Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-749353)
162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après un gavage initial de norovirus, elles subissent des prélèvements quotidiens de selles pour mesurer la charge virale et le rôle d’une protéine dans la propagation du virus. Le porteur indique que l’infection peut provoquer diarrhée, saignements et perte de poids, une diarrhée de quatre jours ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort par dislocation cervicale. Il précise avoir mené des travaux préalables sur cellules et présente l’étape animale comme une analyse « intégrée » de la réponse immunitaire.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
De nombreuses études suggèrent un rôle important joué par l’autophagie dans la dégradation de divers agents pathogènes. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement de l’autophagie. Nous cherchons maintenant à comprendre comment il parveint à le faire. Ainsi, nous étudions plus précisément le rôle joué par une protéine cellulaire, Smurf1, dans l’evitement de la dégradation.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
À travers l’étude du dialogue moléculaire entre la protéine cellulaire Smurf1 et la capside virale nous cherchons à comprendre comment le norovirus murin parvient à accroître sa survie à l’intérieur de la cellule infectée. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement d’un mécanisme de dégradation. Notre projet nous permettera de mesurer l’impact de l’inactivation génétique de Smurf1 sur la charge virale. Une réduction de celle-ci dans les souris KO ouvriait la voie vers une nouvelle piste thérapeutique pour limiter la propagation des norovirus.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Au début de l’expérience un gavage initial avec du PBS (condition contrôle) ou avec les différentes souches de norovirus sera réalisé. Ensuite, des prélèvements quotidiens de selles seront réalisés pour mesurer la charge virale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Diarrhée, saignements, perte de poids excessive.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de l’expérience les anaimaux seront euthanasiés par dislocation cervicale conformément aux régles éthiques en vigeur sur le sacrifice des animaux lors de procédures expérimentales. De même, au cours de l’expérience, si les points limites définis pour chaque procédure sont atteints pour éviter une détresse et une souffrance excessive des animaux, ils seront également euthanasiés par dislocation cervicale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nos expériences in vitro avec une lignée de macorphage avec Smurf1 transitoirement inactivé, puis celles avec les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris KO vs WT nous ont permis de ne pas utiliser des animaux pour ces expériences prléiminaires. Nos futurs expériences in vivo permetteront de compléter ces études in vitro et de réaliser une analyse intégrée de la réponse immunitaire dans la prise en charge de l’infection norovirale.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 6 souris seront utilisés. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité entre les souris et associant la dispersion des valeurs individuelles intra-groupes et la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes.
3. Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse ainsi que l’impact environnemental, les animaux seront observés quotidiennement par des personnes formées. Un suivi régulier du poids des animaux, de la consommation de nourriture et d’eau et de signe clinique mesurable (respiration…), sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, de perte de sang nous permettant de réaliser un score de sévérité de la maladie, ainsi qu’un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe. Une diarrhée prolongée sur 4 jours, des saignements répétés au delà de 3 jours avec selles sanginolantes et/ou saignements au niveau anal, ainsi qu’une perte de poids supérieur ou égale à 20% du poids initial nous améneront à euthanasier les animaux concernés. Nos expérinces se focaliseront sur les souches virales S99 et MNV-1 qui sont respectivement persistente et aigue. Par ailleurs, nos expériences in vitro montrent des réponses cellulaires (signalisation) différentes entre ces deux souches. Par conséquence nous chercherons à mesurer dans nos expériences in vivo si la pathogénécité de ces deux souches dans nos souris WT et Smurf1 Ko est également différente. La dose virale que nous utiliserons est de 10e7 PFU. Elle a été validée par des expériences précédentes. La durée totale des expériences in vivo n’excédera pas 21 jours. Nos expériences précédentes montrent des effets de l’infection precepetibles entre 7 et 14 jours dans les souris WT. Les effets dans les souris Ko devraient être du même ordre. Le délai de 14 à 21 jours devrait nous permettre de détecter un eventuel décalage dans le temps entre les souris WT et Ko. Les effets de l’infection sont mesurables via une perte de poids progressive accompagnée ou non de diahrrées ou de saignements liée à une activation de l’inflammation intestinale. Ces effets sont résorbés en quelques jours avec la résolution de la phase aigue de l’infection et la prise en charge du virus par le sytème immunitaire inné. Dans le cas contraire, si l’inflammation persiste ou s’aggrave avec un ou plusieurs points limites atteints les animaux concernés seront euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle animal ‘souris’ permet une analyse intégrée de la réponse immunitaire à l’infection norovirale. L’inactivation de Smurf1 nous permettra de comprendre plus particulièrement le rôle joué par celui-ci dans la clearance virale par autophagie. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés entre 6 et 12 semaines. Des expériences in vitro sur des cellules dérivées de souris WT ou KO nous ont permis d’établir cette fourchette d’âge. Les protocoles d’infection peuvent durer jusqu’à 3 semaines.