filière élevage équin des données d'inocuité et d'efficacité d'une molécule légalement utilisable chez la jument pour l'induction de l'ovulation, selon le principe de la cascade. Améliorer les connaissances liées aux effets du vieillissement de la jument sur l'embryon
Procédures
- échographie ovarienne et utérine par voie transrectale (2 minutes par examen, examen quotidien à biquotidien du début des chaleurs au constat d'ovulation) - insémination artificielle par voie transcervicale (1 minute, 2 fois par jument) - injection intraveineuse d'induction de l'ovulation (5 secondes, 4 fois par jument) - injection intramusculaire de cloprosténol (3 secondes, 2 fois par jument) - collecte d'embryon par lavage utérin par voie transcervicale (15 minutes, 2 fois maximum) - prise de sang (10 secondes, 1 par collecte, 2 fois maximum) - biopsie utérine (5 minutes, 1 fois par jument ayant donné un embryon) - Lavage utérin pour réalisation de cytologies (en même temps que la collecte d'embryon pour les juments avec un diagnostic de gestation positif à 12 jours et 15 minutes, maximum 2 fois par jument pour celles n'ayant pas donné d'embryon).
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
Retour au sein du troupeau expérimental de l'établissement utilisateur
Remplacement
L'objectif étant de valider l'inocuité et l'efficacité de la léciréline chez la jument, cet essai clinique impose l'utilisation d'individus vivants de l'espèce de destination (cheval).
Réduction
Exploitation de 4 cycles oestraux sur chaque jument afin de réduire le nombre d'animaux impliqués. Chaque jument sera son propre témoin. Afin de réduire l'utilisation des animaux, une collecte d'embryon sera effectuée au cycle 2 et 4 si un diagnostic de gestation positif est obtenu à J12. Des tests statistiques unilatéraux seront utilisés pour tester l'hypothèse de non-infériorité clinique de la léciréline par rapport au traitement de référence (hCG) sur la survenue de l'ovulation et de la gestation. Après la vérification de la normalité des données, des modèles linéaires à effets mixtes seront effectués à l’aide du logiciel Rstudio pour analyser l’effet de l’âge et de la parité. Si les données ne sont pas normales, des tests de permutations seront effectués pour corriger la p-value.
Raffinement
Les juments utilisées pour ce protocole sont des animaux parfaitement habitués aux examens et manipulations qui leur seront imposés dans le cadre de notre étude (examen gynécologique, insémination artificielle, collecte d'embryon par lavage utérin, injection intramusculaire, injection intraveineuse, prise de sang). Elles resteront dans leur environnement habituel (en groupe) où elles seront manipulées par leurs soigneurs habituels. Les actes de suivi gynécologique seront exclusivement réalisés par un vétérinaire équin expérimenté en suivi de reproduction de la jument. Les actes d'insémination artificielle, de collecte d'embryon, de lavage utérin, de biopsie, d'injections intraveineuse et intramusculaire et de prise de sang seront exclusivement réalisés par des manipulateurs habilités (inséminateurs équins, chefs de centre ou vétérinaire).
Choix des espèces
Il s'agit d'un essai clinique chez la jument d'un médicament vétérinaire disposant d'une autorisation de mise sur le marché pour cette même indication chez la lapine et la vache. L'utilisation d'animaux femelles à maturité sexuelle, de l'espèce de destination est indispensable.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies génétiques
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 450
2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.
Réduction
Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.
Raffinement
LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.
Choix des espèces
Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.
Evaluation de l’activité hémostatique d’un nouveau scellant biosourcé sur le modèle porcin
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
13 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Sur chaque animal, plusieurs saignements sont provoqués par incisions et sections d'artères pour tester des scellants hémostatiques, l'intervention durant de trois à quatre heures pour le premier animal. Le porteur vise le choix d'une solution destinée au marquage CE et énumère des complications possibles comme hémorragie, arythmie ou nécrose des tissus. Il affirme que "seule l'expérimentation animale permet d'évaluer" l'arrêt d'un saignement et retient le cochon pour sa proximité anatomique avec l'humain.
Objectifs
Avec la normalisation de la pratique chirurgicale et l’accroissement de la prise en charge des opérations en France et dans le monde, le nombre d’interventions chirurgicales est en constante augmentation. Ceci accroît considérablement les risques hémorragiques liés à la pratique chirurgicale (notamment section de tissus et de vaisseaux). Ainsi, le développement de solutions hémostatiques permettant l'arrêt du saignement est primordial afin de permettre au chirurgien de stopper les hémorragies per- et éventuellement post-opératoires. Bien qu'il existe de nombreuses solutions sur le marché, aucune aujourd'hui n'est réellement satisfaisante. L'arrêt d'un saignement est un mécanisme complexe dont seule l'expérimentation animale permet d'évaluer l'efficacité. Ainsi ,après avoir développé un panel de cinq solutions pouvant répondre à cette problématique et effectué des tests in vitro permettant d'en éloigner deux, nous sommes forts de trois scellants pouvant potentiellement permettre l'arrêt d'un saignement. Ainsi, l'objectif de cette étude est l'évaluation préliminaires de nos composés par leur capacité à créer l'hémostase, et leur comparaison à des produits déjà présents sur le marché. Le tout afin de situer leur efficacité vis-à-vis des solutions existantes, mais également de diriger un choix vers un scellant final qui sera ensuite amené jusqu'au marquage CE.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de finaliser le choix d'une solution parmi les trois scellants développés, ainsi que de comprendre leur positionnement en termes d'efficacité et de temps d'arrêt du saignement par rapport à des hémostatiques, scellants et colles déjà présents sur le marché. Sans cette évaluation, il ne sera pas possible de choisir avec certitude une solution et continuer avec celle-ci jusqu'au marquage CE.
Procédures
Sous anesthésie générale, quatre types de saignements (S1, S2, S3, S4 soit 4 sites différents) seront créés sur un même animal. Pour les saignements S1 et S2, 5 incisions distinctes et équivalentes seront réalisées par sites, à des distances raisonnables pour appliquer les 3 solutions (H1; H2; H3) et les 2 références pour un temps d'intervention d'environ 10min par site. Pour les saignements S3 et S4, un site par produit (solution ou référence) sera sélectionné pour un temps d'intervention d'environ 10min par site. Les quatre types de saignements créés sont les suivants : -S1: saignement sous cutané - S2 : saignement musculaire diffus - S3 : saignement actif - S4 : application des produits en complément de sutures. Dans ce cas précis, les 3 soutions et 1 seule référence seront testés, sur 4 différentes artères. Le temps d’arrêt du saignement sera mesuré pour chaque saignement et chaque produit. Il sera défini par la durée entre l’application du produit et l’obtention de l’arrêt du saignement (en sec). Une fois les solutions appliquées, une évaluation macroscopique sera réalisée et l'hémostase sera confirmée visuellement. L'homogénéité des films obtenus sur les tissus sera notée ainsi que l'apparition de fuite. Les inflammations et éventuelles nécroses seront notées. Pour S3 et S4, et principalement S4, une échographie sera réalisée afin de mettre en évidence la présence de thrombose ou de fuite de produit dans les vaisseaux. Le temps d’intervention par saignement crée est évalué au maximum à 10 minutes. La durée totale d'intervention sur ce porc est estimée de 3H à 4H. Pour les douze porcs suivants, le cas échéant: un site, un type de saignement et une solution seront utilisés par animal. La procédure reste identique avec un temps d’intervention par site estimé à 10min, mais des coupes histologiques seront prélevées afin d'être étudiées.
Impact sur les animaux
Potentielles complications per-opératoires: Bradycardie, Hypotension, Arythmie, Hémorragie non contrôlée, Hypothermie, Défaut d'adhérence aux tissus, réaction inflammatoire, réaction allergique et nécrose des tissus.
Devenir
Concernant la phase de faisabilité, c’est çà dire le premier porc sur lequel plusieurs sites d’intervention pour plusieurs produits seront étudiés avec prélèvement de coupes histologiques , à la fin de la procédure on procèdera à la Mise à mort de l’animal. Concernant la phase sélective, sur les 12 animaux au maximum utilisés, on procèdera également à la mise à mort à la fin de la procédure afin de prélever les coupes Histologiques. La mise à mort est réalisé sous anesthésie générale par injection d'un agent euthanasiant, puis les animaux sont mis au congélateur avant d'être enlèver par un écariseur agréé
Remplacement
Des essais préliminaires in vitro sur l'effet hémostatique de ces solutions en utilisant des animaux morts (souris) ont été réalisés au préalable de ce projet. Les résultats de ces tests ont permi de faire un premier choix parmi les 5 solutions hémostatiques et n'en retenir que 3 à tester. Ainsi 2 solutions ont été éliminées afin de minimiser le nombre d'animal et les essais à réaliser sur le même animal. De plus, en parallèle de ce projet, des tests in vitro sur du sang total de donneurs humains sont prévus afin d'éviter l'utilisation de nombreux animaux.
Réduction
Après des essais in vitro permettant de sélection 3 solutions, l’objectif est ici de vérifier le comportement hémostatique de ces 3 solutions retenues dans ce projet, afin d’en sélectionner 1 ou 2 comme DM appartenant à la catégorie de gel hémostatique non spécifique sur la cascade de coagulation. Pour cela, 2 produits commercialisés comme agent hémostatique, 1 spécifique sur la coagulation et 1 non spécifique, seront utilisés comme témoins. Ces 5 produits devront être testés sur 4 types de saignement représentatifs (sous cutané, musculaire diffus, actif, en complément d’anastomose). Pour le premier lot correspondant à une étude de faisabilité, les 2 variables étudiées étant de nature dichotomique (succès ou échec), la non nécessité de répétabilité et la taille de l’animal, nous permettront d’utiliser un nombre minimum de porc soit un premier lot de 1 seul animal. Pour le deuxième lot correspondant à une étude sélective, 1 porc par site et par produit, le nombre minimum d’animal de 12 porcs a été défini selon des tests statistiques à variable dichotomique. Nous avons défini que pour l’analyse statistique, nous prendrions en compte que 2 solutions (solutions « succès ») au maximum parmi les 3 et qu’un seul produit témoin était suffisant pour comparaison. De plus, nous avons considéré que les 4 types de saignement au maximum suffisaient à démontrer le pouvoir hémostatique de notre ou nos solutions et que l’analyse de la répétabilité pourra être réalisée sur le même animal qui sera ensuite euthanasié
Raffinement
Ceci passe par la gestion des principales complications per-opératoires par la réduction ou l'ajout en perfusion ou directement par voie intraveineuse de solutions médicamenteuses. Seront traîtées des complications telles que la bradycardie, l'hypotension, l'arythmie ou encore une hémorrhagie (contrôlée ou non). En plus de ces gestions des complications, le bien être des animaux avant opération est supervisé par une acclimatation au laboratoire d'environ 4 jours, des contrôles vétérinaire avant le départ de l'éleveur puis au laboratoire,et les porcs seront stabulés seuls pour éviter tout stress. Enfin, l'intervention se fera sous anesthésie générale afin de limiter la douleur.
Choix des espèces
Le porc est un animal de choix car le porc possède certaines caractéristiques physiologiques, anatomiques et génétiques proches de celles de l’être humain. C’est en particulier le cas de ses fonctions cardiaques, pulmonaires et rénales, qui sont bien plus proches des nôtres que ne le sont celles de la souris. Les chirurgiens l’utilisent notamment depuis longtemps pour s’entraîner à la pose de cathéters, s’exercer aux procédures endoscopiques ou à soigner des traumatismes complexes. Le développement de ces techniques a conduit à utiliser le porc comme modèle préclinique, pour tester notamment les dispositifs implantables tels que les pacemakers. La taille des organes du porc, similaire à celle des organes humains, ou le fait que la distribution du sang par son artère coronaire soit très similaire à celle de l’Homme, rendent aussi son utilisation très pertinente dans le cadre de la transplantation d’organes. Utilisation d'animaux adultes (45-50kg, âge: 16 semaines) afin de se rapprocher au plus de l'utilisation finale du dispositif médical (DM), soit principalement chez l'humain adulte.
Développement de colles résorbables pour la prévention du sérome post chirurgie carcinologique mammaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
98 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée. 88 d'entre eux subissent une ablation de la mamelle avec curage sous anesthésie, avec un suivi pouvant aller jusqu'à 90 jours, tandis que 10 reçoivent des injections sous la peau. Le porteur reconnaît des douleurs après l'opération, des infections locales et des ulcérations possibles de la plaie, pour évaluer une colle destinée à prévenir le sérome après chirurgie du cancer du sein. Il décrit le rat comme l'espèce animale la moins évoluée de taille suffisante et présente cette étape comme un préalable indispensable aux essais chez l'humain.
Objectifs
Le cancer du sein représente le 1er cancer et la première cause de décès par cancer chez la femme, dont le traitement de référence consiste dans 80% des cas à l’exérèse chirurgicale de la tumeur, associée ou non au curage axillaire. La complication la plus fréquente après chirurgie oncologique mammaire est le sérome. Il s’agit de la formation d’une masse non cancéreuse ou d’un œdème causé par l’accumulation de sérum. Bien que de nombreuses techniques et colles biocompatibles ont fait preuve de diminution de l’incidence des séromes après mastectomie et/ou curage axillaire, toutes restent encore imparfaites à l’heure actuelle. Ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle approche de prévention du sérome et de ses complications et d’envisager une cicatrisation optimale après la chirurgie oncologique du sein, via l’application d’une colle biologique innovante sous forme de mousse, dans l’espace mort engendré par l’exérèse de la pièce opératoire. Cette étude expérimentale se déroulera chez le rat et constitue un préalable indispensable à la réalisation d’essais cliniques chez l’Homme. Le rat est l’espèce animale la moins évoluée et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie carcinologique et reconstructrice. Le modèle expérimental est le rat adulte ayant fait l’objet d’une mastectomie avec curage axillaire associé.
Bénéfices attendus
Développement d'une nouvelle colle biocompatible qui a pour but de prévenir l'appartition de sérome lors de chirurgies oncologiques du sein.
Procédures
Des animaux seront soumis à des injections sous-cutanées (4 injections, 1 fois) sous anesthésie gazeuse : 10 animaux. Durée de suivi des animaux post-injection : maximum 8 semaines. Des animaux seront soumis à une masectomie sous anesthésie gazeuse : 88 animaux. Durée du suivi post-opératoire : maximum 90 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui pourraient être observés sont - pour les injections sous-cutanées : erythème de différents grades en fonction de la réponse, démangeaisons - pour les animaux subissant une masectomie : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalés et pris en charge par l'expérimentateur.
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort à la fin de chaque procédure afin d'effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de prévention du sérome sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.
Réduction
Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux et compte tenu que les expériences ne sont pas de classe sévère, des cohortes d’animaux pourront être utilisées pour répondre à plusieurs objectifs (informations sur la biocompatibilité, informations sur l’efficacité de la colle, etc. ) Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations).
Raffinement
Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les injections de colle et l'imagerie de fluorescence seront réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile). Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la moins évoluée et de taille suffisante pour permettre l’établissement d’un modèle expérimental de mastectomie et curage axillaire par rapport à la situation clinique chez l’homme. En effet, la physiopathologie du système lymphatique et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modèle permet ainsi la réalisation d’études précliniques de chirurgie carcinologique avec évaluation radiologique et histologique. Rats wistars adultes de 10 semaines pour avoir des rates d’âge adultes, suffisamment âgées pour avoir eu une croissance mammaire suffisante (afin de réaliser la mastectomie) et de taille suffisamment grande pour aider à la réalisation des gestes microchirurgicaux.
Utilisation de sang d’ovins pour évaluer l’hémocompatibilité d’un système d’assistance circulatoire cardiaque gauche
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 brebis vont être utilisées dans des procédures classées légères, sans être tuées à l'issue. Chacune subit des prélèvements de sang à la jugulaire, jusqu'à 400 à 450 millilitres une fois toutes les trois semaines, pendant deux ans et demi, pour tester in vitro l'hémocompatibilité d'une pompe cardiaque. Le porteur indique que les brebis seront réhabilitées, replacées ou adoptées par une association en fin de projet si leur bilan sanitaire le permet. Il affirme avoir choisi l'ovin pour sa "docilité", l'accès facile aux veines et une coagulation proche de celle de l'humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'utiliser du sang frais prélevé chez des brebis, afin d’évaluer et d’améliorer les interactions entre le tissu sanguin et la pompe cardiaque dévelopée par notre partenaire. Cette dernière est un dispositif médical appelé “assistance circulatoire gauche”, ou “LVAD”, destiné aux personnes souffrant d’insuffisance cardiaque grave. Il s’agit d’une pompe mécanique implantée chirurgicalement dans le corps et destinée à pallier un cœur défaillant. Le LVAD développé a pour ambition de recréer fidèlement les phases de remplissage et d’éjection du cœur natif sans pour autant exposer le sang aux dommages causés par les pompes actuellement commercialisées. Afin d’évaluer cet aspect sur des prototypes avancés de LVAD en cours de développement, puis dans le cadre de leur évaluation pré-clinique, il est nécessaire d’utiliser du sang frais prélevé dans des conditions permettant de préserver toutes ses caractéristiques biologiques.
Bénéfices attendus
Il est essentiel de caractériser les interactions des pompes LVAD avec le sang afin d’évaluer et de prévenir les risques d’hémolyse (destruction des globules rouges), de formation de thrombus dans la pompe (caillot), ou de dégradation de protéines sanguines essentielles. Les essais d’hémocompatibilité in vitro permettent de caractériser ces aspects dans des conditions contrôlées. Cependant, la qualité et la fraicheur du sang utilisé sont essentielles dans la réalisation de ces tests. Il est donc nécessaire de prélever le sang par ponction veineuse afin de minimiser les risques d’activation et de contamination extérieure. La norme en vigueur recommande l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin pour la réalisation de tests d’hémocompatibilité sur des pompes cardiaques car le tissu sanguin de ces animaux est très similaire à celui des humains. De plus l’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de ml) sans préjudice pour l’animal. Dans ce projet des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et des mécanismes de l’arrêt de l’écoulement du sang comparables à ceux observés chez l’humain.
Procédures
Un prélèvement sanguin par ponction veineuse au niveau de la veine jugulaire de moins de 10% du volume total (environ 400-450 mL) jusqu’à un maximum d’une fois toutes les 3 semaines pendant 2 ans et demi, pourvu qu’aucun point limite n’ait été atteint.
Impact sur les animaux
Les brebis pourront ressentir un peu de fatigue à la suite du prélèvement sanguin, comme tout un chacun à la suite d'un don de sang. Alimentation et abreuvement seront disponibles à volonté pour tous les animaux prélevées. Dans le cadre de ce projet le prélèvement de sang se limitera à 10% du volume sanguin total, et 3 semaines minimum de repos seront respectées entre chaque prélèvement. L'état des muqueuses des animaux ainsi que leurs numérations de formules sanguines seront controlées régulièrement afin de dépister toute survenue éventuelle d'anémie
Devenir
Toutes les brebis seront réhabilitées/replacées ou adoptées (par une association de protection animale qui gère la réhabilitation des animaux de laboratoire), dans la mesure où leur bilan sanitaire nous y autorisera, en fin de procédure.
Remplacement
L'étude des interactions biologiques entre le LVAD CorWave et le sang est réalisé in vitro mais nécessite d’avoir recours à du sang frais prélevé chez des animaux vivants. Bien que la pompe CorWave soit développée en amont à partir de simulations numériques et de tests hydrauliques in vitro de pointe, ces derniers ne permettent pas dans l'état actuel des connaissances d’évaluer les interactions biologiques complexes avec le sang.
Réduction
Les dispositifs LVAD sont conçus pour pomper 5L de sang dans un organisme humain. Le nombre d'animaux impliqués dans le projet sera réduit au minimum grâce à l'utilisation de systèmes de test in vitro des dispositifs LVAD exploitant de faibles quantités de sang. Les tests in vitro de ces dispositifs réduisent les volumes de sang nécessaires à quelques centaines de millilitres par dispositif testé, réduisant ainsi la fréquence et le volume des prélèvements sanguins à effectuer. Un volume de 2 L permet ainsi de comparer 4 designs de pompe différents en une semaine.
Raffinement
L’étude de l’hémocompatibilité du LVAD in vitro à partir de sang prélevé par ponction veineuse permet de réduire le recours à des études d’implantation in vivo de classe « sévère » ou « sans réveil ». L’utilisation d’ovins se limite ainsi dans ce projet à une procédure expérimentale de classe « légère » qui ne devrait pas avoir d’incidence sur l’état général des animaux. Aucune souffrance ou stress significatif n’est attendu dans ce projet. Des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et une hémostase comparable à celle de l’Homme. Les animaux seront hébergés en troupeau et placés au maximum en situation d'éco-paturage en extérieur. Ils ne seront isolés que le temps du prélèvement sanguin.
Choix des espèces
L’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de mL) sans prejudice pour l’animal. Les normes en vigueur recommandent donc l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin. Des brebis adultes seront utilisées afin de pouvoir prélever le volume de sang nécessaire sans affecter la santé de animaux.
Etude de l’activité de trois nouveaux antibiotiques dans un modèle d’infection urinaire à Gram négatif chez la souris.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
685 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection urétrale d'entérobactéries sous anesthésie pour reproduire une infection urinaire, afin de tester trois nouvelles molécules antibiotiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer poil hérissé, dos voûté, perte de poids, écoulements oculaires et comportement apathique, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour mesurer la charge bactérienne dans les reins. Il affirme que les techniques in vitro ne donnent pas de données fiables sur l'activité in vivo d'un antibiotique et juge le recours au modèle animal "indispensable".
Objectifs
Les entérobactéries sont fréquemment responsables d’infections communautaires ou nosocomiales. Elles sont généralement traitées par des bêta-lactamines, mais au cours des deux dernières décennies, on observe une augmentation importante de la résistance des entérobactéries à ces antibiotiques ce qui pose aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Le but de notre étude est d’évaluer l’activité de trois nouvelles molécules dans un modèle d’infection urinaire expérimentale chez la souris.
Bénéfices attendus
Développement de nouvelles molécules qui pourraient être actives sur les souches bactériennes multi résistantes, l'antibiorésistance étant devenue un problème majeur, avec l'émergence et la diffusion croissante de souches bactériennes de plus en plus résistantes aux antibiotiques.
Procédures
Tous les animaux infectés recevront une injection par voie urétrale de la souche bactérienne sous anesthésie générale à l’isoflurane. Cette procédure dure 5-7min. Ils recevront également une injection sous cutanée d’une molécule anti-douleur avant infection, en vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient présenter, un ou plusieurs effets indésirables parmi les suivants : Poil hérissé, dos vouté, perte de poids, larmes, yeux collés, isolement, comportement apathique, respiration ralentie ou difficile.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans la procédure 1 seront euthanasiés à la fin de la procédure 1 afin d’étudier la charge bactérienne dans les reins. Tous les animaux utilisés dans la procédure 2 seront euthanasiés à la fin de la procédure 2 après l’évaluation d’une potentielle modification du comportement suite à l’injection des nouvelles molécules. Tous les animaux utilisés dans la procédure 3 seront euthanasiés à la fin de la procédure 3 afin d’évaluer l’efficacité des nouvelles molécules sur la charge bactérienne dans les reins.
Remplacement
Les techniques in vitro ne permettent pas d’obtenir des données fiables sur l’activité in vivo d’un antibiotique. La corrélation in vitro - in vivo n’étant pas satisfaisante, le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable.
Réduction
Les premiers temps de l’expérimentation consistent à la validation du modèle avec les souches à étudier, ce qui permet d’utiliser le moins d’animaux possible lors de l’évaluation thérapeutique proprement dite. Pour les évaluations thérapeutiques, le nombre de souris par groupe a été réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable.
Raffinement
Avant l’expérimentation : - Détermination des points limites Pendant l’expérimentation : - Soins pré et post intervention : Les souris recevront une injection d’une molécule anti douleur avant infection. Puis mise en place d’une grille de score de points limites - Infection : utilisation de tapis chauffant pendant l’anesthésie - Application des points limites - Euthanasie : sous anesthésie générale
Choix des espèces
Le modèle murin d’infection urinaire est un modèle bien caractérisé et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Cinq semaines de vie permettant une manipulation simple sur un animal robuste.