Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-621092)
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent le parasite de la leishmaniose viscérale par injection dans l’abdomen, un gavage de tamoxifène cinq jours de suite, puis sont tuées à deux mois pour prélever leurs organes. Le porteur indique que l’infection reste asymptomatique jusqu’à cette date et que le tamoxifène fait perdre environ 10 % du poids, repris une semaine plus tard. Il veut établir le rôle des lymphocytes MAIT dans cette maladie et affirme le recours à la souris « inévitable », les données humaines ne permettant pas de trancher in vivo.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le système immunitaire, et notamment les lymphocytes T, jouent un rôle essentiel dans la défense contre les agents pathogènes. Nous étudions une population de lymphocytes T particulièrement abondante chez l’humain, et capable de tuer les cellules infectées par des bactéries grâce à la reconnaissance d’antigènes bactériens. Ces lymphocytes T sont appelés MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells) et représentent des cibles thérapeutiques privilégiées du fait de leur fréquence élevée chez l’humain (1-10% des lymphocytes T du sang, 10-40% dans le foie), leur présence chez tous les individus, leur capacité à répondre très rapidement en cas de stimulation, et la versatilité de leur réponse (production de différents molécules selon le contexte de stimulation). De façon surprenante, une étude a démontré que ces lymphocytes T sont activés chez les patients atteints de leishmaniose viscérale, suggérant que les lymphocytes MAIT pourraient contribuer à la réponse immune anti-parasitaire, une notion non-explorée à ce jour. La leishmaniose est une parasitose vectorielle transmise par la piqûre d’insectes infectés, les phlébotomes. Il existe une vingtaines d’espèces de Leishmania dans le monde, responsables de 1 à 2 millions de cas humains par an dans 98 pays, dont la France. Selon l’espèce, l’infection prend des formes cliniques différentes : leishmaniose cutanée, cutanéo-muqueuse ou viscérale. La leishmaniose viscérale (LV) est mortelle en l’absence de traitement. Après la piqûre infectante, le parasite se multiplie dans les cellules phagocytaires et gagne la moelle osseuse, le foie, la rate, et les ganglions. La LV pose des problèmes thérapeutiques, chez l’homme comme chez le chien. Dans ce projet, nous proposons d’utiliser un modèle murin de LV pour déterminer le rôle des lymphocytes MAIT dans cette pathologie, et pour définir si l’activation des lymphocytes MAIT en cas de LV repose sur la reconnaissance d’antigènes produits par le parasite.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La leishmaniose viscérale (LV) est mortelle en l’absence de traitement et touche 500 000 personnes chaque année. La LV pose des problèmes thérapeutiques, liés soit au coût des médicaments, soit à leur toxicité ou encore à l’émergence de résistances. Il existe donc un besoin de mieux comprendre les mécanismes de résistance, notamment immunitaires, à ce parasite. Ce projet permettra de déterminer de façon définitive et bien contrôlée le rôle d’une population lymphocytaire clef, récemment décrite comme impliquée dans la réponse anti-leishmania chez des patients. En fonction de nos résultats, des études visant à activer ou inhiber les lymphocytes MAIT chez les patients atteints de LV pourraient être envisagée. Le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédures 1 et 2: 1 injection par voie intrapéritonéale (1 minute) sur animaux vigiles. Procédure 3: 1 gavage (1 minute) par jour sur animaux vigiles pendant 5 jours consécutifs, puis 1 injection intrapéritonéale (1 minute) sur animaux vigiles.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances attendues lors de l’administration du parasite par voie intrapéritonéale seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. La leishmaniose viscérale est une infection systémique évoluant sur plusieurs mois chez l’homme comme chez la souris, de façon asymptomatique. Le décès survient tardivement (autour de 6 mois post-infection chez la souris). Aux temps d’observation les plus tardifs de cette étude (euthanasie à J60), nos études précédentes ont montré qu’aucun symptome n’est à craindre, ni aucune altération de la qualité de vie chez les animaux. Suite aux administrations de tamoxifène par gavage, une perte de poids d’environ 10% du poids initial peut se produire. Le poids initial est retrouvé une semaine plus tard.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par PCR ou cytométrie en flux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Une activation des lymphocytes MAIT a été documentée au cours de la leishmaniose viscérale chez l’humain. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces lymphocytes in vivo. Les lymphocytes MAIT ont des propriétés différentes selon le contexte, et peuvent promouvoir ou réduire l’inflammation. A ce stade, il est donc impossible de savoir si l’activation observée chez les patients est associée à un effet clinique bénéfique ou délétère. L’utilisation du modèle Souris, qui est particulièrement bien connu dans le cadre de la leishmaniose viscérale, reste donc inévitable pour établir le rôle des lymphocytes MAIT dans cette pathologie.
2. Réduction
Nous utiliserons un modèle de LV chez la souris. Le modèle a déjà été mis en place et toutes les souris inclues dans le protocole peuvent être étudiées, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part le nombre d’animaux à utiliser a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le projet est conçu en 2 phases et la 3ème procédure ne sera mis en place que si nécessaire, selon les résultats des 2 premières procédures, de façon à réduire le nombre d’animaux au minimum.
3. Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. A noter qu’aux temps d’observation utilisés dans le protocole, l’infection est asymptomatique et ne génère aucune souffrance physique aux animaux, ni aucun signe visible d’infection. La perte de poids possiblement induite par le traitement au tamixifène sera mesurée. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptées à la perte de poids ont été définis.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’espèce dans laquelle les lymphocytes T (notamment les MAIT) ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour reproduire la leishmaniose viscérale humaine, y compris pour l’étude des mécanismes de réponse immunitaire et de la physiopathologie, du fait de l’existence de modèles bien définis et de la parenté génétique avec l’humain. – Les souris seront utilisées à l’âge adulte. – Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.