Autres tests de tolérance et d’efficacité

Pour valider un dispositif d'ultrasons focalisés destiné à traiter les varices humaines, 5 cochons et 10 brebis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs veines saphènes. Chaque animal est traité sur ses deux veines saphènes sous anesthésie générale, jusqu'à quatre heures, puis suivi par trois à six échographies d'une demi-heure. Le porteur présente la technique comme "plus rapide et indolore" pour les patients, et signale que des brûlures cutanées ont été observées sur les sites traités lors d'essais précédents. La brebis est retenue parce qu'une norme ISO la recommande, le cochon parce que sa peau ressemble davantage à celle de l'être humain, les essais antérieurs ayant montré que celle des brebis était trop fine.

Objectifs

L'insuffisance veineuse superficielle est l'une des maladies majeures dans le monde, actuellement traitée par ablation thermique ou sclérothérapie. La technologie d'ultrasons focalisés de haute intensité utilisant une modalité thermique peut être utilisée pour obtenir l'oblitération des varices, avec certaines limitations : un temps de traitement long et douloureux. La méthode utilisant des ultrasons de haute intensité traite les varices de manière plus rapide et indolore. Jusqu'à présent, les études montrent que pour le traitement, il est nécessaire d'injecter un agent de contraste. Cette étude préclinique sur des animaux vise à démontrer la sécurité et la faisabilité de cette nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les varices sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront traités sous anesthésie générale, pour une durée maximale de 4 heures. Chaque animal recevra un traitement par veine, soit deux traitements au total. Un suivi échographique et post-traitement de la zone traitée sera réalisé à plusieurs points (entre 3 et 6), chaque session durant environ 30 minutes. Les porcs seront placés sous anesthésie générale, tandis que les brebis seront, si nécessaire, simplement sédatées pour cet examen.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est le léger stress et la douleur modérée lors de réalisation des tranquillisations des animaux. De plus, dans les essais précédents, des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde. Ce risque est donc très faible, mais nous devons mentionner qu'un léger échauffement peut être observé.

Devenir

Les animaux du projet seront mises à mort à la fin de chaque étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. Cependant, le porc a également été retenu en raison de la similarité structurelle et fonctionnelle de sa peau avec celle de l’homme, ce qui en fait un modèle plus adapté que l’ovin pour l’évaluation de traitements vasculaires transcutanés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été volontairement réduit grâce à une preuve de concept sur lapin et une étude de faisabilité sur brebis, permettant d’optimiser les paramètres de dispositif. Seuls 10 animaux sont nécessaires pour les deux études (validation de dose et étude réglementaire). De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. L’utilisation de 5 porcs, dont la peau est proche de celle de l’homme, permet une validation pertinente tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés.Les données seront analysées statistiquement via une statistique, afin d’optimiser l’interprétation des résultats sans avoir recours à un plus grand nombre d’individus.

Raffinement

Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant début de traitement. Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales. Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement en groupes harmonieux. Un programme spécifique d’habituation à la manipulation par l’homme est en place. Les ovins disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon) permettant à l'animal de jouer. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des brebis. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. Un renforcement positif sera également réalisé pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes. De plus, les points limites généraux suffisamment prédictifs sont définis dans ce projet.

Choix des espèces

La brebis est recommandée dans la norme ISO 10993-6 comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. En outre, la faisabilité a été évaluée lors d'une étude précédente, au cours de laquelle les mesures des veines saphènes des animaux ont été réalisées. Le porc a été ajouté à ce projet. Cet essai permettra d’évaluer le dispositif dans des conditions plus proches de l’humain, les essais réalisés sur les brebis ayant montré que leur peau était trop fine en comparaison. Brebis : Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme. Porc : les animaux autour de 60 kg seront utilisés, afin d'avoir un poids comparables à ceux de l'homme et des brebis adultes.

Trois vaccinations par injection et deux injections de sensibilisation sous anesthésie, trois prélèvements sanguins, puis trente minutes de mesure des capacités respiratoires : 7 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever leurs organes. Elles sont rendues allergiques puis traitées, afin de tester avant tout essai chez l'humain des vaccins d'immunothérapie contre l'asthme allergique. Le porteur ne détaille pas comment il arrive à 7 200 animaux et se borne à dire que l'effectif tient compte des paramètres analysés, des effets attendus et de la variabilité du modèle. Il décrit les nuisances au conditionnel, des douleurs locales de moins de cinq minutes et une gêne respiratoire qui pourrait durer moins d'une demi-heure, sans préciser ce que produit chez une souris une réaction asthmatique provoquée.

Objectifs

L'organisation mondiale de la santé a classé les maladies allergiques au quatrième rang mondial des affections, considérant que ces pathologies représentent un problème majeur de santé publique en termes de qualité de vie, de perte de jours de travail, de coût médicamenteux, voire de mortalité. Parmi les approches thérapeutiques proposées pour traiter les allergies respiratoires de type I, l’immunothérapie allergique est le seul traitement qui permet de réorienter la réponse du système immunitaire vers un état de tolérance spécifique de l’allergène. Le but du projet proposé est de permettre une évaluation préclinique de l’efficacité des vaccins thérapeutiques et de réaliser des tests de sécurité des produits en développement.

Bénéfices attendus

Ce projet, d'une durée de 5 ans va contribuer, avant toute étude clinique chez l’homme, à la sélection des principes actifs, et des modes d’administration qui composeront les vaccins du futur afin d’induire la tolérance vis-à-vis des allergènes responsables de la maladie chez les patients allergiques.

Procédures

Le projet comporte des gestes ou techniques expérimentales complémentaires. Des vaccinations par injection au nombre de 3 sous anesthésie flash d’une durée de moins de 5 minutes chacune sont réalisées. Une sensibilisation est obtenue par deux injections d’une durée de moins de cinq minutes chacune. Trois prélèvements de sang sous anesthésie sont aussi réalisés, la durée de chaque prélèvement ne dépasse pas quelques minutes. Des mesures des capacités respiratoires des animaux par des méthodes non invasives d’une durée de 30 minutes par protocole sont aussi effectuées pour vérifier l’efficacité des traitements utilisés

Impact sur les animaux

le projet comporte des gestes ou techniques expérimentales comme des traitements par injections dans les muscles et peuvent possiblement causer des douleurs locales d’une durée inférieur à 5 minutes, la mesure des capacités respiratoire des animaux peut possiblement engendrer du stress et une gêne respiratoire de courte durée (moins de 30 minutes). La contention des animaux pour traitement peut possiblement, aussi engendrer du stress de courte durée.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés sous anesthesie terminale en fin de protocole pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à un modèle animal car il est impossible de reconstruire un processus de sensibilisation/désensibilisation dans des cultures de cellules Seules les études in vivo permettent d'obtenir des résultats sur l'efficacité. Toutes les molécules étudiées ont été présélectionnées en amont avec des méthodes, biochimiques et des tests cellulaires in vitro

Réduction

Des pré-études de caractérisation et des tests in vitro de présélection sont réalisés en amont afin de ne tester sur les animaux que les formulations/traitements validés par ces pré-études. Si un principe actif ou une formulation ne satisfait pas aux exigences du cahier des charges, l’évaluation s’arrête ce qui aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’expérimentation. Les études publiées et les directives éthiques recommandent également de réduire au minimum le nombre d'animaux tout en garantissant la validité statistique. Le nombre d’animaux pour le projet a été déterminé en tenant compte des paramètres à analyser, des effets des traitements attendus et de la variabilités liée au modèles animaux, cela permet de s’assurer que l’on ne manque pas de puissance et de fiabilité pour ne pas à refaire les experiences.

Raffinement

Si au cours des experiences, des signes d’alerte, la surveillance sera accrue, les animaux seront pesés et des mesures correctives seront apportées : antalgiques s'il y a des signes de douleurs, séparation et soin local s’il y a des blessures entre congénères. Des anesthésies spécifiques sont utilisées pour limiter le stress et la douleur lors des injections et des prélèvements et des analgiques sont appliqués. Une grille de points limites, spécifique et suffisamment alerte et précoce est aussi élaborée, afin de limiter au minimum la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ce type d’expérimentation parce que son système immunitaire, très bien décrit est très proche de celui de l’Homme en termes de composition et fonctionnement. Aussi, Il existe une bibliographie très riche sur les modèles d’étude de l’allergie et de son traitement sur laquelle nos protocoles, analyses et interprétations peuvent s’appuyer ; ces études sont reconnus par la communauté scientifique internationale. Nous traillons avec des animaux adulte afin d’étudier les réponses immunologiques sur un système immunitaire mature.

100 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 60 réutilisés dans d'autres procédures et 40 placés à l'adoption, une partie étant tuée pour des prélèvements après la mort au cours des études d'efficacité. Sélectionnés parce que leur score de condition corporelle dépasse 7, donc déjà obèses, ils reçoivent une à trois administrations, jusqu'à neuf prélèvements sanguins et des périodes d'alimentation individuelle qui provoquent stress, baisse de prise alimentaire et perte de poids. Le bénéfice mis en avant pour les chiens obèses passe par l'autorisation de mise sur le marché de produits vétérinaires, objet réel du dossier. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode ne permet d'évaluer la pharmacocinétique sans travailler sur un "organisme entier".

Objectifs

L'obésité chez le chien est un problème de santé majeur, sachant que plus d'1 chien sur 3 est en surcharge pondérale et que l'obésité est associée à des désordres métaboliques comme le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires ou des troubles articulaires. L'objectif de ce projet est d’évaluer des produits vétérinaires destinés à lutter contre l’obésité chez le chien. Avant qu’un traitement ne soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’obésité de l’animal. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.

Bénéfices attendus

Ces études permettent de définir l’innocuité et l’efficacité des produits vétérinaires testés et d’expliquer la relation entre la dose et la réponse, c'est-à-dire, l'effet du produit. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Ces informations sont nécessaires à l’obtention d'une autorisation de mise sur le marché de nouveaux produits. Les bénéfices de ce projet sur la population canine obèse sont d’améliorer leur bien-être en réduisant les risques liés à l’obésité, désordres métaboliques comme le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires ou des troubles articulaires

Procédures

Les administrations s'effectuent sur animal vigile ou anesthésié, 1 ou 3 fois selon l'objectif de l'étude et durent environ 3 minutes. Les prélèvements sanguins s'effectuent sur animal vigile ou anesthésié en fonction du comportement de l'animal, 1 à 9 fois selon le protocole et durent environ 3 minutes. Enfin, un examen physique complet (incluant pesée et body condition score) de tous les animaux en vigile est prévu 1 fois ou plus si jugé nécessaire et dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les produits à l’étude ont déjà fait preuve de leur innocuité chez d’autres espèces (rongeurs). Les nuisances attendues sur les animaux sont : stress dû à la contention ; douleur / inconfort suite aux injections ou aux prélèvements ; stress pendant les périodes d’alimentation individuelle et baisse de prise alimentaire et perte de poids durant les périodes de traitement ; signes cliniques secondaires à l’obésité (apparition potentielle de troubles métaboliques, de douleurs articulaires, troubles cardio-vasculaires,...).

Devenir

Les animaux seront réutilisés et/ou adoptés. Dans le cadre de certaines études d'efficacité, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post mortem.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative au recours à l’animal permettant d’évaluer la pharmacocinétique ou la pharmacodynamie des produits pharmaceutiques vétérinaires. Les modèles in silico et/ou in vitro/ex vivo permettent de sélectionner des molécules potentiellement efficaces. Après cette première étape, les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamie nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques d’un futur candidat médicament.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires de pharmacocinétique/Pharmacodynamique (3 ou 4 animaux par groupe). Il sera ensuite calculé pour les études suivantes selon la variabilité entre individus observée antérieurement et pourra atteindre jusqu’à 10 animaux. Compte-tenu de la variabilité individuelle, les études d’innocuité et d’efficacité seront réalisées sur des groupes de 8 à 12 animaux. Ces effectifs s'évaluent en fonction de la bibliographie, de l'historique ou des objectifs de l'étude. Lorsque le statut des animaux le permet les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures et peuvent ensuite être réutilisés dans une future procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par le vétérinaire désigné, sont réutilisables.

Raffinement

Une période d’acclimatation optimale de 7 jours est prévue. Les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. Pour limiter le stress lié à l’alimentation individuelle, celle-ci est réduite au minimum (~1h30-2h), sans isolement visuel, olfactif et auditif. Afin d’identifier et gérer tout signe clinique secondaire à l’obésité, des examens cliniques, évaluation du body score, des pesées et des suivis sanguins réguliers sont réalisés. Un training est réalisé en renforcement positif (friandises, caresses), afin de limiter le stress lié aux actes techniques (contention, administrations, prélèvements) et aux conditions d’études. Pour réduire l’inconfort provoqué par les prélèvements, les opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal et une anesthésie et/ou analgésie et/ou un changement du site pourra être mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. Des points limites spécifiques au projet sont appliqués. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de la procédure, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. La SBEA garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit des espèces cibles pour les produits. Des données concernant l’espèce doivent être fournies au dossier pour l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché. Les animaux inclus sont des chiens présentant au minimum un score de condition corporelle supérieur à 7. Les chiens utilisés ont plus de 9 mois. L’âge dépend de l’objectif de l’étude et du scope d’utilisation du produit testé.

Injectées de plasmides par voie hydrodynamique, soumises à des prélèvements sanguins répétés puis infectées par le virus de la fièvre jaune, 1 000 souris, dont des lignées immunodéficientes et des lignées humanisées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection de plasmides provoque des hématomes, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, et que l'infection peut entraîner perte de poids, hypothermie, paralysie des membres postérieurs et mort. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique : il est estimé à partir du nombre d'études des années précédentes et d'une croissance anticipée, "en accord avec le plan commercial". Deux cents souris pourront être transférées vers un protocole de formation interne aux gestes techniques, à condition de n'avoir pas été infectées, les autres étant tuées en atteignant les points limites ou sur décision du vétérinaire.

Objectifs

La fièvre jaune est une maladie virale transmise par les moustiques, principalement dans les régions tropicales. Elle peut causer de la fièvre, des douleurs musculaires et des nausées. Dans 15% des cas, la maladie évolue vers une forme grave, caractérisée par une jaunisse et des hémorragies pouvant entraîner le décès du patient. Il n’existe pas de traitement antiviral pour soigner cette maladie, mais la vaccination est efficace pour la prévenir. Le vaccin est préparé à partir d’un virus vivant atténué. Les objectifs de ce projet sont multiples : - Modéliser et caractériser l’infection par le virus de la fièvre jaune dans des souris - Evaluer l’innocuité de composés de recherche à visée prophylactique ou thérapeutique (traitements ou vaccins) - Caractériser les réponses immunitaires induites par ces composés de recherche - Evaluer l’efficacité antivirale de ces composés de recherche chez des souris infectées par le virus de la fièvre jaune Pour répondre à ces objectifs, nous utiliserons des souris conventionnelles non-humanisées (immunocompétentes ou immunodéficientes), ou des souris dites humanisées (système immunitaire ou foie), ou doublement humanisées (système immunitaire + foie).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle préclinique prédictif permettant d'étudier le virus de la fièvre jaune ainsi que l’efficacité de composés de recherche innovants.

Procédures

Des administrations de composés à visées thérapeutiques seront réalisées avec une fréquence définie par le protocole d’étude. Leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection de plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de virus : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). L’infection par le virus de la fièvre jaune peut entraîner une perte de poids, une hypo-activité, une diminution de la température corporelle, une paralysie des membres postérieurs traduisant une atteinte neurologique, et la mort. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés soit parce qu’ils atteignent les points limites, soit par décision du vétérinaire. Certains animaux pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve que les souris n’aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection hydrodynamique et qu’elles n’aient pas été infectées avec le virus. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et le virus de la fièvre jaune, permettant de reproduire l’infection du virus tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés de recherche destinés à son traitement ou sa prévention. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 20 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études, ou pour le nombre total d’animaux dans le projet, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Le modèle murin a été choisi en raison de sa capacité à reproduire des aspects clés de la pathogénie de l’infection par le virus de la fièvre jaune, notamment en conditions d’immunodéficience ou après adaptation virale. Certaines souches ou lignées modifiées permettent de mimer la susceptibilité humaine (atteinte hépatique, réponse inflammatoire), ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation de composés antiviraux ou prophylactiques. Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines, première apparition des hépatocytes dans le foie.

Deux injections, une incision de la peau sous anesthésie, la pose d'un implant de titane recouvert d'un polymère, deux points de suture, puis une plaie inspectée chaque jour pendant trois jours et deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort. 27 souris femelles de huit semaines suivent ce parcours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour un prélèvement de tissu. Le porteur attend surtout des effets locaux, retard de cicatrisation, nécrose, infection, œdème ou hématome, et indique avoir réduit les groupes de cinq à trois animaux au vu de l'homogénéité des résultats antérieurs. Le choix de l'espèce vient d'une commande, le RNT précisant que "la demande de l'industriel a porté sur l'utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines".

Objectifs

Les infections bactériennes associées à la présence d’un biofilm représentent l'une des complications les plus graves suite à l'implantation de dispositifs médicaux. En particulier, les infections sur prothèse orthopédique sont particulièrement redoutées en clinique car elles sont associées à des échecs thérapeutiques et une morbi-mortalité importante. En effet, le biofilm qui recouvre ces prothèses est une matrice composée d’exopolysaccharides et de bactéries en dormance, présentant une sensibilité réduite aux antibiotiques et une faible accessibilité mécanique, ce qui donne lieu à des infections chroniques, extrêmement difficiles à combattre. Ainsi, l’inhibition de la formation de biofilm est un élément clé de la prévention des infections ostéoarticulaires sur matériel. Dans ce cadre, différents matériaux constituant les prothèses et présentant des caractéristiques antibactériennes sont actuellement à l’étude. Plusieurs polymères ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. Toutefois, des essais doivent maintenant être conduits chez l’animal pour en vérifier la tolérance locale (et par la suite l’activité antibactérienne, en fonction des résultats obtenus). L’objectif du présent projet vise donc à évaluer la tolérance locale d’implants en titane, recouverts de différents polymères antibactériens, chez la souris, après implantation sous-cutanée.

Bénéfices attendus

A long terme, le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir développer un matériel innovant, permettant de d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme (ex : dispositifs médicaux ou prothèses). Avant cela, il est nécessaire d’en vérifier l’innocuité. Aussi, à court terme, le bénéfice attendu est de pouvoir sélectionner un ou plusieurs polymères antibactériens n’ayant pas de toxicité chez la souris parmi plusieurs candidats.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Deux injections (durant 2 secondes chacune) avant le geste chirurgical - Incision cutanée et suture sous anesthésie fixe

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger implanté en sous-cutané, les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaire (retard de cicatrisation, nécrose ou infection au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire chez les animaux serait davantage due au polymère recouvrant le titane mais les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents polymères. Par ailleurs, des essais similaires ont déjà été réalisés (implant titane recouverts d’autres polymères) et aucun effet indésirable n’a été enregistré.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (27). Un prélèvement tissulaire sera réalisé post-mortem.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité des différents polymères de cette étude a déjà fait l’objet d’investigations menées in vitro sur des modèles cellulaires. Également, l’environnement complexe (tissu sous-cutané, cellules immunitaires …) est difficilement modélisable dans un autre système que le modèle animal. Aussi, l’utilisation du modèle animal est requise.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé pour établir la preuve de concept et discriminer rapidement un échantillon relevant de polymères. Les travaux précédents sur un modèle similaire avait requis l’utilisation de 5 animaux par groupe ; les résultats de l’analyse histopathologique ont montré une très bonne homogénéité et de ce fait, il a été décidé de n’utiliser que 3 animaux par groupe dans cette nouvelle étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Lors de la mise en place de l’implant, les souris recevront une analgésie de palier 2 et une anesthésie fixe. Après l’incision, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leur réveil. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie puis 2 fois par semaine jusqu’à la mise à mort. Nos expériences précédentes nous informent que les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Toutefois, une grille de score nous permet de suivre individuellement chaque animal et d’établir un point limite défini par un score égal ou supérieur à 8.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 22g (+/- 2g) et un système immunitaire mature. Également, dans un souci de comparaison avec les résultats antérieurs d’une autre étude, la souris sera choisie comme modèle dans cette étude.

Incluses dans les études dès le sevrage, à partir de quatre semaines, 2 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est immunodéficiente ou porte un système immunitaire et un foie humanisés, obtenus par greffe de cellules humaines. Elles reçoivent des injections de plasmides que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, subissent des prélèvements de sang répétés avec risque d'anémie et d'hématome, et pour certaines un prélèvement terminal sous anesthésie suivi de leur mise à mort. Sur la réduction, le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et que l'effectif découle du nombre d'études des années précédentes, ajusté selon "le plan commercial". Deux cent cinquante de ces souris pourront ensuite être transférées vers un projet de formation interne aux gestes techniques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser la pharmacocinétique de composés de recherche après administration à des souris. En particulier, nous nous intéresserons à leurs absorptions, biodistribution, métabolisme et élimination. Ces analyses sont cruciales pour déterminer les doses efficaces et la posologie d’un médicament. Pour ce faire, nous utiliserons des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir des données essentielles sur la biodistribution et la durée de vie de composés de recherche dans l’organisme. Grâce à ces données, nous pourrons définir les doses et posologies à tester dans des études d’efficacité.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement sans réveil suivi d’une euthanasie sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre à la main. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Les administrations de traitements dureront quelques secondes et seront effectuées avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Leur nombre dépendra du protocole ‘étude et sera validé par le vétérinaire. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

- Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmidess (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. - Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible d’étudier l’absorption, la biodistribution, le métabolisme et l’élimination de composés de recherche sans les injecter in vivo. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 2200 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 44 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant toute procédure potentiellement douloureuse. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang.