Autres tests de tolérance et d’efficacité

Pour comparer le passage de biothérapies administrées par les poumons, par le nez ou par la veine, 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 920 d'entre elles et modéré pour 280. Une partie reçoit cinq administrations d'allergène sous anesthésie pour déclencher une maladie respiratoire inflammatoire, puis trois administrations du candidat thérapeutique. Le porteur indique que l'introduction du dispositif dans la trachée est douloureuse et que l'allergène peut provoquer des difficultés respiratoires et une douleur à la respiration les jours suivants. Un score clinique bâti sur le poids, l'état général et le refus de se nourrir décide de la poursuite ou de l'arrêt de l'expérience, animal par animal.

Objectifs

Le projet a pour objectif de soutenir le développement de biothérapies innovantes pour une administration locale par voie inhalée (pulmonaire et nasale). La voie inhalée est depuis longtemps utilisée pour le traitement loco-régional des pathologies du tractus respiratoire car elle assure une exposition maximale et rapide du composé actif directement dans l’organe cible. L’administration intranasale offre également un accès direct vers le cerveau, aussi appelé transport « nez-vers-cerveau », et représente une voie d’administration non invasive pour le traitement des maladies du système nerveux central. A ce jour, l’inhalation est majoritairement utilisée pour l’administration de molécules de petites tailles et est très peu exploitée pour les biothérapies. Le projet repose sur l’utilisation par inhalation de candidats biothérapeutiques, en tirant partie de leurs avantages, notamment leur petite taille et leur stabilité. Plus spécifiquement, ce projet vise à évaluer la tolérabilité, la biodisponibilité et l’efficacité de candidats biothérapeutiques après administration intra-trachéale, intra-nasale ou intraveineuse (voie de référence pour les biothérapies) dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouvelles biothérapies par voie inhalée (pulmonaire et nasale) pour le traitement de pathologies respiratoires et neurologiques. Des connaissances liées à la distribution dans l’organisme de biothérapies administrées par inhalation (nasale ou pumonaire), nécessaires pour leur développement clinique, seront apportées par ce projet. L’ambition à long-terme de ce projet est d’accélérer la production de biothérapies, par voie inhalée, afin d’améliorer leur ciblage, leur biodisponibilité et leur efficacité. In fine, ceci permettra d’améliorer globalement la prise en charge des patients atteints de pathologies respiratoires et de pathologies neurologiques.

Procédures

Procédure « temps de rétention dans les matrices biologiques d’intérêt des candidats biothérapeutiques à visée pulmonaire ou cérébrale chez des souris en fonction de la voie d’administration » : 1.1_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°1 : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min 1.2_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°2 : vigile, en contention, 1 fois, 1min 1.3_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°3 : sous anesthésie générale, 1 fois, 30 sec Procédure « efficacité anti-inflammatoires des candidats biothérapeutiques dans un modèle induit de maladie respiratoire inflammatoire chez des souris » 2.1_Induction de la maladie respiratoire inflammatoire par administration d’un allergène : sous anesthésie générale, 5 fois, 30 sec 2.2_Adminitration des biothérapies selon la voie d'administration n°1 : sous anesthésie générale, 3 fois, 1min 2.3_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°2 : vigile, en contention, 3 fois, 1min

Impact sur les animaux

Pour la procédure « temps de rétention dans les matrices biologiques d’intérêt des candidats biothérapeutiques à visée pulmonaire ou cérébrale chez des souris en fonction de la voie d’administration » , il s’agit d’évaluer la biodisponibilité de plusieurs candidats biothérapeutiques en fonction de leurs voies d’administration, sans avoir recourt à un modèle pathologique. Pour la procédure « efficacité anti-inflammatoires des candidats biothérapeutiques dans un modèle induit de maladie respiratoire inflammatoire chez des souris », un modèle pathologique de maladie respiratoire inflammatoire sera utilisé chez la souris pour évaluer les efficacités antiinflammatoires de plusieurs candidats biothérapeutiques. Des données préliminaires in vitro obtenues précédemment vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les différents candidats. Les nuisances associées aux administrations (allergène pour induire le modèle pathologique, ou des solutions thérapeutiques) comprennent : le stress généré par l'anesthésie gazeuse et la douleur associée à l'introduction du dispositif pour inhalation dans la trachée ; ou le stress généré par l'anesthésie gazeuse et la douleur associée à l'administration d'un bolus par le nez ; ou le stress généré par l’introduction d’une aiguille pour une injection ; et le stress généré par la manipulation et la contention à plusieurs reprises. De plus, l’administration de l’allergène peut provoquer une difficulté respiratoire et une douleur associée à la respiration sur les jours qui suivent.

Devenir

L’objectif de ce projet de 5 ans est d’améliorer nos connaissances sur la distribution dans l’organisme de biothérapies après inhalation (pulmonaire ou nasale), ainsi que nos connaissances sur les effets anti-inflammatoires à visée pulmonaire de candidats biothérapeutiques. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à morts et des prélèvements (poumons, cerveau, lavages bronchoalvéolaires, lavages nasaux, sang, foie), seront réalisés afin de quantifier la rétention des biothérapies dans chacun de ces compartiments, et d’évaluer la réponse inflammatoire de l’organisme.

Remplacement

Ce projet in vivo est la suite d’études in vitro sur des modèles cellulaires pour évaluer le passage des candidats biothérapeutiques de la barrière épithélilale pulmonaire ou nasale, ainsi que d’études in vitro pour évaluer l’efficacité de ces biothérapies à visée anti-inflammatoires. Le recourt à l’expérimentation animale chez un modèle murin fait suite à ces précédents résultats, et est pertinent pour prendre en considération la distribution d’une molécule dans un organisme entier, ainsi que les réponses immunitaires. De plus, les modèles in vivo, et notamment les modèles murins permettent de reproduire des processus immunitaires plus proches de ceux retrouvés chez l’Homme – dans notre cas : remodelage de la paroi des voies respiratoires, hyperplasie des cellules épithéliales et calciformes, accumulation de collagène, de fibronectine et d’autres protéines de la matrice. Et l’utilisation d’un modèle animal de petite taille permet une meilleure accumulation des produits dans les régions cibles. Des méthodes in silico existent pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques. Cependant, les mécanismes multifactoriels intrinsèques aux biothérapies ne permettent pas encore d’avoir des modèles suffisament prédictifs. Ces approches in silico pourront gagner en importance grâce aux capacités croissantes de corrélation entre les propriétés des biothérapies et les données in vivo générées.

Réduction

Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, quantification des biothérapies dans les organes cibles …). Les modèles murins et les différentes modalités d’administration sont maitrisés par l’équipe et les porteurs de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point, et donc de réduire le nombre d’animaux. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Des études antérieures sur des modèles cellulaires ont permis de définir une concentration efficace en candidats biothérapeutiques à visée anti-inflammatoires, permettant ainsi de réduire le nombre de doses à tester sur les expériences in vivo. De plus, des cinétiques de transport des solutions biothérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires d’épithélium bronchique et nasal afin de réduire le nombre de temps d’analyse à effectuer sur les expériences de biodistribution. Des tests statistiques ont été utilisés afin de considérer une taille de groupe d’animaux optimisée en fonction des besoins du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables (5 souris/cage) permettant les interactions entre congénères de la même espèce. Plusieurs types d’enrichissements sont prévus dans leurs hébergements, notamment pour permettre une complexification de leurs milieux de vie, et pour stimuler leurs comportements naturels (jeux, caches...) : boîtes à œufs, sopalin, bâtonnet en coton ou en bois, tube carton, sizzle pad, nestlets, igloo en plexi ou en carton, et tube, dome, ou cabane en plexi. Une attention particulière des animaux par les expérimentateurs sera apportée pendant la période d’acclimatation des animaux, et au cours des expérimentations envisagées. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée de façon quotidienne par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limites. L’observation sera portée sur : (1) le poids de l’animal, (2) l’état général, (3) comportements physiologiques (refus de se nourrir ou de boire, aspect des poils…), (4) autres symptômes. Ces symptômes, incluant des éléments physiques, physiologiques et comportementaux permettront d'établir un score clinique permettant de déterminer objectivement la poursuite ou non de l'expérimentation sur l'animal.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux dans cette étude est indispensable pour étudier la biodisponibilité des candidats biothérapeutiques et leurs efficacités anti-inflammatoires, car cela dépend de l’organe considéré et de sa voie d’administration. Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il s’agit d’un modèle pertinent pour des études sur la biodistribution de molécules thérapeutiques. Le modèle murin a, de plus, été largement documenté sur l’induction de maladie respiratoire inflammatoire à l’aide d’administration répétée d’allergène. Nous utiliserons plus particulièrement dans ce projet des souris largement utilisées pour des recherches en immunologie. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec des gestes techniques et des procédures expérimentales.

Pour reproduire une dégénérescence de la cornée provoquée par la section des nerfs qui l'innervent, 600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nerfs ciliaires d'un œil sont sectionnés sous anesthésie générale, puis chaque animal reçoit des collyres jusqu'à six à huit fois par jour pendant une à quatre semaines, des injections intra- ou péri-oculaires parfois quotidiennes et un prélèvement sanguin hebdomadaire, avec examens à la lampe à fente, esthésiométrie et imagerie cornéenne. Une centaine d'animaux écartés avant l'induction pourront être réutilisés dans d'autres protocoles, tous les autres sont tués pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur annonce une kératite pouvant aller jusqu'à l'ulcération et une opacification de la cornée, et écrit dans le même paragraphe que ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de développer un modèle expérimental de kératopathie neurotrophique chez le rongeur afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la dégénérescence cornéenne liée à une altération de l’innervation sensitive. La kératopathie neurotrophique est une affection rare mais sévère de la cornée, résultant d’un dysfonctionnement du nerf trijumeau, et observée dans diverses pathologies humaines telles que l’herpès oculaire, le diabète, ou après des interventions neurochirurgicales. Les modèles développés permettent de reproduire de manière contrôlée une dénervation cornéenne, entraînant une perte de trophicité, une altération de la cicatrisation épithéliale, une inflammation chronique et une apoptose des cellules épithéliales. L’activation des cellules immunitaires locales et la perturbation de l’homéostasie des cellules de la cornée contribuent à la progression de la maladie. Ces modèles offrent une plateforme pertinente pour l’analyse des voies de signalisation impliquées dans la régénération nerveuse, la réponse inflammatoire et le stress oxydatif. Ils permettent également d’évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques neuroprotectrices, régénératives ou anti-inflammatoires, en amont d’études cliniques. En résumé, ces modèles constituent un outil essentiel pour mieux comprendre la physiopathologie de la kératopathie neurotrophique et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer l’intégrité cornéenne après une dénervation. La kératopathie neurotrophique (KN) constitue une pathologie sévère, souvent consécutive à des atteintes du nerf trijumeau, et pour laquelle les options thérapeutiques restent limitées. Il est donc essentiel de disposer de modèles fiables reproduisant les mécanismes physiopathologiques observés chez l’humain, afin de tester ces traitements dans des conditions rigoureuses et contrôlées, tout en respectant les principes du bien-être animal. Ces modèles permettront de simuler les altérations cornéennes caractéristiques de la KN, telles que la perte de sensibilité, la diminution de la sécrétion lacrymale et la dysfonction épithéliale. Ils offriront la possibilité d’évaluer avec précision l’effet des traitements sur la régénération nerveuse et la cicatrisation épithéliale. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à optimiser les schémas posologiques et à approfondir la compréhension des mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et conforme aux standards réglementaires.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions réparties sur une période de 1 à 4 semaines, selon les objectifs et les résultats obtenus avec les traitements testés, parmi lesquelles : 1. La procédure chirurgicale d’induction de la pathologie avec lésion mécanique unilatérale des nerfs ciliaires. Durée estimée à 10 minutes sous anesthésie générale avec prémédication d’une analgésie administrée en sous-cutanée. 2. Les examens ophtalmologiques : . Comme l’observation à la lampe à fente, le prélèvement des larmes par capillarité et l’esthésiométrie réalisés en baseline, au premier, troisième, cinquième, septième et quatorzième jour après l’induction. La durée de ces examens ne dépasse pas cinq minutes par animal : . Comme la tomographie en cohérence optique (OCT) ou microscopie confocale in vivo seront réalisées avant l’induction et une fois par semaine. Ces deux examens se font après une anesthésie légère afin d’immobiliser l’animal et permettre l’obtention de résultats interprétables. 3. Les administrations de traitements comme : . Les instillations topiques (collyres) durent d’une à deux minutes par application sur animal vigile à une fréquence de trois fois/jour en moyenne (max. six à huit fois/jour) sur la durée totale de l’étude à savoir 1 à 4 semaines ; . Les injections intra- ou péri-oculaires sous anesthésie locale et générale qui ne durent que quelques minutes et peuvent être quotidiennes, comme les injections systémiques sur animal vigile et réparties sur l’ensemble de l’étude à savoir 1 à 4 semaines. 4. Les prélèvements sanguins généralement réalisés une fois par semaine sur animal vigile sont définis en fonction du volume de prélèvement et du temps de récupération de l’animal. Ce prélèvement veineux est rapide puisqu’il ne dure qu’une à deux minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. Les données issues de la littérature et des expériences antérieures indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : une hyperémie conjonctivale liée à une inflammation locale modérée, notamment après les procédures d’induction ou d’administration; un saignement léger et transitoire au site d’incision ou d’injection; des troubles cornéens, tels qu’une opacification, une kératite superficielle à profonde avec ulcération. Une perte de sensibilité cornéenne induite par la dénervation est également attendue et constitue un élément central du modèle. Elle peut aussi s’accompagner d’une diminution de la sécrétion lacrymale et d’une altération de la cicatrisation épithéliale. Toutes ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal, conformément aux observations des modèles de référence et qu’une prémédication analgésique pourra être administrée pour limiter d'éventuelle douleur. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, afin de permettre la réalisation des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats scientifiques (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie neurotrophique, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne, ni les réponses neurodégénératives complexes impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour : 1. Reproduire fidèlement les conditions pathologiques de la kératopathie neurotrophique, 2. Évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant, 3. Étudier les effets à long terme sur la cornée et les structures nerveuses associées dans un environnement physiologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats et déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche active de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (OCT, microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs et à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Raffinement

Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera assuré tout au long des études afin de détecter rapidement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Cette surveillance permettra une intervention rapide et adaptée, conformément à des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et spécifiques à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à réduire toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge éthique et réactive des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies, avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum). L’environnement sera optimisé par des abris, des matériaux à ronger et des structures d’exploration favorisant le bien-être psychologique et comportemental. Une attention particulière sera portée à la qualité des conditions d’hébergement, à la réduction du stress et à la stimulation des comportements naturels. Dans le cadre du projet, une anesthésie générale sera indispensable lors des chirurgies d’induction afin d’assurer l’immobilité de l’animal. Elle pourra être complétée par une anesthésie locale si nécessaire. Une prémédication analgésique sera administrée pour limiter la douleur, et une antibioprophylaxie locale pourra être appliquée au niveau de l’œil ou de l’incision en cas de risque infectieux. Les examens destinés à évaluer la kératopathie neurotrophique seront principalement non invasifs et similaires à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire, tels que l’imagerie cornéenne, la mesure de la sensibilité cornéenne et l’évaluation de la cicatrisation épithéliale. Ces techniques permettront des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, réduisant le nombre d’animaux nécessaires et évitant leur euthanasie à chaque point d’analyse. Lorsque l’immobilité est requise, une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. Ce projet a été validé par un comité d’éthique sera suivi par la structure en charge du bien-être animal.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes telles que la kératopathie neurotrophique. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. L’expérience accumulée avec ces modèles garantit la reproductibilité des résultats, la comparabilité avec d’autres études précliniques, et la pertinence des données obtenues pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le choix de ces espèces s’inscrit dans une démarche scientifique rigoureuse, éthique et translatoire, visant à maximiser la qualité des résultats tout en respectant les principes de l’expérimentation animale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

Pour répondre à une question posée par l'Agence européenne du médicament au client d'un prestataire, 22 rats reçoivent des vésicules extracellulaires couplées à de l'iode 125, afin d'en suivre la persistance et la distribution dans les tissus. Deux d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les vingt autres un niveau modéré, et tous sont tués à l'issue. Ils subissent jusqu'à quatre administrations sous anesthésie, deux prélèvements de sang sur animal éveillé, des pesées quotidiennes pendant quatorze jours, puis un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque. Deux animaux sont réservés à une étude pilote destinée à former les opérateurs au mode d'administration, et le porteur affirme qu'il n'est pas possible de descendre sous quatre animaux par groupe, sans produire de calcul.

Objectifs

Plus de 1,9 millions de personnes à travers le monde sont atteints de la maladie de Crohn. Une des manifestations fortement handicapante et fréquente de cette pathologie (un tiers des patients après 20 ans d’évolution) est l’apparition de fistules périanales, fissure pénétrant dans la paroi intestinale avec une forte inflammation environnante. La prise en charge est multidisciplinaire (médicale et chirurgicale) avec des taux de récidive allant jusqu’à 40% à 5 ans. Notre client a pour objectif de proposer une alternative thérapeutique à base de particules naturellement libérées par les cellules appelées vésicules extracellulaires (VEs) qui ont été obtenus à partir de cellules souches issues du tissu adipeux. Ce traitement sera proposé quand les fistules des patients ont montré une réponse inadéquate à une thérapie conventionnelle. Ces VEs seront administrés de manière concomitante par voie sous cutanée le long de la paroi de la fistule et au niveau de son orifice, et en locale à l’intérieure de la fistule. Pour l’administration locale, les VEs seront mélangées à un polymère (Poloxamère 407), une grosse molécule formant un gel à la température du corps et permettant ainsi de retenir les EVs dans le site de la lésion dans des zones peu accessibles et de prolonger la libération du médicament. L’efficacité du traitement de VEs combinées à ce polymère a déjà été montrée dans plusieurs modèles préclinique de fistules digestives et intestinales chez le rat et le cochon. Ces VEs diluées dans une solution saline (pour l’injection sous cutanée) ou mélangées au Poloxamère 407 (pour l’administration locale) n’ont pas montré d’effets délétères. Notre projet vise aujourd’hui à répondre à une des questions posées par l’Agence Européenne du Médicament en vue de compléter le dossier réglementaire d’une future demande d’autorisation d’essais cliniques, à savoir quantifier la persistance des VEs après une administration unique et d’évaluer son élimination de la circulation sanguine ainsi que sa distribution dans les tissus. Les VEs étant difficilement traçables dans l’organisme, elles seront couplées à un élément radioactif (iode-125) afin de pouvoir les suivre et ainsi de répondre à ces questions.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à répondre aux questions scientifiques posées par l’Agence Européenne du Médicament notamment sur la persistance du produit de notre client au site d’intérêt, sur son élimination de la circulation sanguine et sa distribution dans les tissus ; et en cas de réponse positive de poursuivre le développement de ce médicament vers des études de toxicologie réglementaire. Le succès du développement de médicament permettrait une nouvelle solution thérapeutique pour les malades de la maladie de Crohn souffrant de fistules périanales récidivantes.

Procédures

Pesée (une fois par jour, maximum 14 jours, 20 secondes) ; administration de composé analgésique (maximum 1 fois, 15 secondes) ; prélèvement de sang (2 fois maximum, 3 minutes). Sur animal anesthésié : Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutiques (maximum 4 fois, 10 minutes)s

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie gazeuse ; stress et douleur légère liés aux administrations sous cutanées vigiles; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ; stress et douleur légère liés aux prélèvements de sang vigiles

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organes, atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal, fin de l’étude.

Remplacement

Evaluer la pharmacocinétique, la biodistribution tissulaire nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe et est impossible à faire in vitro. De plus, dans le cadre du développement du médicament de notre client, l’Agence du Médicament Européen a demandé que ces études soient complétées chez l’animal. L’animal est donc incontournable dans le cadre de cette étude.

Réduction

Les 5 groupes utilisés sont composés uniquement de 4 animaux (2 mâles et 2 femelles), la méthode de quantification par mesure radioactive étant très précise et répétable. Il n’est néanmoins pas possible de descendre sous ce seuil. De plus, une étude pilote portant sur 2 animaux sera réalisée afin de se former sur le mode d'administration et de ne pas augmenter le nombre d'animaux par groupe pour l'étude principale.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles seront mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 par cage dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériels utilisés, d’anesthésie et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le développement préclinique du traitement de notre client a été effectué dans cette espèce et cette espèce a été demandée par l’Agence Européenne du Médicament pour les études complémentaires. Les rats seront utilisés à un âge de 6-7 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est considéré comme mature..