Production de routine

40 jeunes moutons mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes avec adjuvant, une dizaine de rappels au cours de leur vie productive, pour produire un sérum servant à fabriquer des réactifs de diagnostic vendus. Le porteur indique que l'adjuvant peut provoquer des inflammations locales, et précise que les animaux sont euthanasiés à la fin "afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire". Il justifie le choix de l'espèce par l'absence de modèle in vitro performant et par les volumes de sérum obtenus.

Objectifs

Les anticorps polyclonaux de mouton anti-immunoglobuline de lapin et de souris sont utilisés dans la production de différents réactifs de diagnostic in vitro pour le test : - de maladies métaboliques liées aux hormones stéroïdiennes (estradiol et cortisol) ; - mesure de la concentration des hormones thyroïdiennes T4 et T3. Le dosage de ces hormones est réalisé dans le cadre d’un bilan de la fonction thyroidienne. L’anticorps de mouton est utilisé pour assurer la sensibilité et spécificité des tests en assurant la capture des anticorps spécifiques de lapin ou de souris dirigés contre chacune des molécules à doser (estradiol, cortisol, T3, T4).

Bénéfices attendus

En l'absence de modèle in-vitro performant, c'est l’espèce ovine qui a été choisie. Les résultats de développement des tests de diagnostic concernés ont montré l’efficacité de l’immunisation chez cette espèce. La qualité des anticorps ainsi obtenus s’est révélée satisfaisante (sensibilité et spécificité) permettant de garantir la fiabilité du résultat rendu par les tests : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Cette espèce donne la possibilité d’effectuer des prélèvements de sang à différentes reprises, ce qui permet de produire des quantités importantes de sérum hyper-immun et ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués dans le projet pour couvrir les besoins pour les 5 prochaines années de production.

Procédures

Pour un animal lors de la primo injection (1seule fois dans la vie de l’animal) : 4 injections par voie intra-dermique à 28 jours d’intervalle (3 minutes pour la totalité d’une injection). Et lors d’un rappel (une dizaine de fois dans sa vie productive) : 1 seule injection par voie intra-dermique (3 minutes pour la totalité de l’injection).

Impact sur les animaux

Par expérience, ces protocoles ne sont pas susceptibles d'occasionner douleur, souffrance ou angoisse. Les antigènes sont administrés avec adjuvant qui peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Toutefois, la surveillance particulière et quotidienne de ces animaux en protocole assure, en cas de signes cliniques, le déclenchement de soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. L'observation quotidienne de la troupe permet de détecter les premiers signes d’alerte : apathie, arrêt de l’alimentation, dégradation de l’état général.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

Indisponibilité de modèle in vitro performant pour la production d’anticorps contre les antigènes considérés ayant les caractéristiques nécessaires (spécificité, avidité, sensibilité) pour un dosage ELISA automatisé. Les anticorps polyclonaux obtenus sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. Le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités.

Raffinement

Les moutons, animaux grégaires, sont stabulés en petits groupes dans des conditions conformes à la réglementation et adaptées à l'espèce. Les animaux ont accès à la nourriture via une distribution de concentrés, au foin et à l’eau à volonté. Ils sont soignés quotidiennement, avec une surveillance intensifiée assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques de souffrance déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est une espèce documentée et classiquement utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux. Bien que présentant une grande hétérogénéité, les anticorps polyclonaux sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités. Les animaux utilisés sont des jeunes mâles adultes afin de permettre le prélèvement de volumes sanguins (donc de sérums hyper-immuns) suffisamment importants pour la réalisation des diagnostics visés par l’étude.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

87 500 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Immunisés deux fois, ils subissent des prélèvements sanguins à l'oreille sur animal vigile pouvant provoquer une anémie de plusieurs jours, puis un prélèvement intracardiaque terminal sous anesthésie profonde, pour produire du sérum anti-thymocytaire, principe actif d'un médicament antirejet de greffe. Il s'agit d'une production de routine, pas de recherche. Le porteur revendique l'absence de "méthode alternative validée" et écarte les anticorps monoclonaux, dont les tentatives de substitution auraient échoué, en invoquant aussi la lourdeur des procédures réglementaires de modification des autorisations de mise sur le marché.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire la substance active (sérum anti-thymocytaire de lapin) utilisée comme matière première pour la fabrication d’un médicament à usage humain, destiné d’une part à prévenir ou traiter le rejet de greffes d’organes et d’autre part à traiter l’aplasie médullaire (maladie hématologique). Il n’y a pas de méthode alternative validée et disponible pouvant permettre de répondre à ce besoin. La croissance continue du nombre de patients greffés et/ou en attente de greffe à l’échelle mondiale se traduit par un besoin croissant de sérum anti-thymocytaire de lapin pour pouvoir fabriquer la quantité nécessaire de médicament. Il s’agit d’un médicament fabriqué exclusivement en Europe et distribué dans environ 70 pays.

Bénéfices attendus

Le projet étant destiné à produire la substance active utilisée pour la fabrication d’un médicament à usage humain, les bénéfices attendus concernent directement la santé humaine et découlent de l’utilisation dudit médicament. Ces bénéfices sont : 1/ Prévention et traitement du rejet de greffe chez le patient. 2/ Prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique, en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques (cellules qui renouvellent en permanence les cellules qui sont dans le sang). 3/ Traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë contre lesquelles les corticoïdes sont inefficaces. 4/ Traitement de l'aplasie médullaire (maladie du sang). 5/ Amélioration de la qualité de vie des patients (résultant des bénéfices 1, 2, 3 et 4). 6/Réponse à un problème de santé publique considérant d’une part le nombre de patients concernés (environ 70 000 patients traités par an) et d’autre part le nombre de pays (environ 70 pays) dans lesquels ce médicament est demandé.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont : 1/ Port et contention des animaux lors des interventions : au moins 6 fois pour tous les animaux inclus dans le projet. Durée inférieure à 5 minutes. 2/ Pesée des animaux : 1 fois pour tous les animaux. Durée inférieure à 1 minute. 3/ Immunisations : 2 injections espacées de 14 jours. Durée d’environ 30 secondes. 4/ Prélèvements sanguins aux oreilles, sur animal vigile. Durée inférieure à 5 minutes. 5/ Prélèvement sanguin en intracardiaque : sous anesthésie générale profonde, jusqu’à la mort de l’animal sans reprise de conscience. Durée d’environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont rattachés aux procédures et interventions prévues par le projet sur les animaux : 1/ Stress et inconfort potentiellement induits par le port et la contention des animaux pendant les interventions : durée inférieure à 5 minutes. 2/ Stress et inconfort potentiellement induits lors de la pesée des animaux : durée inférieure à 1 minute. 3/ Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors des immunisations : durée d’environ 30 secondes. 4./Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors des prélèvements sanguins : durée inférieure à 5 minutes. 5/ Accélération transitoire de la respiration possible suite aux prélèvement sanguins : durée inférieure à 30mn. 6/ Déshydratation possible suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 7/ Fatigue, affaiblissement potentiels suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 8/ Mobilité réduite potentiellement suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 9/ Anémie modérée suite aux prélèvements sanguins : environ 7 jours.

Devenir

Imposé par la finalité du protocole : le protocole se termine par la mort du lapin suite au prélèvement sanguin terminal en intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans reprise de conscience.

Remplacement

le remplacement n’est pas envisageable car il n’y a pas de méthode alternative validée et disponible pour produire des anticorps polyclonaux. Les anticorps polyclonaux (sérum animal) obtenus par immunisation d’animaux sont des produits thérapeutiques anciens, utilisés depuis plus d’un siècle. En 1975, l’invention de la technologie de production des anticorps monoclonaux obtenus avec peu ou pas d’animaux a fait naître l’espoir de remplacer les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux. Ces anticorps ont d’abord trouvé de nombreuses applications au niveau de la recherche fondamentale et du diagnostic in vitro. Dans les laboratoires de Biologie clinique, les anticorps monoclonaux sont de plus en plus utilisés comme réactifs, souvent en remplacement de sérums polyclonaux traditionnels. Il a fallu cependant des décennies de développement et d’innovation pour rendre les anticorps monoclonaux utilisables en thérapeutique humaine. Fort de ces avancées, plusieurs publications scientifiques proposent de remplacer les anticorps polyclonaux (sérum d’origine animal) par des assemblages d’anticorps monoclonaux appelés anticorps multiclonaux ou cocktail d’anticorps monoclonaux, comme une alternative au recours à l’animal. Malheureusement, les tentatives de remplacer les anticorps polyclonaux à but thérapeutique par des cocktails d’anticorps monoclonaux se sont avérées infructueuses à ce jour. En général, l’extrême diversité naturelle des récepteurs sur les anticorps polyclonaux est un des obstacles au remplacement efficace des polyclonaux thérapeutiques par des cocktails de monoclonaux. De plus, l’antigène utilisé dans ce projet pour induire la production des anticorps polyclonaux par le lapin est une cellule (thymocyte), donc complexe par sa nature, cela rend encore plus improbable le remplacement du sérum antithymocytaire de lapin par cocktail d’anticorps monoclonaux. Enfin, si l’alternative par un cocktail de monoclonaux devenait accessible, l’obligation réglementaire pour le donneur d’ordre de démontrer leur équivalence thérapeutique (efficacité, innocuité) avec le médicament à base de sérum animal puis d’engager des procédures très longues et compliquées pour obtenir la modification de chacune des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) délivrées par plusieurs dizaines de pays serait l’ultime étape à franchir avant que ce remplacement ne puisse être effectif.

Réduction

Réduction : 1/ Le ciblage de la fenêtre optimale du pic d'anticorps dans le sang permet d’obtenir une quantité maximale de sérum polyclonal en utilisant moins de lapins. 2/ La réalisation de 3 prélèvements sanguins tout en préservant le bien être des lapins, permet de récupérer presque 2 fois plus de sérum par lapin que s’il n’y avait eu qu’un seul prélèvement sanguin par lapin. 3/ En utilisant indifféremment des lapins mâles ou femelles, on évite de faire naître plus de lapins qu’il ne faut pour le projet. 4./ Un très faible pourcentage de sérums anti-thymocytaire rejetés (inférieur à 1%) par le donneur d’ordre. Cela découle d’une parfaite maîtrise de la qualité du sérum produit depuis 40 ans par notre établissement et donc une utilisation optimale de chaque lapin inclus dans le projet. En combinant d’une part le ciblage de la fenêtre optimale pour les prélèvements sanguins et d’autre part le nombre de prélèvements sanguins, le protocole déposé dans le dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) du médicament permet d’optimiser la quantité de principe actif produite par lapin tout en préservant leur bien-être.

Raffinement

Raffinement : 1/Minimisation de la durée des contentions des animaux grâce à la compétence des techniciens et à une organisation optimale des interventions. 2/Définition et application de points limites spécifiques au protocole. 3/Surveillance accrue des lapins à des moments sensibles du projet. 4/Application d’une grille décisionnelle (grille de scores) pour atténuer ou abréger la douleur. 5/Recours à l’anesthésie générale profonde avant le prélèvement de sang en intracardiaque jusqu’à la mort du lapin sans reprise de conscience. 6/ Hébergement dans des zones protégées confinées conçues pour les protéger contre les infections. 7/ Lapins rassurés par le personnel qui leur parlent continuellement et les manipule de façon apaisante. 8/ Hébergement en groupe harmonieux et l’accès à un enrichissement varié pour que les lapins puissent exprimer un large répertoire de comportements normaux, notamment d’interactions sociales entre congénères. 9/ Absence de stress de transport ni de stress de changement d’environnement (personnel, mode opératoire, aliment…) car les lapins utilisés pour le projet sont nés sur place et maintenus dans les mêmes conditions, qu’ils soient en élevage ou en expérimentation. 10/ Utilisation de lapins répondant à des critères qui les rendent optimums pour le projet. 11/ 11. Application de techniques d’injection entrainant le moins de douleur possible. 12/ Exclusion de toutes substances douloureuses telles que les adjuvants. 13/ Aliment et eau de boisson à volonté. 14/ Formation intensive du personnel, compétent et sensibilisé à appliquer des points limites adéquats.

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce utilisée parce qu’il est imposé par le dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) du médicament pour lequel notre projet produit le principe actif. Il est utilisé à l’âge adulte quand son système immunitaire est mature pour produire efficacement des anticorps polyclonaux. De nombreuses autres espèces animales dont principalement la souris, le rat, le hamster, le cobaye, le mouton, la chèvre, le lapin et poulet peuvent être utilisées pour la production d’anticorps polyclonaux à visée thérapeutique. Parmi ces espèces, le lapin est celle qui présente le plus d’avantages, notamment pour : sa facilité d’élevage en zone confinée pour le protéger des infections, sa forte prolificité, sa croissance rapide, son cycle de vie court, sa taille « intermédiaire », sa docilité et sa facilité à manipuler, la facilité de lui prélever du sang… Le choix du lapin pour ce projet repose sur ces avantages.

70 chevaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre eux replacés en fin de projet et les autres tués. Ils sont immunisés à répétition avec un adjuvant qui peut provoquer des inflammations locales, puis soumis à des plasmaphérèses avec réinjection des globules rouges, pour produire du plasma servant de base à des anticorps polyclonaux. Le porteur, une société de biodéfense, indique viser 95 000 à 150 000 traitements contre des menaces NRBC et des maladies infectieuses. Il affirme que le cheval est l'animal producteur de référence et qu'aucune méthode alternative n'est connue pour ces anticorps.

Objectifs

Le nombre croissant de maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, la mondialisation et la propagation rapide des épidémies, l'absence de traitements et/ou de vaccination satisfaisants, le développement des menaces liées au bioterrorisme et l'augmentation de la résistance aux antimicrobiens ont conduit à une augmentation significative des risques de menaces biologiques. Le développement, l'accès et le déploiement rapides de contre-mesures médicales adéquates sont essentiels pour anticiper de telles urgences de santé publique, et constituent des enjeux nationaux et internationaux critiques comme a pu le confirmer l’émergence récente du virus Sars-Cov-2 et la pandémie mondiale de Covid-19 qui en a résulté. La société est spécialisée dans les traitements contre les maladies infectieuses émergentes et sévères, et les intoxications. Elle développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). En effet elle a notamment développé un produit contre la grippe aviaire H5N1 et un produit anti-Ebola sous l’égide de l’OMS et avec le soutien de l’Agence Européenne du Médicament (EMA). Elle capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme robuste et reproductible s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies, témoignant d'un excellent profil de sécurité. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps dans un laboratoire pilote en grade R&D. Et ces derniers sont évalués dans des études précliniques in vitro et in vivo. Après la démonstration d’efficacité, des lots sont purifiés dans des conditions BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication) pour les besoins des études précliniques réglementaires et cliniques. L’objectif de ce projet est d’immuniser des chevaux dans le but de produire des plasmas servant de base à la purification d’anticorps polyclonaux dirigés contre des cibles virales et / ou toxiniques (y compris toxines bactériennes).

Bénéfices attendus

Des fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique à des problématiques majeures de santé publique. En effet, la société développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menace NRBC. L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). Ce projet nécessitera l’utilisation de 70 chevaux sur 5 ans. Ces chevaux permettront de : 1- Production de plasma servant de base à l'obtention de 95000 à 150000 traitements ciblant les risques bio défense et les maladies infectieuses. 2- Production de plasmas servant de base au développement de nouvelles thérapies (Développement pré-clinique et clinique avec essais chez l'Homme.)

Procédures

Deux procédures différentes sont prévues dans ce projet. Dans les deux procédures les animaux seront soumis à deux types d’interventions : → Des immunisations par voie sintra-dermique, sous-cutané ou intra-musculaire. → Des prélèvements de sang. Il s’agit là de prélèvement de sang, avec séparation des globules rouges (plasmaphérèse), puis réinjection des globules rouges selon le résultat de l'analyse sanguine.

Impact sur les animaux

Deux éléments peuvent induire des nuisances : - L’adjuvant : Les antigènes seront administrés avec ou sans adjuvant. Cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Si un animal nécessite un traitement par voie parentérale, et que ce traitement n’améliore pas son état général après la fin du délai d’attente, les immunisations pourront être suspendues sur cet animal après décision concertée entre les responsables du projet et le vétérinaire. - Baisse de l’hématocrite : Par ailleurs, les prélèvements de sang, peuvent entrainer une baisse de l’hématocrite des animaux. Ainsi, un test d’hématocrite est réalisé après chaque prélèvement et des réinjections de globules rouges (issus de l’animal), et d’agents d’hématopoïèses sont réalisées lorsque l’hématocrite est trop faible.

Devenir

Les animaux ayant terminée une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure Ainsi, en fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être replacés après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques a déjà démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production de ces anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo. Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Le nombre de chevaux nécessaire pour un projet augmente au cours du temps. Néanmoins, le nombre de chevaux entrant dans le projet est calculé au plus juste selon l’avancée du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. - Pour les nouvelles indications/nouveaux antigènes : 2 à 4 animaux seront immunisés afin de tester et déterminer l’efficacité de l’immunisation. - Après la démonstration de l’efficacité de l’immunisation, dans le cadre du développement du produit et selon les études précliniques et cliniques programmées, le volume de plasma nécessaire sera calculé précisément. Ce volume permettra de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble du développement du produit. Les résultats obtenus permettront de déterminer de manière fiable le nombre maximal de chevaux nécessaires pour la production des traitements à base d’anticorps. A minima, une revue annuelle sera faite pour optimiser le nombre de chevaux au plus juste des besoins.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés sur une aire paillée en groupes sociaux de maximum 12 chevaux, fixes dans le temps. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Par ailleurs, le projet met en œuvre des procédures maîtrisées et qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines. Par ailleurs, depuis 2017 ces procédures sont mises en œuvre dans le cadre de l’autorisation précédente, et ont permis de mettre en place et préciser les procédures pour entrainer les animaux, réduire les douleurs et définir les points limites.

Choix des espèces

Le cheval est un animal corpulent permettant de récolter une importante quantité de plasma. Il présente peu de zoonoses, ce qui limite les risques de présence de contaminants nocifs pour l'Homme dans les plasmas. Les chevaux sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’immunoglobulines est optimale.

200 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans l'abdomen une suspension de toxoplasmes et de cellules de sarcome, puis est tuée par dislocation cervicale 65 à 75 heures plus tard pour récolter le liquide d'ascite riche en parasites, matière première de kits de dépistage de la toxoplasmose. Le porteur reconnaît que des signes de douleur apparaissent au-delà de 60 heures et prévoit une injection d'anti-inflammatoire la veille de la récolte. Il affirme qu'aucun mode de production sur une source non animale n'a pu être validé à ce jour.

Objectifs

La production de suspension de toxoplasmes est utilisée dans la production de kits d’immunoessais associés au diagnostic de la toxoplasmose chez l’Homme. Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire dont les hôtes définitifs sont les félidés. Le parasite est toutefois capable d’infecter de nombreuses espèces animales, dont l’Homme, en tant qu’hôtes intermédiaires. La toxoplasmose est une affection alors transmissible de la mère au fœtus et qui peut entrainer des séquelles très invalidantes pour l’enfant. Il est donc primordial de savoir si la mère est protégée en début de grossesse ou sinon d'effectuer un suivi sérologique mensuel au cours de la grossesse. Ainsi, le diagnostic de la toxoplasmose est obligatoire en France dans le cadre du suivi prénatal. Les 4 réactifs de diagnostic concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, dans le sérum des patients, les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite.

Bénéfices attendus

Les kits de diagnostics concernés par le projet sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur ascite de souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes.

Procédures

- inoculation en intrapéritonéale d’une suspension contenant des toxoplasmes et des cellules sarcomes TG180 - 48 heures après inoculation initiale : injection sous cutanée d’analgésique de type ketoprofene. - 65 à 75 heures après inoculation initiale : mise à mort par dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Les souris sont inoculées avec une suspension contenant des toxoplasmes et des cellules sarcomes. Cela provoque la colonisation des cellules sarcomes par les toxoplasmes. Ce dernier étant un parasite intracellulaire strict, il n'est pas agressif pour la souris tant qu'il est dans la cellule et n'a pas de conséquence sur son état sanitaire. Au-delà de 60 heures d’incubation, des signes de douleurs peuvent apparaitre. Après un temps d’incubation compris entre 65 et 75 heures, l’animal est mis à mort et l’ascite des souris est récoltée. Pour diminuer l’impact douloureux du protocole sur l’animal, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation et 24 heures avant la récolte d’ascite, d’induire une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type ketoprofene.

Devenir

La nature du parasite inoculé ne peut conduire à une autre issue que l’euthanasie de l’animal à la fin du protocole. Ce protocole, avec une durée d’incubation optimisée, est celui qui réduit au maximum l’impact pour l’animal, tout en garantissant l’objectif du projet.

Remplacement

Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur ascite de souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Ce protocole est le seul mode de production aujourd’hui validé pour garantir les performances requises des kits de diagnostic concernés. Aucun mode de production de ces toxoplasmes sur une source non animale n’a pas pu être validé à ce jour.

Réduction

Après un temps d’incubation compris entre 65 et 75 heures, l’ascite des souris est récoltée en un prélèvement unique sur l’animal euthanasié. Un rinçage de la cavité péritonéale avec 5mL de sérum physiologique est effectué, dans le but de récupérer le maximum de toxoplasmes afin de diminuer le nombre de souris utilisées. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet d’amplifier la production de toxoplasmes et donc de réduire le nombre d’animaux (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Cette méthode optimisée entraine la production d’un volume moyen de 1mL d’ascite très concentré en toxoplasmes par souris de 30g. Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. La quantité produite par animal est constante et le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. 200 000 souris sont nécessaires sur les 5 années de durée du projet. Ce nombre de souris permettra de produire et de mettre à disposition 20 millions de tests de diagnostic à travers le monde, au service de la santé publique.

Raffinement

Les animaux entrent en production après une période d'acclimatation de 14 jours, de manière à ce qu'ils s'habituent aux conditions d'élevage, limitant ainsi le stress lors des différentes manipulations. Ils sont hébergés sur litière (sciure/lanières de carton) assurant l'enrichissement du milieu et permettant aux souris de faire leur nid. Un tunnel PVC est introduit dans la cage permettant aux souris de répondre à un besoin physiologique de bien-être animal. Un suivi quotidien par cage permet de contrôler l’état sanitaire des souris. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet de limiter la colonisation des cellules de la souris de la 1ère heure à la 60ème heures et donc de diminuer la douleur (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Au-delà de la 60ème heure le toxoplasme libéré dans le péritoine colonise alors les cellules de la souris et devient agressif et des signes de douleurs apparaissent. Pour diminuer l’impact douloureux du protocole sur l’animal, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation et 24h avant la récolte d’ascite, une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type ketoprofene.

Choix des espèces

La culture de toxoplasmes a été validée sur souris pour assurer la performance des tests de diagnostic in vitro. Les animaux utilisés ont un poids moyen de 30 g. Après une période d'acclimatation de 14 jours les animaux entrent en production.