Production de routine
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.
Production de sérum hyper immun à des fins d’analyse chez la volaille
- Production de routine
- Tests réglementaires
150 oiseaux de volaille vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une souche infectieuse puis subissent plusieurs prélèvements sanguins avant un prélèvement total et terminal, afin de produire du sérum servant aux contrôles qualité de lots de vaccins. Le porteur indique que certains animaux développent prostration, décubitus, déshydratation sévère, voire une mortalité subite. Il présente cette production comme sans alternative in vitro, tout en la reliant à des tests qui limiteraient par ailleurs le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de produire des réactifs nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider des tests in vitro, tout en satisfaisant aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM). Ces tests permettent de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la mise sur le marché d’un lot de vaccins. Ils sont effectués sur espèce cible. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la réalisation des contrôles in vitro réalisés dans les laboratoires. Ceci permet la mise sur le marché de vaccins qui protègent efficacement les animaux contre les maladies infectieuses, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal en favorisant les méthodes alternatives.
Procédures
Administration de la souche à tous les animaux en vigile. 1 à 2 fois selon le protocole. Acte très rapide inférieur à 30 secondes. Prélèvements sanguins 2 à 5 fois pendant la durée du protocole. Sur tous les animaux en vigile. Acte très rapide inférieur à 1 minute. Prélèvement sanguin total et terminal sur tous les animaux à la fin du protocole sous anesthésie e. Euthanasie de tous les animaux.
Impact sur les animaux
Stress liés aux manipulations et aux injections. Certains animaux développent la maladie : prostration, décubitus, déshydratation sévère, dans certains cas mortalité subite. Des points limites spécifiques sont déterminés et appliqués dans ce cas.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issu du protocole dans le but de récolter du sérum.
Remplacement
La production de sérums hyper immuns n’est possible qu’in vivo, il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour produire ces sérums.
Réduction
Le nombre d’animaux est directement lié à la quantité de réactifs nécessaires à la réalisation de tests in vitro qui ont été développés afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération d’un lot vaccins. Les process de prélèvement ont été optimisés pour garantir de récolter le maximum de sang est ainsi limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux.
Raffinement
Des points limites spécifiques à la pathologie sont déterminés et appliqués. Lorsque la pathologie le nécessite, 2 ou 3 observations cliniques quotidiennes permettent d’identifier les cas pour lesquels l’animal doit avoir une prise en charge spécifique ou le déclenchement d’une euthanasie précoce. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Les réactifs produits sont spécifiques et liés à l’espèce. Animaux âgés d’un jour à six semaines
Production de réactifs et de tissus dans le cadre de la production et du contrôle qualité des vaccins commercialisés ou en développement
- Production de routine
- Tests réglementaires
Cochons d'Inde : 1000
Lapins : 250
Furets : 80
1 000 cobayes, 700 souris, 250 lapins et 80 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de sans réveil à sévère. Ils reçoivent des injections d'antigènes, parfois avec un adjuvant pouvant provoquer des réactions locales sévères, ou une inoculation du virus de la grippe pour les furets, avant un prélèvement de sang par ponction cardiaque terminale sous anesthésie. Le sang et les anticorps ainsi produits servent au contrôle qualité de vaccins commercialisés. Le porteur affirme que ces réactifs d'origine animale sont "obligatoires" et sans alternative in vitro disponible.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’assurer la fourniture des produits biologiques d’origine animale, nécessaires à la réalisation des tests de contrôle qualité assurant la mise sur le marché de lots de vaccins. 2 sous-objectifs : • La production de réactifs d’origine animale : Procédure 1 : prélèvement de sang de cobaye pour utilisation des globules rouges. • La production d’anticorps contre différents antigènes : Procédures 2 à 8 : productions d’antisérum sur lapins, souris ou furets (réactifs pour test Elisa ou séroneutralisation d’un antigène d’intérêt).
Bénéfices attendus
L’entreprise compte sur ces réactifs pour la mise à disposition de nombreux vaccins à l’échelle mondiale.
Procédures
Les durées représentent le temps pendant lequel les animaux sont anesthésiés. Quant aux injections et inoculations, le geste lui-même dure quelques secondes. Procédure 1 : 1 prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le cobaye (durée totale de la procédure : 30 minutes). Procédure 2 : 1 inoculation intranasale de virus grippal sous anesthésie générale (30 minutes), prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le furet (30 minutes) (durée totale de la procédure : 14 jours). Procédure 3 : 3 injections en sous-cutané scapulaire (30 minutes par injection) + 2 injections en intra-veineuse d’antigène polio (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le lapin (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours). Procédure 4 : 4 injections en intra-veineuse d’antigène Dengue (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le lapin (30 minutes) (durée totale de la procédure : 42 jours). Procédure 5 : 3 injections intra-musculaire et sous-cutané d’antigène Vi (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le lapin (30 minutes) (durée totale de la procédure : 56 jours). Procédure 6 : 2 injections en sous-cutané scapulaire d’antigène Vi (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez la souris (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours). Procédure 7 : 2 injections en sous-cutané scapulaire d’une solution d’anatoxine pertussis purifiée adsorbée (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez la souris (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours). Procédure 8 : 1 injection en sous-cutané scapulaire vaccin pertussis acellulaire (30 minutes) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez la souris (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours).
Impact sur les animaux
La production de réactifs d’origine animale consiste en un prélèvement de sang terminal chez le cobaye, sous anesthésie générale. Aucune douleur n’est infligée aux animaux. La production d’anticorps contre différents antigènes peut nécessiter l’utilisation d’adjuvant, afin d’optimiser la réponse immunitaire de l’animal, et ainsi, utiliser le moins possible d’animaux. Ce composant peut entrainer des réactions de type allergique ou des réactions locales aux sites d’injection. Le degré de gravité peut être sévère lorsque l’animal subit ces réactions locales (douleur au point d’injection avec altération de l’état général). La prise en charge de ces réactions se fait sous la supervision du vétérinaire et inclut l’usage d’analgésique afin de réduire cet impact.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet ne peuvent être ni replacés, ni réutilisés, ni adoptés pour le 2 raisons suivantes : • Pour des raisons HSE, l’injection d’un agent pathogène ne permet pas d’envisager la sortie de ces animaux des animaleries. • Les 8 procédures de ce projet ont pour but de récolter un volume maximal de sang ou de sérum sur les animaux utilisés, et ainsi utiliser le moins possible d’animaux pour la production de ces réactifs.
Remplacement
L’utilisation des réactifs d’origine animale décrits dans ce projet est obligatoire: 1/ Absence d’alternative in vitro et utilisation préconisée dans la réglementation : a/ Cas des globules rouges de cobayes - préconisations : o par l’Organisation Mondiale pour la Santé dans les rapports techniques (TRS) pour la recherche de virus hémadsorbants. Par exemple :TRS 910 sur le vaccin poliomyélite inactivé. o Par la Pharmacopée européenne. Exemple : la monographie générale (2.6.16) « Virus hémadsorbants » qui s’applique à ne nombreux vaccins. b/ Cas du sérum de furet – exigence de l’Agence Européenne du Médicament pour les vaccins antigrippaux. EMA/CHMP/BWP/426390/2017 Questions and answers on the Haemagglutination Inhibition (HI) test for qualification of influenza vaccine (inactivated) seed preparations 2/ Absence d’alternative in vitro disponible adaptée à l’utilisation visée (cas des autres anticorps polyclonaux) : Ces réactifs sont utilisés à des fins de séroneutralisation ou de dosages immunochimiques in vitro (exemple : ELISA). Nous travaillons sur les alternatives possibles (exemples : ligands alternatifs et combinaison de plusieurs anticorps monoclonaux). Pour les réactifs concernés dans ce projet, la solution de remplacement n’est pas encore disponible car il est nécessaire d’obtenir une performance au moins équivalente au réactif actuel pour valider la nouvelle méthode.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est calculé au plus juste de façon à répondre aux besoins de tests sur la période (quantité de réactifs). Ce calcul tient compte des durées de péremption des réactifs d’origine animale produits mais aussi des évolutions technologiques pour les tests considérés et des perspectives de marché pour les vaccins produits. Des études de prolongation des durées de péremption ont permis d’étendre la durée d’utilisation des réactifs.
Raffinement
Pour les procédures ou d’effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures. Souris : Elles sont hébergées en groupe dans des cages avec litière contenant plusieurs enrichissements : des plateformes anti-noyades, des dome-home (abris en carton) pour créer des barrières visuelles, des neslets (carrés de coton) utilisés pour la nidification. Cobayes : Ils sont hébergés en groupe dans des cages contenant plusieurs enrichissements : des buchettes en bois à ronger, des huttes pour créer des barrières visuelles, du foin de Crau pour compléter leur alimentation. Lapins : Le projet est en cours d’améliorer l’enrichissement de l’environnement avec hébergement en groupe supérieur à deux individus, sur litière, avec plusieurs enrichissements à disposition : du foin frais pour compléter leur alimentation, des jeux type balles. Procédure n°3 : Production d’antisérum polio sur lapins gradée sévère : mise au point d’un scoring de la douleur et des points limites associés, pour la prochaine campagne de production. Furets : Les furets sont hébergés en binôme, sur litière dans des enclos au sol, avec parois transparentes. Plusieurs enrichissements sont à leur disposition : des hamacs, des jeux de cachette, des balles, des abris en inox pour s’isoler… Un temps de jeux et d’échanges avec les techniciens en charge du soin de l’espèce est prévu quotidiennement. Pour chacune de ces espèces, des récompenses alimentaires (graines et fruits secs) leur sont distribuées après un acte jugé stressant ou douloureux.
Choix des espèces
Souris : La souris est un modèle qui permet la production d’anticorps en faible quantité. Il s’agit d’une espèce facile à héberger, y compris en confinement (à la différence des grandes espèces) lorsque les antigènes utilisés nécessitent ce type d’hébergement. Il s’agit d’une espèce pour laquelle les signes cliniques locaux sont peu fréquents après immunisation. Cobaye Pour la fourniture des globules rouges l’espèce cobaye est expressément mentionnée dans les textes règlementaires. Le test a été validé avec cette espèce. Lapin : Le lapin est utilisé fréquemment pour la production d’anticorps. Il s’agit d’une espèce facile à héberger, y compris en confinement (à la différence des grandes espèces) lorsque les antigènes utilisés nécessitent ce type d’hébergement. Son gabarit permet de recueillir un volume de sérum important ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin, son système immunitaire répond activement aux protocoles d’immunisation. Furet : Le furet est utilisé pour la fabrication des anticorps grippe. Cette espèce est très sensible au virus grippal et produit des anticorps séroneutralisants, à la différence des autres espèces habituellement utilisées en expérimentation animale.
Préparation de fractions microsomales de foies ou de reins de rongeurs
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 270
180 souris et 270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un inducteur d'enzymes, puis leur foie ou leurs reins sont prélevés sous anesthésie mais sans analgésie, le porteur jugeant l'absence d'analgésique "indispensable" pour éviter des interférences avec le produit. Ces organes servent à fabriquer le S9, un réactif utilisé dans les tests réglementaires de génotoxicité. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'équivalent de synthèse au S9 et que les animaux ne sont traités qu'en fin de stock.
Objectifs
Des tests reglementaires réalisés sur cellules et bactéries en culture, requis pour évaluer le potentiel génotoxique de produits en développement avant leur mise sur le marché, nécessitent l'utilisation d'un système biologique permettant de mimer les phénomènes de métabolisation par le foie ou le rein. Ce système est appelé S9. Il est fabriqué à partir de foies ou reins prélevés chez le rongeur (rat ou souris) après administration unique d'un activateur pour produire les enzymes du métabolisme et permet au laboratoire de constituer des stocks qui seront utilisés dans les tests reglementaires.
Bénéfices attendus
L'iutlisation de S9 dans les études réglementaires est obligatoire. La préparation de S9 permet permet de générer des stocks qui seront utilisés dans de telles études.
Procédures
Le produit n'est administré qu'une fois à des lots d'animaux (6 lots de 6 animaux chacun, rat ou souris) par voie intrapéritonéale. La substance n’a qu’une incidence légère sur l’animal (il s'agit d'une substances induisant la production d'enzymes du métabolisme) et les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Les animaux sont exposés au produit 5 jours avant prélèvement sous anesthésie des foie ou reins qui serviront à la fabrication du S9. les animaux sont mis à mort au moment du prélèvement des organes.
Impact sur les animaux
Nuisance légère: injection unique par voie intrapéritonéale: les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au point d'injection. Nuisance légère: stress de l'anésthésie. Nuisance sévère: retrait du sang et prélèvement des organes sur animal anesthésié sans analgésie (indispensable pour éviter des interférences lors de l’utilisation du produit)
Devenir
Le foie ou les reins sont prélévés sur animaux anésthésiés pour préparer le S9. Les animaux sont donc mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Le S9 est une fraction de foie ou de rein servant de système d’activation métabolique pour les tests réglementaires in vitro qui sont requis pour évaluer le potentiel génotoxique des produits testés au laboratoire (médicaments, produits chimiques…), et établir les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités compétentes. Le S9 de rat/souris est le plus communément utilisé dans les études réglementaires et recommandé par les lignes directrices de l'OCDE des protocoles qui utilisent le S9. Il n'existe pas d'équivalent de synthèse (chimique par exemple) au S9 qui est alors fabriqué à partir de foie et/ou reins de rongeurs. La préparation de S9 permet au laboratoire de générer des stock qui seront utilisés dans les tests reglementaires.
Réduction
Le traitement d'animaux pour générer des stocks de S9 n'est réalisé qu'une fois le stock sur le point d'être épuisé afin que des animaux n'aient pas été mis à mort inutilement. Une estimation du stock nécessaire est faite avant toute mise en place de la procédure afin de traiter le minimum d'animaux possible
Raffinement
Les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Le traitement de nouveaux animaux pour générer le S9 n'est prévu qu'en fin de stock. La substance administrée n’induit pas de stress ou de douleur. Cependant, après traitement, un suivi comportemental et clinique est effectué. Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) fait l'objet d'une mise à mort. Pour retirer le sang et prélever les organes l'animal est anesthésié et il n'est pas possible d'utiliser un analgésique pour éviter les interférences quand le produit sera utilisé.
Choix des espèces
Le S9 de rat/souris est le plus communément utilisé dans les études réglementaires et recommandé par les lignes directrices des protocoles qui utilisent le S9. Au maximum, 90 animaux sont utilisés par an (54 rats, 36 souris) soit 450 animaux (270 rats, 180 souris) sur 5 années d’autorisation de projet. La préparation est décrite dans de nombreuses publications qui stipulent ques les animaux doivent être traités à l'âge de 5 à 10 semaines
Production d’anticorps glyco-humanisés porcins anti-cellules tumorales
- Production de routine
- Tests réglementaires
320 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est immunisé de façon répétée puis subit des prélèvements de sang portant sur plus de 10 % du volume sanguin sans reconstitution, avant une exsanguination finale sous anesthésie pour récolter le sérum. Le porteur indique maintenir les animaux en vie de 11 à 24 mois pour produire ces anticorps destinés à la transplantation et à la cancérologie. Il justifie le choix du porc par le volume de sérum récolté, un animal remplaçant selon lui plus de cent "petits animaux".
Objectifs
L'objectif de ce programme est de produire des anticorps polyclonaux glyco-humanisés porcins anti-cellules tumorales, pour des applications de développement clinique en transplantation et en cancérologie. Cette saisine est un amendement à l’autorisation APAFIS dans le but d’optimiser le protocole d’immunisation avec notamment la recherche de la meilleure voie d’administration.
Bénéfices attendus
Contrairement à d’autres espèces animales, l’être humain et certains primates non humains n’expriment pas les enzymes alpha-1,3-galactosyl-transférase (GGTA1) et cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), responsables respectivement de la synthèse de motifs alpha 1,3-galactose (Gal) et acide N-glycolyl-neuraminique (Neu5Gc) à la surface cellulaire. Il existe naturellement chez l’homme des anticorps dirigés contre ces xéno-antigènes Gal et Neu5Gc. Ainsi l’administration d’anticorps d’origine animale entraine habituellement l’apparition d’effets délétères (maladie sérique et allergie) du fait de la présence de ces xéno-antigènes. Nous avons développé une plate-forme de sérothérapie passive originale permettant la production d’anticorps polyclonaux glyco-humanisés (GH-pAb), issus d’animaux modifiés génétiquement, knock-out pour GGTA1 et CMAH. Nos anticorps polyclonaux glyco-humanisés présentent un certain nombre d’avantages : 1- une absence d’effets xénogéniques délétères (allergies et maladie sérique), 2- une efficacité lytique accrue vis-à-vis des cellules ciblées, 3- une activité anti-inflammatoire. 4- une spécificité démontrée par une série d’analyses histologiques sur tissus humains.
Procédures
Prélèvements de sang sous tranquillisation (animaux à moins de 120 kg de poids vif) sur 25% des animaux (catégorie des porcs entre 70- 120 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation et - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, soit un total de 15 minutes / porc. Prélèvements de sang sur des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse. Immunisations des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse sur 75% des animaux (catégorie des porcs entre 120 - 200 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation avec une anesthésie gazeuse a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation ; - 10 minutes pour l’administration injectable de l’anesthésique et le branchement de masque pour l’anesthésie gazeuse - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, - 10 minutes de réveil soit un total de 35 minutes / porc. *Il est à noter que plusieurs animaux peuvent être manipulés en même temps (5 porcs par équipe de 3 techniciens). Les temps pris par les procédures vont s’intercaler ce qui permet aux opérateurs de réduire le temps global des procédures.
Impact sur les animaux
Les nuisances provoquées par les prélèvements ou les vaccinations sont inclues dans la catégorie modérée selon la référence : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;
Devenir
A la fin du programme d’immunisation, une exsanguination finale (euthanasie) sera effectuée sous anesthésie profonde afin de collecter le maximum de sérum hyper-immun qui sera ensuite utilisé pour la production de substance médicamenteuse. L'euthanasie des animaux sera effectuée à la fin du programme ou en cas de développement d’une non-réponse aux vaccinations par surdose d'anesthésie ou par un euthanasiant.
Remplacement
Plusieurs laboratoires ont cherché à remplacer la production d’anticorps polyclonaux (pAbs) à partir d’animaux donneurs par une production in vitro, recréée en bioréacteur à partir de l’information génétique extraite des donneurs et triée par phage-display. Cependant, malgré plus d’une décennie de R&D, les systèmes de production de pAbs in vitro n’ont pas permis d’atteindre les rendements requis pour la production de lots cliniques. En outre, ce type d’anticorps n’est pas disponible actuellement en Europe et ne pourrait pas couvrir les besoins des patients européens. De plus, le remplacement des pAbs rendant actuellement des services thérapeutiques essentiels (existant principalement dans les domaines de l’envenimation, de la transplantation et de l’anémie aplastique sévère) par des produits obtenus in vitro nécessiterait un développement complet, passant par une nouvelle recherche pré-clinique (chez l’animal) et clinique, chez des patients qui pourraient être aussi privés du traitement incluant de nouvelles phases 1, 2 et 3. Il s’agit typiquement d’un travail prenant plusieurs années (de quelques années à 10 ans).
Réduction
Le choix du porc comme espèce pour l’immunisation nous permet de réduire le nombre d’animaux vaccinés par rapport à d’autres espèces habituellement utilisées (comme le petits animaux), du fait du volume important de sérum pouvant être collecté sur un animal dans le respect des règles éthique. Un porc peut ainsi produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux. Aucun test statistique ne soutient cette comparaison qui est évidente à l’ égard de la différence de taille entre ces espèces (un porc pesant en moyenne 110 Kg). En outre, le porc est maintenu en vie pendant une période de 11 à 24 mois, alors que les protocoles de prélèvement de sérum sur petit animal comprennent en général une à 2 prises de sang avant mise à mort par exsanguination. Ces 2 facteurs justifient les différences importantes dans le nombre d'animaux nécessaires pour collecter une quantité identique de sérum, lorsque des porcs sont choisis et non des petits animaux (tels que des lapins). En outre, dans cette étude nous souhaitons optimiser le protocole d’immunisations des animaux. C’est pour cette raison que nous réalisons cet amendement. L’objectif de ce protocole est d’induire une meilleure réponse immune humorale par rapport aux protocoles précédemment utilisés, en améliorant l’utilisation des adjuvants, la quantité d’antigène injectée et les voies d’injection. Obtenir un protocole optimisé nous permettra d’obtenir une meilleure réponse humorale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de doses thérapeutiques d’anticorps.
Raffinement
Les conditions d’hébergement, l’enrichissement, les procédures de renforcement positif (jus de pomme) et le suivi des animaux par les animaliers et le vétérinaire, ainsi que les procédures analgésiques sont mises en place pour prévenir la douleur, et respecter le bien-être animal. Les animaux vont profiter de plusieurs éléments de matériaux manipulables pour pouvoir manifester leur comportement naturel de fouissement, de recherche de nourriture et environnemental. Les animaux dans le bâtiment spécialisé porc doté d’une climatisation et chauffage spécifique pour chaque catégorie, vont bénéficier de l’accès à la paille dans des nourrisseurs spécifiques pour compléter l’apport des fibres nécessaires en plus de la nourriture et avoir la possibilité de manifester leur capacité de fouissement. Plusieurs jouets vont être rajoutés dans les cases de chaque catégorie : brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc mâchonnables spécifiques pour le porc. Un arbuste dans un pot va compléter l’environnement de chaque salle des animaux en procédure. Au cours de la semaine de la mise-bas, les truies et les cochettes vont recevoir des matériaux de nidification en quantité suffisante (sacs de jute, journaux, sciure de bois) pour le calme des animaux et l’amélioration des mises bas. Les truies et les cochettes vont mettre bas dans des cages spécifiques « liberté » qui permettent de bloquer les truies pendant les 72 h autour de la mise bas pour éviter l’écrasement des porcelets. Ensuite les animaux vont être libérés et avoir la possibilité de bouger dans toute la case de 6.5 m² pour pouvoir s’occuper des leurs porcelets jusqu’au sevrage. L’optimisation du protocole d’immunisation permettra également d’améliorer les conditions d’injections chez les porcs (diminution du nombre et du volume d’injection).
Choix des espèces
Le porc, de par son poids important, permettra de récolter un volume optimisé de sérum sur un nombre plus réduit d’animaux. Ainsi, un animal vacciné dès l’âge de 5 mois, avec une vaccination itérative maintenue pour une période de 11 mois consécutifs, peut produire suffisamment d’anticorps pour soigner de 100 à 1000 patients (en fonction de la dose administrée dans les indication de Transplantation ou d’oncologie). Les porcelets sont élevés puis immunisés à partir d’un minimum de 6 semaines d’âge (> 20Kg). Les sérums hyper-immuns seront prélevés sur des porcs par prises de sang répétées 35 jours après la première vaccination dans le respect des normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;
Production d’ascite de souris en vue de l’obtention d’anticorps monoclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
12 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce sont des femelles âgées réformées de l'élevage, qui reçoivent une injection de pristane provoquant une inflammation douloureuse du péritoine, puis un hybridome, pour produire un liquide d'ascite riche en anticorps destinés à des tests de diagnostic du D-Dimère. Le porteur indique que les animaux ne restent que 24 heures en état ascitique avant mise à mort et prélèvement. Il affirme que 83 pour cent des anticorps ont été transposés in vitro mais qu'un clone doit encore être produit sur souris, en invoquant aussi la "souveraineté nationale".
Objectifs
Le D-Dimère est un marqueur biologique de la formation et de la dégradation de la Fibrine, qui peut être mesuré sur sang total ou dans le plasma. Le D-Dimère a été largement étudié pour le diagnostic de la maladie thromboembolique veineuse (VTE), et est utilisé en routine pour cette indication. Il a également été évalué pour déterminer la durée optimale du traitement anticoagulant chez les patients souffrant de VTE, pour le diagnostic et le suivi de la CIVD (Coagulation lntraVasculaire Disséminée), ainsi que pour l'identification des patients à haut risque de VTE. Donc, la quantification du taux en D-Dimères joue un rôle important dans les décisions thérapeutiques. En France grâce à ces tests, ce sont près de 50000 à 100000 cas de phlébite qui peuvent être dépistés et traités par an. Plus récemment, il a été démontré que les patients infectés par la COVID-19, et présentant une forme grave de la maladie, présentaient un état de profonde inflammation conduisant à des taux élevés de complications thrombotiques comme la Thrombose Veineuse Profonde (DVT), l'Embolie Pulmonaire (PE), et la thrombose microvasculaire. Le marqueur le plus typique chez les patients avec COVID-19 et coagulopathie est une élévation de la concentration en D-Dimères. Ces trousses de diagnostics sont des kits I.V.D (In Vitro Diagnostic) enregistrés officiellement et marqués CE sous la réglementation « ISO 9001-2008 » et « 13485 ». Certains sont également FDA Approved. Les clones ont été développés et sélectionnés pour leurs spécificités et leurs rendements il y a plus de 25 ans. Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production d’une quantité suffisante d’ascite à une concentration importante d’anticorps monoclonaux, de qualité, afin de pourvoir les quantités nécessaires à la confection des kits de dépistage des pathologies recherchées, et ce afin de limiter le nombre de souris utilisées. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages de D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines.
Procédures
2 inoculation sous cutanée de buprénorphine sur animal vigile : 5 sec/animal Inoculation intrapéritonéale de pristane sur animal vigile : 2.5 sec/animal Inoculation hybridome sur animal vigile : 2.5 sec/animal Aucun prélèvement sur animal vigile
Impact sur les animaux
Aujourd’hui la production de ces anticorps sur ascite de souris, est réalisé ans des établissements européens et français selon le protocole préconisé par la CNREEA. L’injection d’adjuvant de type pristane (huile) provoque une inflammation du péritoine et active le système immunitaire. Cette inflammation est douloureuse dans les premières heures après l’injection. Afin de diminuer cette douleur et pour que l’animal récupère plus rapidement, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) préalable à celle du pristane est réalisée. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Les animaux sont donc observés et reçoivent une seconde injection de buprénorphine 4 heures après la première. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avant le prélèvement.
Remplacement
Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Malheureusement, la production en bioréacteur pour les différents clones, dont cette DAP fait objet, a modifié certaines caractéristiques de l'anticorps pour un clone et ne permet pas, à ce jour, de valider l'équivalence entre l'anticorps monoclonal "in vitro" et l'anticorps monoclonal "in vivo". Cette perte de qualité n’est pas acceptable ni autorisée par les autorités compétentes en raison du marquage CE et de la finalité diagnostic des produits. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies. Ces productions sont également réalisées dans des pays hors Union européenne, capables de produire la totalité des volumes nécessaires qui pourraient ainsi faire perdre en partie la souveraineté nationale et européenne ainsi que le contrôle du bien-être animal propre à la CNREEA.
Réduction
Le clone de cellules est sélectionné afin d’obtenir un volume d’ascite important à une concentration importante en anticorps dans le but de limiter le nombre de souris. La quantité d’ascite produite est en moyenne de 2.8mL/souris. Les animaux utilisés sont des souris anciennes qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Raffinement
Les souris sont hébergées sur un lit de sciure avec des enrichissements de type lanières de cartons et tunnels afin qu’elles puissent se cacher, créer un nid afin de répondre à leurs besoins physiologiques. Elles sont soignées quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation A tout moment l’opérateur peut décider de l’arrêt du protocole s’il juge que l’animal est en détresse. Pour diminuer la douleur liée à l’inflammation provoquer par l’adjuvant, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) est effectuée avant et après l’adjuvant. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité. La raison de l’utilisation de la buprénorphine est bibliographique. En effet il s’agit de l’anti-douleur préconisé dans cette production. Plusieurs essais d’optimisations ont été apportées : - Essais avec des AINS (Anti-inflammatoire Non Stéroïdien) n’ont pas été concluants et n’ont pas montrés une amélioration significative de l’état de l’animal car ce qui est recherché par l’injection de l’adjuvant, est une inflammation du péritoine et une activation du système immunitaire de manière à obtenir une grande quantité d’anticorps. - Essais menés pour éviter la manipulation et l’injection de buprénorphine aux souris : des gels aromatisés contenant un morphinique ont été placés dans la cage des souris ou dans l’eau des biberons. Ces deux essais n’ont pas été concluants car ils ne garantissaient pas que toutes les souris étaient correctement traitées avec l’anti-douleur : certaines étant sous-dosées et d’autres à l’inverse sur-dosées. Les souris sont mirées quotidiennement. Dès lors qu’une réaction est détectée par mirage de l’abdomen l’ascite de la souris est prélevée sur animal mort. Cette façon d’opérer permet aux animaux de ne rester que 24 heures en état ascitique et limiter la mortalité du fait d’une production exponentielle d’ascite. Des points limites prédictifs sont mis en place suivant une grille de scoring.
Choix des espèces
La souris est l’animal idéal pour la production d'anticorps monoclonaux et est, de ce fait, l'animal le plus utilisé. La souche utilisée est la lignée de souris consanguine BALBc, sur laquelle ont été développés tous les essais liés aux techniques d’obtention d’anticorps monoclonaux . Cette lignée permet d’obtenir un volume plus important d’ascite avec une concentration en anticorps supérieurs aux autres souches de souris. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes. Elle produit des volumes satisfaisants d’antisérum présentant un titre élevé et une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines. Les animaux utilisés sont des souris BALBc femelles, anciennes reproductrices réformées chez l’éleveur. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure( multiplié par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Production liquide d’ascite (produit dérivé)
- Production de routine
- Tests réglementaires
4800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules dans le péritoine, qui provoque une production de liquide d'ascite et un gonflement de l'abdomen surveillé chaque jour, le liquide étant récolté après mise à mort. Ce liquide d'ascite entre dans la fabrication de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. Le porteur indique que cette cellule ne peut à ce jour être conservée qu'in vivo et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".
Objectifs
La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.
Bénéfices attendus
Cette ascite issue de la multiplication d'une cellule qui est utilisé directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité des tests.
Procédures
Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.
Impact sur les animaux
La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne et une cotation est réalisée chaque jour afin d'évaluer la douleur engendrée par ce geste.
Devenir
Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, Le liquide d'ascite est récolté post mortem.
Remplacement
La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.
Réduction
La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé du fait de l'origines des cellules à multiplier Pour cette application, nous utilisons des animaux matures âgées à minima de 8semaines.
Nourrissage de tiques dures sur vertébrés pour élevage en laboratoire
- Conservation des espèces
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Tests réglementaires
Chèvres : 8
31 animaux non-humains, 23 lapins et 8 chèvres, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun tué à l'issue. Rasés puis équipés de sacs de tissu contenant des tiques, fixés sur les oreilles des chèvres ou le dos des lapins, ils sont utilisés pour nourrir ces tiques et entretenir des colonies de laboratoire. Le porteur affirme que la salive des tiques est analgésique et que les animaux ne souffrent pas, tout en signalant des croûtes, des rougeurs quand les lapins arrachent les sacs et, chez une chèvre, une réaction œdémateuse de l'oreille. Il présente le gorgement artificiel sur membrane comme encore "difficile" à généraliser, et prévoit de replacer les chèvres dans une ferme pédagogique et les lapins via une association.
Objectifs
Le présent projet vise au maintien des colonies de tiques non infectées sur des animaux sains au sein de notre établissement afin de poursuivre les études entamées depuis 2018. L’élevage des deux espèces de tiques entretenues en insectarium a comme objectif premier de mieux comprendre leurs traits de vie (éléments extérieurs qui influencent le cycle de vie de la tique comme par exemple la température et l’hygrométrie) pour déterminer les contraintes présidant à son installation dans une zone géographique donnée et d’optimiser sa surveillance. Les tiques sont connues pour leur capacité à transmettre des agents pathogènes comme celui responsable de la maladie de Lyme. Le fait de disposer de tiques exemptes de pathogènes permet d’étudier ex vivo leur capacité à acquérir, maintenir et transmettre de nouveaux pathogènes ce qui démontre expérimentalement son rôle de vecteur. Par exemple, Rhipicephalus bursa, tique méditerranéenne, a été élevée afin de déterminer sa capacité à transmettre un virus nouvellement installé en Europe, le poxvirus responsable de la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine. Il est également possible de purifier la salive des tiques pour étudier son rôle dans la modulation de la réponse immunitaire de l’hôte, afin d’identifier des biomarqueurs permettant de développer des tests d’exposition à la piqûre de tiques, surtout si l’on rate sa détection sur un hôte infesté, homme ou animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les besoins de la tique, d’identifier son milieu de vie optimal (niche écologique), ses capacités de dissémination et d’aider à la mise au point de méthodes de lutte efficaces. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un nombre suffisant de tiques à étudier au laboratoire, ce que seul le maintien des colonies de tiques sur animaux permet aujourd’hui. Le projet vise également à développer et optimiser le gorgement artificiel (nourrissage des tiques sur des membranes synthétiques contenant du sang), pour d’abord comprendre les déterminants critiques au nourrissage des tiques et découvrir de nouvelles pistes de lutte contre elles, et d’autre part, un jour, s’affranchir des animaux pour la production de colonies de tiques. De plus, le gorgement artificiel des tiques reste indispensable à la réalisation des études sur leur capacité à acquérir et maintenir des agents pathogènes à partir du sang infecté, sans l’utilisation d’infections expérimentales sur animaux. Ce volet est important pour mieux évaluer les risques sanitaires liés à la présence de quelles espèces de tiques.
Procédures
Les animaux ne sont soumis qu'aux gorgements des tiques. Aucun autre prélèvement n'est partiqué.
Impact sur les animaux
Les animaux ne souffrent pas de la présence des tiques : il est en effet connu que leur salive contient des substances analgésiques ce qui leur permet (dans la nature comme en élevage) de rester en place pendant des semaines sans être éliminées par leur hôte. Avant toute installation de sac de tissu contenant des tiques, les animaux (chèvres ou lapins) sont rasés dans la zone où les sacs seront positionnés. Le rasage des poils ne présente pas de gêne à l’animal. La seule gêne à proprement parlé est occasionnée pour les animaux par les sacs hermétiques positionnés sur les oreilles (chèvres) ou sur le dos (lapins). Aucun développement de l’immunité vis-à-vis des tiques n’est apparu parmi les animaux utilisés. Néanmoins, il peut apparaitre parfois quelques croûtes, qui disparaissent rapidement, au niveau du site de fixation des tiques (dos des lapins, oreilles des chèvres). Quand les lapins arrachent les sacs installés sur leur dos, il arrive également que la peau soit rougie. Une des chèvres a manifesté à deux ou trois reprises en 5 ans une réaction œdémateuse et suintante de l’oreille suite à la fixation des tiques. Cette réaction, qui entraîne la mort des tiques, a disparu en quelques jours.
Devenir
Les chèvres seront replacées dans une ferme pédagogique pour une retraite paisible. Les lapins seront replacés chez des particuliers via une association type white rabbit.
Remplacement
Il est difficile de remplacer complètement le nourrissage de tiques sur animaux de laboratoire. Néanmoins, des essais d’alimentation artificielle de tiques sont déjà en cours et vont se poursuivre, en s’appuyant sur l’expérience d’autres équipes travaillant sur ce sujet dans le monde. Il a été possible de gorger des tiques adultes H. marginatum grâce à un dispositif artificiel. Les performances sont légèrement moins bonnes que lors de gorgement naturel sur animaux, mais surtout on ne peut obtenir qu’un faible nombre de femelles gorgées simultanément. Il n’a en revanche pas été possible de nourrir des tiques immatures, en partie du fait que cette espèce est une tique à deux hôtes , c’est-à-dire que les larves restent fixées à leur hôte pour se métamorphoser en nymphes, qui s’attachent immédiatement au même endroit : la durée de fixation des tiques immatures est ainsi de 3 à 4 semaines minimum (contre 10-15 jours pour les adultes), durée pendant laquelle il est très compliqué de garder intactes et non contaminées les membranes placées entre le sang et les tiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à l’entretien de nos populations de tiques a été fortement réduit par rapport à ce qui était prévu lors du projet précédent. Dans le présent projet, nous tenons compte de cette réduction importante, permise par l’absence d’immunité et le maintien d’un bon état général des animaux suite à chaque session de gorgement. Néanmoins, une des problématiques est l’âge des lapins et des chèvres qui doivent être renouvelés périodiquement, généralement tous les 4 et 8 ans, respectivement. Le nombre d’animaux nécessaire au projet n’augmente pas mais leur renouvellement est nécessaire pour tenir compte de la durée de vie de l’animal au sein du laboratoire par rapport à sa durée de vie totale.
Raffinement
Les chèvres sont des animaux grégaires. Elles vivent en groupe dans notre animalerie, dans le même box. Les lapins sont transférés en cas de nécessité de la zone d’hébergement, où ils sont gardés dans des cages individuelles, à la zone de production de tiques, dans l’insectarium, où ils sont également maintenus dans des cages individuelles. Celle-ci sont en plexiglas ce qui permet un contact visuel avec les congénères car les sessions de gorgement des tiques concernent toujours 3 ou 4 animaux simultanément. Les cages sont conçues pour réduire les risques d’échappement des tiques, et pour que les animaux puissent se voir. Chaque cage est également équipée d’un abri opaque sous lequel les lapins peuvent se réfugier s’ils le désirent. Ils ont également à disposition des pierres à grignoter, tout comme dans les cages d’hébergement.
Choix des espèces
Les chèvres font partie des hôtes naturels des tiques dures adultes et présentent un format facilement gérable en animalerie. Les lapins font partie des hôtes naturels des stades immatures (larves et nymphes) des tiques Hyalomma et sont plus faciles à maintenir en élevage que les autres hôtes naturels (oiseaux et lièvres). Leur format de plusieurs kilos (4-5 kg) permet des infestations plus importantes, de 500 à 1000 larves, que celles qui pourraient être mises en œuvre avec d’autres animaux, comme les rongeurs, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaire. Leur longue durée de vie est également un atout pour limiter le nombre d’animaux expérimentaux, tout comme leur réutilisation a des fréquences variables, en fonction des besoins des études scientifiques en cours : sessions de gorgement tous les 1-3 mois pour les chèvres, tous les 3-6 mois pour les lapins. Les stades immatures des tiques Rhipicephalus bursa se gorgent normalement sur les mêmes hôtes (ruminants) que les tiques adultes, mais cela ne peut être pratiqué compte tenu du risque d’échappement de ces stades. Ce sont en effet des tiques de très petite taille (quelques millimètres) et leur durée de gorgement est très importante (3 à 4 semaines). Cette longue durée entrainerait des risques accrus de décollage des sacs et de dissémination potentielle des tiques dans les box. Les lapins représentent une alternative applicable aux stades immatures de l’espèce. Chèvres de 1 an car elles s’habitueront plus facilement à l’environnement de l’animalerie. Lapins de 11-13 semaines (2-3 kg) car ils sont adaptés morphologiquement (taille des oreilles), physiologiquement et immunologiquement à la charge parasitaire (tiques) de l’élevage.
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Production d’antigènes de parasite permettant de fabriquer des tests de diagnostic
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Tests réglementaires
6 000 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal est infesté par des larves de schistosome qui pénètrent sa peau lors d'un pataugeage, laissé porter le parasite pendant 49 jours au maximum, puis saigné à mort sous anesthésie pour récolter les vers adultes. Le porteur revendique une infestation indolore et arrête la maturation avant l'apparition des symptômes, mais l'objet du projet reste la production en série d'antigènes pour des tests de diagnostic commercialisés. Il affirme le recours à l'animal comme obligatoire, aucune culture in vitro ne maintenant le cycle du parasite.
Objectifs
La Bilharziose ou schistosomose est une maladie parasitaire humaine, classée seconde après le paludisme. Environ 600 Millions de personnes vivent en zone d’endémie et 200 millions de personnes sont infectés. Le cycle biologique comprend deux hôtes obligatoires : un hôte vertébré et un hôte mollusque vecteur. Les passages entre les hôtes se font grâce à des larves nageantes qui pénètrent par la peau de l’hôte cible. Comme toutes les maladies infectieuses le diagnostic est un élément clef dans le contrôle de l’infection. Dans les pays du Nord les diagnostics directs qui identifient la présence active du parasite prennent peu à peu la place des diagnostics indirects qu’ils soient sérologiques ou parasitologiques. Dans les pays du sud, le développement d’outils de diagnostics direct ne sont pas encore développés et les diagnostics indirects sérologiques sont largement majoritaires. Les diagnostics sérologiques détectent les anticorps présents dans le sang du patient lorsqu’il a été contaminé. Pour ce faire, ces tests incluent des protéines appelés antigènes provenant du parasite, qui vont réagir en présence des anticorps contenus dans le sérum des personnes infectées. Aujourd’hui, il n’existe aucune méthode permettant de maintenir le cycle du parasite in vitro. De plus, les schistosomes sont des organismes trop complexes en termes de diversité antigénique pour être « simplifiés » par un seul antigène synthétique ou même par un cocktail d’antigène synthétique. Dans ce contexte, il est nécessaire de produire des antigènes provenant des deux espèces majeures qui infectent l’être humain, Schistosoma mansoni et Schistosoma haematobium. Les vers adultes ou les œufs du parasite sont extraits à partir de hamsters infectés par des larves de ces pathogènes. Par la suite, des extractions sont effectuées pour isoler les antigènes et les intégrer dans les tests sérologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de récupérer des vers adultes et des œufs des parasites du genre Schistosoma sp. qui permettront de produire des antigènes natifs du parasite. Ces antigènes sont indispensables dans la fabrication de kit de diagnostics médicaux humains.
Procédures
Les rongeurs sont soumis à la phase d'infestation qui se fait de manière naturelle, par pataugeage dans un petit volume d'eau contenant les larves du parasite. Cette étape se fait en une fois et dure une heure. Une fois sous anesthésie les animaux sont soumis à un prélévement sanguin qui conduira à la mort de l'animal.
Impact sur les animaux
L’infestation par les schistosomes provoque une nuisance chronique chez le rongeur par accumulation des œufs notamment dans le foie et les intestins. Les symptômes visuels attendus sur les rongeurs peuvent survenir à partir de deux mois. C’est pourquoi le délai de maturation au cours de ce projet est de 49 jours maximum, afin que les animaux ne subissent pas les symptômes de la parasitose.
Devenir
Le but du projet est de produire des parasites du genre Schistosoma. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites adultes.
Remplacement
Le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire car on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes. De plus, dans les tests sérologiques il n’est pas possible de remplacer la complexité/diversité des protéines natives par une ou plusieurs protéines recombinantes.
Réduction
Expérimentalement les schistosomes infestent : la souris, le hamster et le cobaye. Le hamster est le meilleur hôte, c’est-à-dire celui qui permet de recueillir le plus grand nombre de parasites avec l’utilisation minimale d’individus, sans ressentir aucune souffrance ou mortalité précoce de l’animal. Les schistosomes sont de petits organismes et la quantité nécessaire de vers pour fabriquer les tests de diagnostic justifie l’utilisation de 1200 hamsters par an.
Raffinement
Nous avons fixé le nombre optimal de parasites proposés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de vers sans engendrer de mortalité prématurée de l’animal. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Le protocole a été établi pour éviter tout signe de souffrance ou de stress. L’infestation par pataugeage est la forme d’infestation naturelle chez les rongeurs dans le milieu naturel, elle est indolore. Pendant le développement du parasite dans l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu permettant qu’ils aient des activités ludiques et sociales. Les animaux ne sont jamais seuls dans leurs cages. La mortalité ne survient quasiment jamais à l’issue de l’infestation. Cependant, durant cette période, tout rongeur retrouvé en souffrance, c’est-à-dire ayant atteint les points limites pourra-t-être euthanasié par un personnel habilité.
Choix des espèces
Le hamster a été choisi car cette espèce permet de recueillir le plus grand nombre de parasites avec l’utilisation minimale d’individus, sans ressentir aucune souffrance ou mortalité précoce de l’animal. Les animaux utilisé sont de jeunes adultes de 6-semaines d’âge pour éviter les mortalité lors de l’infestation
Utilisation d’animaux à des fins de production réglementée pour la production de réactifs aviaires utilisés par les laboratoires dans le cadre de contrôles in vitro au moyen de procédures de classe de gravité légère.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Dindes : 50
Autres oiseaux : 100
650 oiseaux, poulets, dindes et canards, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Ils reçoivent une souche infectieuse ou un vaccin, sont suivis jusqu'à quatre mois puis saignés pour produire des sérums de référence destinés à des contrôles in vitro. Le porteur indique que la production de sérum exige de tels volumes de sang que la réutilisation est impossible, d'où l'euthanasie de tous les animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet aujourd'hui de produire ces réactifs.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de produire des réactifs nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider des tests in vitro, tout en satisfaisant aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM). Ces tests permettent de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la mise sur le marché d’un lot de vaccins. Ils sont effectués sur espèce cible. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la réalisation des contrôles in vitro réalisés dans les laboratoires. Ceci permet la mise sur le marché de vaccins qui protègent efficacement les animaux contre les maladies infectieuses, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal en favorisant les méthodes alternatives.
Procédures
Une période d’acclimatation de 2 jours minimum est requise. Les modes opératoires débutent par l’administration à J0 avec possibilité de prélèvement sanguin. Il y a ensuite une phase d’observation quotidienne avec éventuellement jusqu’à 4 rappels en fonction des techniques qui sont appliquées. Un prélèvement final est effectué. La principale substance injectée pour ces tests est : la souche de l’agent infectieux ou un vaccin. La durée des tests dépend du réactif produit et de l’espèce. Les tests durent jusqu’à 4 mois.
Impact sur les animaux
Un léger stress lié aux manipulations et injection des souches virales peut apparaître. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Ces tests garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement
Devenir
La production de sérum nécessite des volumes de sang importants pour les espèces utilisées et ne permet pas la réutilisation de ces animaux. Par conséquent tous les animaux sont tous euthanasiés.
Remplacement
La production de réactifs est actuellement irréalisable sur un modèle in vitro. Il faut passer par le modèle in vivo. Les réactifs produits entrent ensuite dans les contrôles in vitro réalisés permettant la mise sur le marché d’un lot.
Réduction
le nombre d’animaux est directement lié à la quantité de réactifs nécessaires à la réalisation de tests in vitro qui ont été développés afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération d’un lot vaccins
Raffinement
Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les techniciens vérifient l’évolution de l’état général et que les critères généraux d’alarme ne sont pas atteints. En cas de suspicion, ils font appel au vétérinaire désigné présent sur le site. Les protocoles de production de sérums n’induisent normalement pas de souffrances chez l’animal. Il n’y a donc pas de points limites spécifiques et seuls les points limites « génériques » liés aux pathologies concomitantes déclenchant une euthanasie systématique pour raisons éthiques sont appliqués pour ces protocoles. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements ont été mis en place dans les hébergements. Des perchoirs et des nids en cartons sont installés. Le sol est recouvert de litière, ou partiellement de papier gaufré. Des blocs à picorer sont placés chez les poulets et chez les dindes pour éviter le picage et des piscines à canards sont mises en place. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Les réactifs produits sont spécifiques et liés à l’espèce. Les poulets seront âgés d’un jour à onze semaines, les canards d’un jour à six semaines et les dindes à partir d’un jour. Ces stades de développement correspondent à l’âge nécessaire à la production de réactifs.
Utilisation d’animaux à des fins de production réglementée pour la production de principes actifs pour des vaccins destinés aux chiens.
- Production de routine
- Tests réglementaires
20 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque chien subit l'ablation de la rate sous anesthésie pour le rendre sensible au parasite, reçoit une injection intraveineuse de ce parasite, puis est tué pour prélever son sang parasité qui servira à fabriquer un principe actif de vaccin commercial. Le porteur applique des points limites en cas de symptômes et prévoit l'euthanasie dès la parasitémie minimale attendue. Il affirme que le développement du parasite n'est possible que sur l'espèce cible et qu'il n'existe "pas de modèle in vitro alternatif".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’être en adéquation aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) dans la fabrication d’un vaccin commercial. Les tests ont pour but d’effectuer une première amplification in vivo des parasites nécessaires à la constitution du principe actif du vaccin. Ils sont effectués sur espèce cible. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.
Bénéfices attendus
L’avantage est que ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la santé et le confort des animaux de compagnie ainsi que des propriétaires.
Procédures
La première étape est la splénectomie, c’est-à-dire une ablation de la rate. Elle permet de rendre le chien sensible aux parasites. Cette étape se déroule sous anesthésie avec du personnel compétent en chirurgie et un suivi pré et post-opératoire rapproché. Une période de trois semaines minimum est requise entre la splénectomie et l’inoculation du parasite pour fournir le sang parasité nécessaire à la campagne de fabrication des lots de principe actif. Le parasite est injecté par voie intraveineuse au chien. Ensuite, l’animal est suivi quotidiennement. Lors de la phase d’amplification in vivo des parasites, certains animaux peuvent déclencher des symptômes. Dans ce cas, des points limites spécifiques à la pathologie sont appliqués. Dans tous les cas, l’animal est euthanasié dès l’apparition de la parasitémie minimale attendue, associée ou non à la présence de signes cliniques moyens. A la fin de la période, l’animal peut être suivi jusqu’à toutes les quatre heures. En phase terminale, l’euthanasie est pratiquée et le sang parasité est prélevé pour démarrer la phase de multiplication in vitro.
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les animaux peuvent présenter une légère augmentation stress due à l’anesthésie, à l’opération (ablation de la rate) ainsi qu’aux injections et aux manipulations. Lors de l’amplification in vivo des parasites, certains animaux peuvent développer des symptômes qui peuvent induire une douleur. Dans ce cas, des points limites spécifiques à la pathologie sont appliqués.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour récupérer le sang parasité
Remplacement
La production du principe actif de ce vaccin nécessite des parasites. Le développement est possible uniquement sur un modèle in vivo. Toutes les autres étapes de production du vaccin sont effectuées in vitro.
Réduction
La première phase est une amplification in vivo sur 1 chien. Une fois qu’une parasitémie satisfaisante obtenue, une amplification du nombre est possible grâce à une mise en culture in vitro de ces derniers sur plateaux de culture en présence de globules rouges non infectés.
Raffinement
L’ablation de la rate se déroule sous anesthésie, avec du personnel compétent en chirurgie et un suivi pré et post-opératoire rapproché. Lors de la phase d’amplification in vivo des parasites, certains animaux peuvent déclencher des symptômes. Dans ce cas, des points limites spécifiques à la pathologie sont appliqués. Dans tous les cas, l’animal est euthanasié dès l’apparition de la parasitémie minimale attendue, associée ou non à la présence de signes cliniques moyens. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ce choix résulte du fait que c’est l’espèce cible. Le développement des parasites n’est possible que sur l’espèce chien. Les chiens utilisés seront âgés d’au moins 6 mois. Un âge avancé permet de récolter plus de sang et ainsi diminuer le nombre d’animaux nécessaires.